Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

אנו מודים מכון לואיס-סיגלר על מתקן הליבה רצף גנומיקה אינטגרטיבית ב אוניברסיטת פרינסטון עצות טכניות ועל הכנה ספריית ה-RNA ורצף. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאוניברסיטת רוואן ו NIH NIGMS R15GM113187 M.J.H.

1. גרימת היפוקסיה
<ol><li>יום אחד או יותר לפני הקורס זמן היפוקסיה: הכנת החממה, תא הסינון מערכת ואקום, מיכל הדלק, מבחנות, פקקים, צינורות זכוכית, אבובים, כמו שולחן חומרים.</li>
	<li>הנח את N2 טנק, חממה, ואקום ומערכת סינון בסמיכות, כדי לאפשר עיבוד מהיר של תאים.</li>
	<li>הכן סטרילי מדיה YPD נוזלי (1% תמצית שמרים, peptone 2%, 2% גלוקוז) על ידי ערבוב המרכיבים בקבוק זכוכית, autoclaving.</li>
	<li>תכנון הפריסה של מבחנות בחממה. הערה: ממיכל2 N, הבקבוק הראשון תהיה מלכודת מים, הבקבוקון השני תהיה הנקודה בפעם האחרונה, הבקבוק השלישי יהיה נקודת זמן ברגע האחרון וכן הלאה עד הבקבוק האחרון אשר הוא מלכודת מים הסופי. איור 1 מציג את סדר והקשרים בין המבחנות.</li>
	<li>יום לפני זמן הקורס לחסן מושבה שמרים לתוך תרבות של 5 מ ל נוזל YPD בתוך מבחנה סטרילית. באופן ספציפי, להרים מושבה מלא מצלחת באמצעות מקל המוליך סטרילי. מקם את המקל לתוך YPD נוזלי ומנערים את המקל עד רוב התאים ההשעיה.</li>
	<li>לסובב את הצינורות ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה (h ~ 16). הערה: אחרי ה' 16, wildtype תאים ישתפרו רוויה (~ 2 x 108 תאים למ"ל), המצוין על-ידי תרבות מעונן מאוד. זנים אחרים עשויה להימשך זמן רב להגיע רוויה, צריך להיבדק על ידי מדידת ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים, כפי שמצוין בשלב 1.9.4.</li>
	<li>ביום של מסלול הזמן, לאחר 16 h של דגירה, לדלל את התרבות רווי 1:50 על-ידי שימוש של pipet מ למקום 4 מיליליטר לילה תרבות לתוך 196 מ של YPD נוזלי בתוך בקבוקון סטרילי 500 מ"ל. לגדול עם טלטול-~ 200 סל ד במשך 4 שעות ב- 30 ° C. הערה: לאחר 4h, תרבות wildtype תגיע ריכוז יומן אמצע של ~ 1-2 x 107 תאים/מ ל....</li>
	<li>במהלך 4 שעות, תווית המבחנות (ממלכודות היפוקסיה ומים), 50 מ ל אוסף צינורות. אם החממה בשלב 1.7 לעיל אינו בשימוש עבור הקורס זמן היפוקסיה, להפעיל את חממה אחרים ולהגדיר 30 ° C.</li>
	<li>
לפני העמדת תאים היפוקסיה:
	<ol>
<li>להוסיף שתי המבחנות סטרילי 250 מ ל אשר ישמש המלכודות מים ~ 50 מ ל מים.</li>
		<li>ממלאים 1/3 של קרח דלי עם חנקן נוזלי ויציפו מתלה פוליסטירן מוקצף להחזיק 50 מ ל צנטריפוגה צינורות.</li>
		<li>להגדיר את מערכת סינון עבור איסוף תאים. להוסיף דיסק מסנן סטרילי אל יחידת התחתון של מערכת סינון באמצעות פינצטה סטרילי, נזהר רק לגעת קצות התקליטור מסנן. למקם את יחידת מסנן העליון על גבי יחידת התחתון מסנן ולאבטח עם המלחצות מסופק עם המערכת. ודא כי היחידות תחתון ועליון מיושרים, שהוא חותם צר, אין נזילה.</li>
		<li>מודדים את ריכוז תא עם ספקטרופוטומטרים. לדלל תאים כך הם ניתן למדוד טווח ספקטרופוטומטרים-OD600 בין ~0.2 - 0.6, בהתאם ספקטרופוטומטרים ליניארי. הערה: יחידה אחת של600 יתר היא ~ 3 x 107 תאים למ"ל, בהתאם ספקטרופוטומטרים ומורפולוגיה של תא. ריכוז של ~ 1-2 x 107 תאים למ"ל צפוי, המתאים OD600 של ~0.33 - 0.66.</li>
		<li>
להשיג במהירות את דוגמת הזמן 0.
		<ol>
<li>להתחבר למערכת מסנן ואקום חזק (~ 10 mbar) דרך צינורות ואקום מלכודת הבקבוק 1,000 מ. הפעל את שואב האבק. שופכים את התרבות (בדרך כלל ~ 20 מ"ל) לתוך יחידת העליון ולחכות נוזלי להילקח דרך המסנן (~ 10 s, סומך על כוחו של שואב האבק).</li>
			<li>בזהירות הסר את התקליטור מסנן עם פינצטה נקייה ומניחים לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. מיד למקם את צינור צנטריפוגה המדף שקועים חנקן נוזלי. חשוב לציין, לא מראש מקררים הצינורות לפני הוספת המסנן את כל הצינורות תתפוצץ.</li>
			<li>לאחר > 30 s, במקום הצינור בפריזר-80 ° C לחילוץ RNA מאוחר יותר. לאחר כל סינון, לנקות ולהרכיב מערכת סינון. לשטוף את המערכת על ידי משיכת מים 10 s ללא דיסק מסנן. לבסוף, לנגב היבש המערכת עם מגבת נייר.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לדלל את התרבות 4 שעות לתוך מבחנות שונות על הנקודות זמן שונים, כך כל הבקבוק מגיע באמצע יומן ריכוז (~ 1-2 x 107 תאים/mL) בנקודת הזמן המצוין של היפוקסיה. הערה: טבלה 1 מציגה דילולים ששימשו המתח הפלואידי פראי-סוג S288C HAP1+ . מומלץ לבחון כל הזנים בתנאים אלו תרבות ובשפתיים ולהתאים את דילולים בהתאם.</li>
		<li>ברגע תאים ומדיה מתווספים מבחנות, החלף את רדיד האלומיניום המכסה את הבקבוק עם פקק המכיל שני צינורות זכוכית מוכנס.</li>
		<li>הצב המבחנות בחממה בפריסה נקבע קודם לכן.</li>
		<li>להתחבר באופן מאובטח לאורך צינור כמוצג באיור1.</li>
		<li>בדוק כל פקקים יידחפו בחוזקה לתוך הפתחים הבקבוק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בזמן 0, פתח את השסתום הרגולטור. לאחר מכן הגדר את מד זרימה 3 L/min. הערה: מבעבעים יתקיימו בשני בקבוקי מים, המציינת את זרימת הגז המתאים. אם זה לא המקרה, בדוק כי כל פקקים הדוקות אבובים מחובר כראוי.</li>
	<li>סגירת החממה ולהגדיר את מהירות חזק ~ 200 סל"ד. להפעיל טיימר.</li>
	<li>לפני כל נקודת זמן, להגדיר את מערכת הסינון כפי שמתוארות למעלה בשלב 1.9.3.</li>
	<li>
בכל פעם נקודה (למשל, 5 דקות, 10 דקות, וכו '), יש שני אנשים לעבד במהירות את התאים כדלקמן:
	<ol>
<li>האדם הראשון: להסיר את הבקבוק המתאים ממחזיק ולהוציא את הפקק (עם צינורות זכוכית מצורף). הערה: זה לא ישברו את הזרימה של N2 לכל המבחנות תרבות שנותרו אך זמנית ישבור את זרימת למלכודת המים האחרון.</li>
		<li>המשתמש השני: Pipet 1 מ"ל של תרבות ונותנות לתוך cuvette. חבר מחדש את הצנרור מן הבקבוק תרבות זה עכשיו בסוף השורה האחרונה מלכודת מים (שפופרת אחת ווויל פקק אחד ניתן להסיר בתהליך.). לאחר מכן, למדוד ריכוז תא cuvette, כפי שתואר לעיל בשלב 1.9.4.</li>
		<li>האדם הראשון: שופכים את השארית של התרבות לתוך מערכת סינון אבק, ולאחר מכן לבצע הקפאה כמתואר לעיל בשלב 1.9.5 וסינון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר סיום כל נקודות זמן, לכבות את הגז2 N. תחילה סגור הרגולטורים ולא לחכות הלחץ לשחרר, ולאחר מכן כבות מד זרימה. לבסוף, לפרק את המערכת ולנקות כל החומרים עם מים, ולאחר מכן 70% אתנול.</li>
</ol>2. RNA החילוץ
<ol><li>להכין מאגר RLT RNA עמודות טיהור, כפי שמתואר בטבלה חומרים.</li>
	<li>להכין הפתרון עובד של DNase על-ידי הוספת 10 µL של הפתרון מניות DNase µL 70 מאגר לקט לבוא איתך לכל דגימה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>להסיר את הצינורות 50 מ ל המכיל מסנני ותאים מהמקפיא-80 ° C ומניחים על הקרח להפשיר (~ 15 דקות). בצע את השלבים הבאים עם צינורות על קרח.</li>
	<li>תווית 2 mL צינורות כובע בורג ומניחים אותם על קרח, שפופרת אחת עבור כל דגימה. להוסיף ~0.6 מ"ל של חרוזים המחומצנים כל שפופרת, באמצעות צינור microcentrifuge 1.5 mL סקופ ולמדוד את החרוזים.</li>
	<li>להוסיף 0.6 מ"ל של מאגר RLT קר הצינורות 50 מ.</li>
	<li>Pipet למעלה ולמטה כדי להסיר תאים ממסנן והשהה לתוך פתרון. הימנע נותן את המסנן נשארים בתמיסה כפי המסנן לספוג את הפתרון. להסיר כל פתרון נספג את המסנן על-ידי שימוש בקצה pipet לסחוט את המסנן הקיר של הצינור.</li>
	<li>העברה כל הנוזל מהצינור 50 מ ל הצינורות בורג-כיפה המכילה חרוזים.</li>
	<li>למקם את הצינורות בורג-קאפ מהמגן מיל חרוז ולרוץ מין אחד. מיד במקום הצינורות על קרח למשך שלוש דקות. שוב, למקם את הצינורות מהמגן ולרוץ מין אחד.</li>
	<li>הסר את הצינורות מהמגן והמקום בקרח במשך 5 דקות. החרוזים יסדר לתחתית של הצינורות.</li>
	<li>בצע את שאר השלבים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>עם pipet, להעביר רק את lysate (~ 350 µL), הימנעות את החרוזים, אל צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.</li>
	<li>Microcentrifuge למשך 2 דקות מהירות מקסימלית, ואז העברת תגובת שיקוע צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.</li>
	<li>להוסיף נפח 1 של 70% אתנול (ייוצרו מאתנול הוכחה לביולוגיה מולקולרית כיתה 200). מערבבים היטב בעזרת pipetting.</li>
	<li>להעביר את הפתרון וכל precipitate לעמודה ה-RNA הושם בתוך צינור אוסף 2 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 x g , להשליך הזרימה דרך (הנוזל בצינור).</li>
	<li>µL 350 מאגר RW1 להוסיף העמודה. צנטריפוגה 15 s-≥12, 000 גרם x, להשליך הזרימה דרך.</li>
	<li>להוסיף 80 µL DNase אני הדגירה מיקס למוח עמודה (לא לעלות על צידי הצינור) מאפשרים לשבת למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף 350 µL מאגר RW1 עמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g , להשליך הזרימה דרך.</li>
	<li>להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge s-≥12 15, 000 x g ו להשליך זרימה דרך.</li>
	<li>להוסיף 500 µL מאגר RPE העמודה. Microcentrifuge למשך 2 דקות ב≥12, 000 x g.</li>
	<li>בזהירות להסיר את העמודה, למקם את צינור אוסף 2 מ"ל. Microcentrifuge במלוא המהירות עבור 1 דקות (כדי הקרום יבש לחלוטין).</li>
	<li>למחוק את הצינור אוסף ולמקם את העמודה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. להוסיף 30 µL של מים נטולי RNase קרום עמודה.</li>
	<li>Elute את הרנ א מן העמודה על-ידי microcentrifuging עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g. בעת טעינת העמודים לתוך microcentrifuge, ודא שהמכסים של הצינור אוסף פונות לכיוון לצנטריפוגה ספינים, כדי למנוע את המכסים מנתק מגע.</li>
	<li>להוסיף עוד 30 µL של מים נטולי RNase ממברנה עמודה, תוך שמירה על העמודה בצינור microcentrifuge אותו.</li>
	<li>Microcentrifuge עבור 1 דקות ב≥12, 000 x g, כך שאמצעי האחסון eluate הסופי 60 µL.</li>
	<li>לאחסן כל שפופרת 1.5 mL המכיל 60 µL של RNA במקפיא-80 ° C.</li>
</ol>3. קביעת ריכוז ה-RNA ואיכות
<ol><li>למדוד את הריכוז של RNA ו- DNA בכל מדגם ה-RNA, באמצעות fluorometer (a), צבע (b) DNA ו RNA-ספציפי פלורסנט וצינורות assay (ג), כפי שמפורט בטבלה חומרים. בצע את ההוראות של fluorometer ושל הצבעים.</li>
	<li>לחלופין, מודדים את ריכוז חומצת גרעין עם ספקטרופוטומטרים UV שוכן בגובה 260 ננומטר. הערה: קריאת260 A של 1.0 הוא שווה ערך ל RNA חד-גדילי ~ 40 µg/mL.</li>
	<li>מבחן RNA איכות על ידי הפעלת את הרנ א על מנתח מסחרי חומצת גרעין (ראה טבלת חומרים) או על תקן פורמלדהיד/agarose ג'ל 26.</li>
</ol>4. RNA-seq ניתוח
<ol><li>מן המלאי RNA הכולל, לפצות µL 21 של 100 ng/µL RNA במים נטולי RNase. השתמש µL 1 של זו µL 21 כדי לבדוק את ריכוז ה-RNA כמפורט לעיל. שלח את הנותרים 20 µL (2 µg) הכולל רנ א רצף חיצוני מרכז העשרה mRNA, הכנת ספריה ספציפית סטרנד (עם 8 או יותר ברקודים עבור ריבוב) ורצף (ראה טבלת חומרים). לחלופין, לבצע באופן מקומי mRNA העשרה והכנה ספריה, ולאחר מכן לשלוח לספרייה. רצף.</li>
	<li>בריכת 8 או יותר דוגמאות מרובבת ואת רצף בנתיב אחד של ברצף הדור הבא.</li>
	<li>הורד את הקובץ FASTQ המכיל את כל הקריאות רצף וקורא האינדקס המתאים. כמו כן, הורד את קובץ הטקסט המכיל את מולטיפלקס ברקודים. הערה: קריאות אינדקס עשוי להיות נוכח קובץ נפרד FASTQ. מקם את כל הקבצים האלה לתוך ספרייה אחת.</li>
	<li>במקום ה-script של מעטפת שסופק כאן, "fastq_pipeline.sh", באותה ספריה. ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב. הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, איכות התסריט שמקצרת את הקריאות ממפה את הקריאות הגנום, יוצרת קובץ מופרד באמצעות טאב המכיל את מספר קריאות לפי ג'ין עבור כל דגימה.</li>
	<li>להפקיד את FASTQ קבצים ונתונים גולמיים ספירת קריאה לתוך Omnibus ביטוי גנים של NCBI לפני פרסום 27. בצע את ההוראות עבור "Submitting נתונים תפוקה גבוהה רצף גיאוגרפי": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>ייבוא נתוני ספירת קריאה לסביבת סטטיסטי של R ולבצע ניתוח סטטיסטי, שימוש ב- script של R שסופק כאן, "time_course_script. R". ערוך את התסריט הזה לפי הצורך את הניסוי וספריות המחשב. הערה: קובץ script זה מכיל הסברים נרחבים להסביר את הצעדים. בקצרה, קובץ script זה מייבא את הנתונים קריאה, מווסת את הקריאות, מזהה את הגנים לשנות בצורה משמעותית במהלך הזמן, מבצע ניתוח PCA וגרפים את הביטוי של גנים שנבחרו.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing,+homeostasis,+and+disease.">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li><li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes.">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li><li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals:+the+implications+of+physiology+for+cancer.">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li><li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae.">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li><li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li><li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li><li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae:+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response.">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li><li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions:+effects+of+hap1,+rox1,+rox3+and+srb10+deletions.">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li><li>Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae:+differential+response+and+role+of+Msn2+and/or+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media.">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li><li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li><li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor.">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li><li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li><li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response.">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li><li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+proteins,+Spt23p+and+Mga2p,+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator.">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li><li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN/TIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li><li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast.">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li><li>Gaisne, M., B&#233;cam, A. M., Verdi&#232;re, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;natural&amp;#34;+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+(CYP1).">A &amp;#34;natural&amp;#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization.">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+Genome+Database:+the+genomics+resource+of+budding+yeast.">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li><li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li><li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns.">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li><li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li><li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li><li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li><li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains.">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li><li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+RNA.">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=timeClip:+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates.">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, (2014).</li><li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq:+a+statistical+approach.">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה, רמות ה-mRNA של כל הגנים נמדדה במהלך היפוקסיה ב ס cerevisiaeהשמרים. המטרה הייתה לבחון שינויים בביטוי גנים איך כלליים עקב גדילה בסביבה מבוקרת ליד-אנאוקסיים. מספר פעולות נעשו כדי להבטיח כי השיטה המתוארת כאן היה מבוקר ובזהירות לשחזור. ראשית, תאים נחשפו לסביבה ובשפתיים מוגדרים במדויק: 99....

אורגניזמים רבים מגיבים היפוקסיה או O נמוך2, על ידי שינוי גנטי ביטוי 1,2,3. תגובה זו מסייעת להתמודד עם חוסר קריטי עבור נשימה אירובית, כמה תגובות biosynthetic הוחלף נגזר מצע, אלא גם עם מצב חמצון-חיזור המשתנים 4תאים. מספר מחקרים microarray הופיעה cerevisiae ס מראים כי רמות ה-mRNA של מאות גנים שינוי בתגובה היפוקסיה 5,6,-7,-8,-9 , 10 , 11 , 12. לאחרונה, ה-RNA-seq שימש לאפיין שינויים בביטוי הגנים לאורך זמן במהלך היפוקסיה 13. כאן מוצגים הפרטים ניסיוני ודן.
היפוקסיה יכול להיעשות בדרכים שונות, כל אחת לייצר רמה שונה של O2. . הנה, היפוקסיה הוקמה על ידי זורם באופן רציף אולטרא-גבוה-טוהר N2 לתוך מבחנות, אשר מוריד את [O2] התפרקה באופן מיידי עם קינטיקה לשחזור 10. זה אפשרי כי ישנם כמה O2 מולקולות נוכח שתורמים ביטוי חילוף החומרים, ג'ין אבל סביבה זו נחשבת מאוד קרוב אנאירובית. בהיעדר O2, תאי שמרים לא biosynthesize heme, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות 4,12,14. לכן, מחקרים קודמים כללו מטבוליטים אלה כאשר גדל שמרים ללא חמצן 5,10,15. עם זאת, תגובות ובשפתיים רבים הם מתווכת על ידי דלדול של מטבוליטים אלה, ובכך חידוש אותם מפלות 12,16תגובות ביטוי גנים ובשפתיים. כדי לחקות היפוקסיה טבעי, מטבוליטים אלה לא נוספו לכלי התקשורת. בזמן הקצר כי תאים נחשפו היפוקסיה ללא הנוכחות של מטבוליטים חיוניים אלה, היה ללא עלייה ניכרת מוות תאי (נתונים לא מוצג) ולא של מתח ממושך בתגובה 13.
התגובה היא גם תלויה במתח, גנוטיפ שלה. חשוב במיוחד הם אללים של הרגולטורים הידוע של תגובות ובשפתיים 2. רקע המתח S288C רצוי מאוד כך ניתן להשוות תוצאות המחקרים גנומית אחרים עם זן זה. עם זאת, S288C מכיל של אלל אובדן-של-פונקציה חלקית מתוך HAP1 ג'ין 17, הרגולטור תעתיק קריטיים על התגובה ובשפתיים. אלל הזה תוקן ב- S288C באמצעות wildtype העתק מן Σ1278b זן רקע 11.
ביטוי גנים הוא תלוי מאוד הסביבה התאית. לפיכך, בעת ביצוע ניתוח mRNA הגנום כולו, חשוב לשמור על סביבה מתמדת תוך שינוי פרמטר נוסף כגון זמן, גירוי או גנוטיפ. כדי להשיג תוצאות מאוד לשחזור, שקול שיטות עבודה מומלצות שלושה אלה לצורך המחקר ואת כל שלה ביולוגי או טכנית משכפל. קודם כל, experimenter(s) אותו צריך לבצע את המחקר, מאז שיטות טכניות עשויים להשתנות על פני ניסויים. שנית, מאותה אצווה של מרכיבים אמור לשמש בתקשורת צמיחה כמו כל אצווה יש קומפוזיציה שונה במקצת, אשר יכולים להשפיע על ביטוי גנים. שלישית, כדי למזער את ההשפעות מחזור התא, כל נקודת זמן צריכה להכיל תאים אסינכרוני בשלב אמצע יומן של צמיחה (1-2 x 107 תאים/mL).
כאשר אפיון תגובה מורכבים כמו התגובה ביטוי גנים היפוקסיה, קורס זמן הוא יתרון בקביעת את קינטיקה של אירועים שונים. נקודות זמן מסוים צריך להיבחר כי ללכוד את השינויים העיקריים של התגובה. במחקר זה, נצפו נקודות זמן בין 0 ל- 4 שעות, כי ניסויים קודמים חשפו נרחבת שינויים בביטוי הגנים במהלך תקופה זו, 13.
כדי למדוד ביטוי גנים גלובלית, RNA-seq היה בשימוש 18,19. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי כדי לקבוע שפע יחסי התעתיק של ג'ין כל. לעומת ניתוח microarray DNA, RNA-seq תערוכות רגישות גבוהה יותר (כדי לזהות תעתיקים פחות בשפע), טווח דינמי גדול (למדוד שינויים קיפול גדול), הפארמצבטית סופריור (לעקוב במדויק ביטוי גנים לאורך זמן). בדרך כלל, רנ א ביותר הסלולר היא ribosomal RNA שפותחו שיטות רבות להעשרת RNA ספציפיים מינים 20. . פולי-T חרוזים שימשו לטיהור poly-A-המכיל mRNA תעתיקים, למרות השונות מסחרית - ערכות דלדול rRNA זמינים גם יכול להיות יעיל ב- mRNA העשרה.
כאן, התאפיינה התגובה ביטוי cerevisiae ס גנים היפוקסיה. התאים היו חשופים היפוקסיה, ואז לטעום-8 נקודות זמן (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 דקות). כדי לאשר הפארמצבטית וכדי לזהות תעתיקים סטטיסטית שהשתנו, משכפל ביולוגי שלוש בוצעו. RNA היה שחולצו על ידי הפרעה מכנית וטיהור עמודה ולאחר מכן מעובד לניתוח RNA-seq. הצינור שלאחר רצף מתואר, תכנות סקריפטים ניתנים לאפשר שכפול מדויק של הניתוחים שבוצעו. באופן ספציפי, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, את הסביבה סטטיסטי R 24, ו DESeq2 חבילה 25 שימשו כדי לעבד את הנתונים RNA-seq לזיהוי גנים ועוד 607 חסימות לשנות באופן משמעותי במהלך היפוקסיה. ניתוח גורמים ראשיים (PCA), ביטוי גנים של משכפל ציינו את הפארמצבטית של הטכניקה. שירות האשכולות, heatmaps גילה ביטוי נרחב קינטיקה, בעוד מפענוח אונטולוגיה (קדימה) הראה כי תהליכים תאיים רבים, כמו נשימה אירובית, מועשרים בערכה של גנים מוסדר חמצן.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

מתחם שינויים בביטוי הגנים מתווכים בדרך כלל חלק גדול של תגובה תאית. כל הגן עשויים להשתנות הביטוי קינטיקה ייחודי כמו הגן מוסדר על ידי עיתוי מסוים אחד של גירויים רבים, איתות המסלולים או השפעות משניות. כדי לתפוס את הגן כולו ביטוי בתגובה היפוקסיה ב שמרים cerevisiae ס, ניתוח ה-RNA-seq שימש כדי לנטר את רמות ה-mRNA של כל הגנים במועדים ספציפיים לאחר חשיפה היפוקסיה. היפוקסיה הוקמה על ידי גידול תאי גז2 ~ 100% N. חשוב, בניגוד מחקרים אחרים שתקבעו, ergosterol, חומצות שומן בלתי רוויות לא נוספו לכלי התקשורת כי מטבוליטים אלה משפיעים על ביטוי גנים. נקודות זמן נבחרו בטווח של 0 - 4 שעות לאחר היפוקסיה כי תקופה זו לוכדת את השינויים העיקריים בביטוי הגנים. בכל נקודה בזמן, היו תאים ובשפתיים יומן אמצע במהירות מסונן, קפוא, הגבלת החשיפה O2 ו הנלווה שינויים בביטוי הגנים. RNA הכולל היה שחולצו מן התאים, משמש כדי להעשיר את ה-mRNA, אשר לאחר מכן הוסב cDNA. CDNA זו, נוצרו ספריות מולטיפלקס, דגימות 8 או יותר היו וסודרו בנתיב אחד של ברצף הדור הבא. צינור שלאחר רצף מתואר, אשר כוללת חיתוך בסיס איכות, לקרוא מיפוי וקביעת מספר קריאות לכל הגנים. DESeq2 סביבת סטטיסטי של R שימשה לזיהוי גנים לשנות באופן משמעותי בכל אחד של נקודות זמן שתקבעו. ניתוח של משכפל ביולוגי שלושה גילה הפארמצבטית גבוהה, הגנים של קינטיקה שונות ומספר רב של ציפה O2-מוסדר גנים. שיטות אלה שניתן להשתמש כדי ללמוד כיצד התאים של אורגניזמים שונים מגיבים היפוקסיה לאורך זמן ו הותאם ללמוד ביטוי גנים במהלך תגובות אחרים התאית.

מסלול הזמן היפוקסיה וניתוח RNA-seq בוצעו באופן עצמאי שלוש פעמים. כדי לבחון את הפארמצבטית של משכפל שלוש, ג'ין ביטוי נתונים עבור כל הגנים היה נותחה באמצעות ניתוח הרכיב העיקרי (PCA). איור 2 מציג כיצד לשנות הדוגמאות על הרכיבים העיקריים שני הראשונים, אשר ביחד מייצגים...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response at JoVE.com

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K Views.  Rowan School of Osteopathic Medicine. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

Video: Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biochemistry

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

ב Vivo ניטור פעילות שעתוק במהלך מעבר מטבולי באמצעות מדווח ביולומינסנט בשמרים

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biology

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video