Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

Yazarlar, ABD Ulusal Sağlık Enstitülerinden JDA&#39;ya U54 RR022220 ve P50 GM076547 hibe vererek bu çalışmanın desteğini onaylıyorlar. FDM, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinde doktora sonrası bir araştırmacıdır. Destek için ayrıca Lüksemburg Sistem Biyotıp ve Lüksemburg Üniversitesi&#39;ne teşekkür ediyoruz.

1. Agaroz Jel Stok Hazırlama <ol><li> 2 g yüksek saflıkta agaroz tartın. </li><li> Agarozu 500 mL&#39;lik bir şişeye ekleyin ve kombine kütlelerini kaydedin. </li><li> Şişenin hedef kütlesi artı 2 g agaroz 150 g ultra saf su ile hesaplayın, sonra bu hedef kütlenin 0.1 g&#39;ına 150 g ultra saf su ilave edin. </li><li> Şişenin ve agarozun ve suyun kütlesine dikkat edin. </li><li> Şişeyi bir mikrodalga fırına yerleştirin ve agaroz ısıtılırken su buharını en aza indirgemek için şişenin üzerine gevşek bir kapak yerleştirdiğinizden emin olun. </li><li> Şişeyi mikrodalga fırında 15-20 sn&#39;lik bir sürede patlatıp ardından agarozu ve suyu karıştırmak için şişeyi döndürün. Çözelti kaynar ve karışım homojen olana kadar bu işlemi tekrarlayın. DİKKAT: Şişeden kaçan buhar cildi haşlanmadan kaçınmaya özen gösterin. Ayrıca, şişe dokunulacak kadar sıcak olacak ve yaralanmaları önlemek için otoklav eldiveni gibi uygun koruma gerekiyor.</li><li> Erimiş agaroz homojen olduktan sonra, şişeyi tekrar tartın ve orijinal kütlenin 0,1 g&#39;ına ultra saf su ilave edin. Buharlaşma nedeniyle kaybedilen suyun yerini alacaktır. </li><li> Erimiş agaroz katılaşmadan önce homojenliği sağlamak için eklenen suda karıştırmak için girdap yapınız. </li><li> 15.2 g agarozu 9 - 50 mL&#39;lik plastik tüplere koyun. </li><li> Gerektiğinde tüpleri soğutun. </li></ol> 2. ODELAY Agarose Media&#39;nın hazırlanması <ol><li> Manyetik bir karıştırma çubuğu ile hafifçe karıştırılarak, bir kapta, kapalı bir kapta kaynatılmak üzere 400 mL deiyonize su ısıtın. </li><li> Adım 1.10&#39;dan gelen 50 mL&#39;lik bir konik tüpteki 15.2 g agaroz alikotuna 2 mL 10X medya ( örn ., Maya Ekstresi Peptonu (YEP) veya Komple Tamamlayıcı Karışım (CSM)) ekleyin. NOT: CSM ortamı cam slaytlara yapışma eğilimi gösterir. CSM medya formülasyonlarını kullanıyorsanız, orta formülasyona steril suda 5 μL% 50 wt polietilen glikol (PEG) ilave edin. PEG,Kalıp serbest bırakma sırasında cam slaytlara yapışmasını engeller ve maya büyümesini engellemez. </li><li> Gerekirse ek 100X besin takviyeleri ekleyin ve bu adımdan toplam ilave hacmi 1 mL&#39;ye getirmek için su kullanın. </li><li> Adım 2.1&#39;den kaynar suya 50 mL konik tüp yerleştirmeden önce agaroz alikotu eklenen ortam ve takviyeleri ile tartın. </li><li> 16 dakika sonra 50 mL tüpü alın ve bir girdap kullanarak karışımı homojenize edin. Kapağı 50 mL konik tüp üzerine sıkıca tutun. NOT: Kapta bir kapak tüm tüpe eşit şekilde ısıtılmasına yardımcı olur, aksi takdirde katı bir agaroz filmi oluşacak ve muhtemelen eriyecek. Ayrıca bu süre zarfında agaroz kalıbı birleştirmek de uygundur ( Şekil 1 ). </li><li> Karışımı bir vorteks kullanarak homojenize edin. </li><li> Tüm agarın karıştırılıp eritildiğinden emin olmak için 2 dakika kaynatın. </li><li> Tüpü tartın ve kitle kaybı ultra saf steril su ile değiştirin. </li><li> 2 mL 10X karbon-ekşi ekleyinCe reaktifi ( örn .,% 20 w / v glikoz) ve vorteks ile agaroz orta solüsyonu elde edin. NOT: Cam Sürgülerinin Ayırılması: Kalıp monte edilirken, uzun ara parçaların kalıba doğru yönde yerleştirildiğinden emin olmak için özen gösterilmelidir. Bunun nedeni, lazer akrili keserken, parçayı tamamen 90 ° kenar yerine hafif açılı kenarlar bırakarak kesmek eğiliminde olmasıdır. Daha sonra kalıp, tezgah üstünde camı agardan serbest bırakmak için yerleştirildiğinde, ara parçanın kenarı, ağar ile keskin bir açıda olmalıdır. Akut açı, kalıp ayırıcının dış kenarı alt kenar çevresinde döndüğünde agarın kenarını üst cam parçasından sıkıştırmaya yardımcı olur ( Şekil 1&#39;e bakın). Sonuç, agarın en üst cam parçasından daha tutarlı bir şekilde ayrılmasıdır. NOT: Camları yağlara, silikon spreylere veya hatta ticari pencere tedavilerine uygulanan kalıptan sıyırma maddeleri kullanılmamalıdır, çünkü camları kirletecektir.<html> Agarın üründür ve muhtemelen büyümeyi engeller. Bu yöntemler bazı uygulamaların tutarlı olması için gereklidir. </li><li> Dört 2 x 3 x 1 mm kalınlığında cam eldiven ile% 70 etanol ile temizleyin ve zorunlu hava ile kurutun. </li><li> Akrilik kalıpları% 70 etanol ile temizleyin, kuru ve Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi monte edin. Gösterildiği gibi üç alt parçayı alın ve bunları birleştirerek, iki aynı parçanın üçüncü parçayı sandviç haline getirin ( Şekil 1B ). İki küçük bağlayıcı klips kullanarak ( Şekil 1C ) temel parçalarını her iki yanına sıkıştırın. Dikeyleri kalıp içine yerleştirin, böylece lazer oymağının düzgün yerleştirildiğinden emin olun ( Şekil 1E ). </li><li> Temizlenmiş ve kurutulmuş cam slaydı kalıp üzerine yerleştirin ve diğer tarafa ikinci bir cam slayt yerleştirirken yerinde tutun. Montajı daha büyük bir bağlayıcı klipsle sıkıştırın ( Şekil 1D ). Her iki kaydırmayı daha büyük bağlayıcı klipslerle sıkıştırın (Lass = &quot;xfig&quot;&gt; Şekil 1D). Üst bağlayıcı klibinin, akrilikle örtüşen cam kaymayla temas ettiğinden emin olun. </li><li> Kalan bağlayıcı klipslerini ekleyin. Yine, kelepçelerin akrilikle çakıştığı slaytla temas ettiğinden emin olun ( Şekil 1D ). NOT: Monte edilen kalıba erimiş agar ile doldurulmadan önce kenarların, kalıbın iç tarafı boyunca yaklaşık 70 mcL erimiş agar medyasının pipetlenmesiyle kapatıldığından emin olun. Bu agar hızla katılaşacak ve herhangi bir kaçağı önleyecektir. </li><li> Küfe eriyik agar ile doldurun, böylece kalıba hava kabarcıkları sıkışmasını önler. NOT: Bu, eritilmiş agarın kalıp kenarı boyunca yavaş yavaş pipetlenmesiyle gerçekleştirilebilir. Doldurulduktan sonra, kalıbın yaklaşık 23 ° C ortam sıcaklığında 1 saat süreyle 40 dakika soğumasına izin verin. Çok uzun süre soğumaya bırakılırsa, agar kalıpta kırılabilir. NOT: Kalıp Ayırımı: Döküm agardan kalıbın uygun bir şekilde çıkarılması, tek biçimli bir katı sağlamak için esastırMaya büyütmek için agar pad. Bu aşamada kalıpın etkin bir şekilde ayrılmasını sağlamamaktaki başarısızlık, katı agar pedindeki kusurlara atfedilen büyüme farklılıklarına neden olacaktır. Bu adımı birkaç kez uygulamanız önerilir. </li><li> Alt bağlayıcı klibi çıkartarak başlayın. Kalıbın altındaki üç adet sandviç parçadan oluşan parçayı çıkarın. Slaytları sıkıştırarak tutun ve sonra bağlayıcı klipslerini çıkarın. Bağlayıcı klipslerini çıkartırken kalıp kenarlarını çarpmamaya dikkat edin. Bu ortamı deforme edecektir. </li><li> Kalıbın tezgahın kenarına yerleştirilmesi, böylece kalıbın mavi noktalı yanının yukarı ve sol alt köşede olması gerekir ( Şekil 1E ). Başparmakları akrilik altına ve ilk parmağın üst kısmına kalıp iç kenarına doğru yerleştirin. </li><li> Yavaşça ve dikkatli bir şekilde başparmakla kalıba karşı itin ve kalıp tutacağını alt kenarı etrafında döndürün gibi tutun ( Şekil 1F ). Sabit uygulaAncak yavaş yavaş artan bir baskı. Kullanıcılar, üst camın kalıp ayırıcıyı kapladığı çizgi boyunca bir mola ve hava kabarcığı görür. </li><li> İlk kopma çizgisini gördükten sonra, baş parmaklarıyla yukarı doğru itin ve sabit basınç uygulayın. Agar, bu noktada camdan uzaklaşmaya başlamalıdır ( Şekil 1F ). Kalıbı yukarı doğru döndürmeye devam edin. Bu, cam sürgüsü olmadan kaldırılacaktır. Ağarın camdan soyulması gereken bir çizgi, ilk kopma çizgisinden uzaklaşmaya devam etmelidir. NOT: Bu noktada agar hem camın altına hem de üst kısmına yapışmaktadır. Bu bazen en soldaki kenarla ortaya çıkar. Deformasyon yapılan alan, mayanın bulunduğu bölgede olmadığı sürece, bu iyi olmalıdır. </li><li> Cam tamamen serbestleştiğinde tutun ve tamamen kalıptan çıkarın. Sonra, diğer kalıp parçasını, agarı hareket ettirmeden parçayı kaldırmak için benzer bir hareket kullanarak çıkarın. Slaytları birSteril tip kutu, bazı steril yüksek saflıktaki suyun altındadır. Kutuyu kapatın ve ertesi gün kullanmak için 4 ° CO / N&#39;de saklayın. Daha uzun süre saklanırsa büyüme oranları tutarsız hale gelecektir. </li></ol> 3. ODELAY Kültür Hazırlama <ol><li> O / N büyümesi için suşları 96 oyuklu bir tabağa koyun. </li><li> Ertesi gün, yeni bir plakada 220 μL toplam hacim için 200 μL medyaya 20 μL gece kültür seyreltin. </li><li> Bir plaka okuyucuda her kültürün optik yoğunluğunu 600 nm&#39;de (OD600) ölçün. Bir plaka okuyucu ve bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 3.3.1 - 3.3.6 adımlarının otomatik seyreltme protokolünü izleyin. Plakadaki kültürleri elle yaklaşık 0,1 OD600&#39;e seyreltin (isteğe bağlı). <ol><li> Plaka okuyucusunda, &quot;yeni oluştur&quot; un altındaki &quot;Deneme&quot; yi tıklayın. ODELAYDilution.exp seçin ve deneyi çalıştırın. Deneme adını ODELAY &quot;Tarih&quot; &quot;Saat&quot; &quot;Deneme Adı&quot; yinelemesi olarak girin. </li><li> S üzerine tıklayınİstatistik sekmesini tıklatın ve Excel simgesini tıklatın. Verileri başparmak sürücüsüne kaydedin ve sıvı işleme robotuna aktarın. </li><li> Robot&#39;un Düzenini ve Yöntemi Düzenleyicisini açın. Yöntem dosyasını &quot;ODELAYDilution_v1.med&quot; açın. Çalıştırılabilir dosyayı çalıştırın &quot;Convert_SynergyFiles.exe&quot;. OD600 hedefi için 0.09 girin. </li><li> &quot;Glu Düzeltme&quot; ve &quot;Gal Düzeltme&quot; ye tıklayın 0.05. Boş ortamı aynı plakta ölçün. &quot;Dosya Yarat&quot; ı tıklayın. Yöntem düzenleyicisinde dosyayı seçin. Çalışma zamanı seyreltme programını açmak için yöntemi başlatmak için durak lambası simgesini tıklayın. </li><li> Boruların çıkarılmadığından ve plakaların kapaklarının çıkarılmış olduğundan ve toz kapakları iplerden çıkarıldığından emin olun. Güverte düzeni ile gösterildiği gibi, sıvı taşıma robotunun güvertesine plakalar, borular ve uçlar yükleyin. </li><li> Seyreltme programını çalıştırmak için &quot;Oynat&quot; düğmesine tıklayın. Doğru 50 μL ipucu sayısını seçin. Doğru 300 μL ipucu sayısını seçin. Hakkında bekleİşlemin başlaması için 12 dakika. </li></ol></li><li> Seyreltme plakasını robotdan alın, uçları örtün ve 15 mL medya tüplerini özetleyin. Plakayı 30 ° C&#39;de 5-6 saat boyunca kültürleyin. </li><li> İkinci seyreltmeden önce yaklaşık 1 - 2 saat mikroskop için inkübasyon odalarını açtığınızdan emin olun. ° C&#39;de veya deney için gerekli olan sıcaklıkta dengeye gelmelerine izin verin. </li><li> Seyreltme adımları 3.3 - 3.4&#39;ü tekrarlayın, ancak agaroz slaytlarındaki kültürleri tespit etmek için kültürleri 0,01 - 0,02&#39;lik bir OD600 değerine seyreltin. </li><li> Seyreltme plakasını bir metal dondurucu sızdırmaz conta ile örtün. </li><li> Seyreltme plakasını bir buz banyosunda, plakayı tutmak için bir santrifüj metal kepçe bağlantısıyla buz suyunda yüzen plakayla 30 saniye süreyle son haline getirin ( Şekil 2A ). Sonrasyonlu kültürleri seyreltme plakasından düz bir alt plakaya aktarın. Etiket 4 x 96 oyuklu düz tabanlar 1, 2, 3 ve 4 ( Şekil 2B ). <ol><li> Transfer 150 &amp;# 181; L, A01 - D06 kuyularından 1 numaralı kuyudaki C04 - F09 kuyularına seyreltme plakasının seyreltme plakası. Sonra 150 μL seyreltme plakasını kuyu A07 - D12&#39;den etiketli plakanın C04 - F09 kuyularına aktarın. Daha sonra 150 μL E01 - H06 kuyuları 3 etiketli plakanın kuyuları C04 - F09 içine seyreltme plakası. Son olarak 150 μL seyreltme plakası kuyu E07 - H12&#39;den etiketli plakanın C04 - F09 kuyularına aktarın. </li></ol></li><li> 4. adıma geçin, Agar üzerinde Spotting yapın. </li></ol> 4. Otomatik Sıvı Sarkma Robotu Kullanılarak Agar Üzerinde Spotlama <ol><li> Nemlendirilmiş steril pipet kutularından 4 ° CO / N&#39;de saklanan agaroz slaytlarını (adım 2.19&#39;dan) çıkarın. </li><li> Gerekirse, agaroz maddenin köşelerini temiz bir tıraş bıçağı ile keserek, slayt bölmesinin üzerine oturmasını sağlayın. </li><li> Sürgülü kelepçeyi bağlantı parçasından çıkarın. Agar plakasını dikkatli bir şekilde sahne haznesi desteğinin girintili bölgesine yerleştirin. NOT: veyaKaydırma işlemi deneyden deneye tutarlıdır. </li><li> Kelepçenin odanın alt kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olmak için kontrol edin. Eğriyorsa, kayar gömülü alanda tam olarak oturmayabilir. Dengeleme çubuğunu lekelenme robotunun merkez plakası konumuna yerleştirin. Bu ara parça, tesviye vidaları için temas sağlar, böylece kayar bölme uçlarla dengelenebilir. </li><li> Plakaları, çeyrek sıralarına göre masaya yerleştirin. Levhalar 1, 2, 3 ve 4 soldan sağa doğru sıralanmıştır ( Şekil 2B ). </li><li> İpuçlarını yerleştirin böylece iç 24 kuyucuk C04 - F09 ipuçlarıyla 4 boş uç kutusu içine yerleştirilir. Beşinci bir kutunun C10 konumunda bir uç ve A01, A12, H01 ve H12 konumlarında uçları kestiği 4 ipucu olması gerekir. Bu 4 kesme uçları uç plakası kelepçesi için kararlılık sağlar ( Şekil 2C ve 2D ). </li><li> Üst kapağı kaydırarak çıkarınOda bölmesi montajı. </li><li> İlk uç yumruk robot kontrol lekelenme programının başlangıç ​​alanına yerleştirilir. Bu, daha sonra orijinal koordinatın hizalanması için kullanılacak bir agaroz deliği açar. İlk çeyreği belirlemek için plakayı 1 sıvı işleme robotunun üzerine yerleştirin. Kapağın çıkarılmış olduğundan emin olun ve spot programına devam edin. </li><li> Tüm noktaların mevcut olduğundan emin olmak için kontrol edin. Ayrıca, kuruması için 30 saniye bekleyin. Noktalar çapı yaklaşık 1 mm olduğunda, program devam edebilir. Kullanılmış ipuçlarını biyolojik zararlı kapa boşaltın ve yeni ipuçlarını robot üzerine yerleştirin. 2. çeyrek plaka için plakayı 1 takın. </li><li> Üçüncü kadranda tekrarlayın. Ve 4. çeyrek için tekrar et. </li><li> Noktalar kuruduktan sonra, kızak bölmesi kapağını yerine takın ve aygıtı ters çevirin. </li><li> Boru bağlantılarını bir hava filtresi ile takın. </li><li> Bölmenin üst tarafına cam bir slayt yerleştirin. NOT: Bu slayt reducei için önemlidirIsı akışını ağaraya çevirir ve odacıkların objektif kapak kayma tarafında yoğuşma oluşumunu en aza indirir. Bu kapak fişini unutma. Mikroskop konfigürasyonuna bağlı olarak, bu kapak kayışı aydınlatma tarafındaki ısınmanın objektif tarafta yoğuşmaya neden olmamasını sağlar. </li><li> Odanın objektif tarafına sıcak hava üflemek için bir fan yerleştirin. Bu fan, kapak kayma noktasında yoğunlaşmanın oluşmasını önler. Kabarcık oluşturucu ile hava akış oranını 10 mL / dk&#39;ya ayarlayın. </li></ol> 5. Mikroskopta ODELAY&#39;ın Çalıştırılması <ol><li> &quot;ODELAY_Microscope_Control.m&quot; komut dosyasını çalıştırın. </li><li> İletilen ışıklı kapıyı açmak için &quot;Deklanşör&quot; ü ve ardından yüksek kamera oranını başlatmak için &quot;Odak&quot; düğmesini tıklayın ( Şekil 3A , Kırmızı Oklar). </li><li> &quot;Origin Go&quot; yı tıklayın ve agarın üzerine delinmiş orijinal işareti bulmak için sahneyi hareket ettirin. </li><li> Ardından hafifçe sağa ilerleyin.E07 alanındaki maya hücrelerine odaklanın. </li><li> Menşe ziline geri dönün ve görüş alanına ortalayın. </li><li> &quot;Ayarla&quot; düğmesine basarak menşei bu değere ayarlayın ( Şekil 3A , Mavi Oklar). Şimdi H18 konumuna getirin ve o bölgeye en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklayın. Daha sonra L07 konumuna getirin ve o bölgeye en yakın altıgen vidayı kullanarak odaklayın. Ardından E07 konumuna gidin ve o bölgeye en yakın altıgen vidayla odaklama yapın. </li><li> Bu konumlar odaklanıncaya kadar 5.5 - 5.7 arasındaki adımları tekrarlayın. </li><li> Odak merkezini ve kenarları E12, H12, L12 noktalarında kontrol edin. Z-değeri ile gösterilen odak Z değerleri, otomatik odaklanma aralığından daha büyük ise ( örn ., Otofokus aralığını 60 μm olarak ayarlayın, bir merkez nokta için Z değeri ± 40 um). </li><li> Sıfırla düğmesine basarak düğme özelliklerini etkinleştirin ve sonra düğmesine basın.ODELAY ( Şekil 3A , Yeşil Oklar). Verileri kaydetmek için dizini seçin. Yeterli sürücü alanının mevcut olduğundan emin olun. NOT: Mikroskop, 48 saat boyunca veya program kapanıncaya kadar verileri toplar. </li></ol> 6. ODELAY Verilerinin İşlenmesi <ol><li> ODELAY_IPT.exe&#39;yi açın veya ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m komut dosyasını kullanın ( Şekil 3C ). </li><li> * ODELAYExpDisc.xlsx excel elektronik tablosu hazırlayın. </li><li> Deneyi B1 hücresine yazın. </li><li> E07 - H18 Resim dosyalarının saklandığı Resim Dizini&#39;ni seçin. </li><li> Verilerin yazılacağı Veri Dizini&#39;ni seçin. </li><li> Denemenin B04 hücresine başladığı tarihi yazın. AA / GG / YYYY biçimini kullanın. </li><li> C04 hücresindeki seyreltme süresini yazın. Bu süre, ilk görüntü toplanmadan yaklaşık beş dakika önce. HH: MMpm biçimini kullanın; burada HH, h için ve MM dakika için dır. </li><li> Gerinim isimlerini tO kaynak plakası (adım 3.1). Suşların lekelenme şekli nedeniyle ODELAY agaroz slaydında yeniden düzenlenirler. C31 - C126 hücreleri, ODELAY agar plakasındaki spot lokasyonlar iken, tablo B31 - B126&#39;daki hücreler kaynak plakadır. </li><li> Ardından &quot;İşlem Verileri&quot; düğmesine basın ve daha yeni hazırlanan * ODELAYExpDisc.xlsx dosyasını seçin. </li><li> Verileri işlemek için kullanılan bilgisayar sistemine bağlı olarak 16-24 saat bekleyin. </li><li> Görüntüler işlendiğinde, &quot;ODELAY Well Data&quot; adlı bir dizin ve &quot;* _Index_ODELAYData.mat&quot; dosyası görüntülenir. &quot;Load Data&quot; düğmesine basın ve yeni oluşturulan &quot;* _Index_ODELAYData.mat&quot; dosyasını seçin. Bu, işlenen yeni veri kümesini yükleyecektir. Dosya adındaki &quot;*&quot;, excel e-tablosuna girilen deneme adına göre listelenir. </li><li> Verileri yükledikten sonra alttaki zaman çubuğunu kullanarak inceleyin, büyütme eğrilerini görmek için bir görüntü karesine tıklayın fYa da o noktada ya da sol taraftaki listede ilgini çeken bir yeri bulun ve sonra o listeye ait resimleri yükleyin. </li><li> &quot;Violin Plot&quot; düğmesine basarak nüfus büyüme parametrelerinin histogramlarını oluşturun. Bu, Şekil 4 veya Şekil 6&#39;da gösterilen bir arsa oluşturacaktır. </li></ol>

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

ODELAY tahlili, tekrarlanabilir ve güvenilir fenotipik ölçümlerin sağlanması için birkaç kritik noktaya sahiptir. İlk kritik nokta maya kültürlerinin tutarlı bir şekilde hazırlanmasıdır. Logaritmik büyümeden maya hücrelerinin hasatına dikkat edilmelidir. Kültürler doymuşsa, genetik veya çevresel ( ör. Karbon kaynağı) faktörlerin yol açtığı heterojenliği bozan nüfus heterojenliği artacaktır 11 . İkinci kritik nokta, medyanın tutarlı bir şekilde hazırlanmasıdır. Genel olarak, büyük bir hacimde 10X stok ortamı çözümü üretilmeli ve daha sonra yığın etkilerini en aza indirgemek için zamanla kullanılmalıdır. Ortamı, mümkün olduğunca ağırlık olarak formüle etmek, agarın yoğunluğunu temin ederek ortamdaki agaroz yoğunluğunu arttırarak ortamın tutarlılığını geliştirmeye yardımcı olur ve agarozun genel su içeriği yakından izlenebilir. Üçüncü kritik nokta, agarozun mekanik deformasyonunu en aza indirgemeyi veya ortadan kaldırmayı içerirçap. Ortamın mekanik deformasyonu, agarozun cam kaydıraklardan ayrılması sırasında en sık meydana gelecektir. Birçok laboratuvar tekniğinde olduğu gibi, bu adımı uygulamak için uygulama gerekmektedir. Gecikme süresinin Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi değişimi genellikle üç faktörden biriyle ilişkilidir: agaroz ortamının mekanik deformasyonu, kalıplanmış agar kalınlığında değişim veya dengesiz bir ışık kaynağı. Agaroz ortamı, lekelenmiş dizi boyunca Z-yüksekliğinde farklılık gösteriyorsa, yükseklik değişimi otofokus rutininin aralığını bastırabilir ve bu da ilk görüntülerin biraz odak dışına çıkmasına neden olur. Bu nedenle, otofokus rutinin odağı bulmak için yeterli Z aralığına sahip olduğundan emin olmak için, orta noktada ve lekelenmiş dizinin kenarları boyunca odak noktasının yüksekliğini kontrol edin. Gerekirse, odak aralığını artırmak ve odak adımlarının sayısını artırmak için Otofokus panelini kullanın. Üçüncü olası koşulYoğun odaklanmaya yol açabilecek iyon belirli bir Z-yüksekliği için hesaplanan odak noktasını bozabilen dengesiz veya titreşen bir ışık kaynağıdır. Tungsten halojen ampuller, ampuller yanmadan önce iyi titreşirler. Kötü odaklanma etkisi, büyüme eğrilerinin birinci ve ikinci zaman noktaları arasında dalgalandığı ( Şekil 5A) bir örnekte görülürken, bitişik nokta aynı dalgaya sahip değildir ( Şekil 5B). Bu durumda, kötü odaklanma durumu, tungsten halojen ışık kaynağının değiştirilmesi ile hafifletildi. Uygulamada, yazarlar, 100W tungsten halojen ampullerin titremesini azaltmak için, ampullerin her 500 saatte bir değiştirilmesi gerektiğini veya yaklaşık 2 ayda bir mikroskopların ağır kullanımı altında olduğunu tespit ettiler. Titreyen bir ampulün odağın zayıf odak noktalarını önlemek için tungsten halojen ışık kaynağını sık sık değiştirin veya halojen ampulü bir diyotlu ışık kaynağı ile değiştirin. birŞekil 6&#39;da çift ​​katlama sürelerinde düşük varyasyonun yanı sıra daha düzgün gecikme süreleri gösteren bir veri kümesi örneği gösterilmektedir. Bu veri seti otomatik odaklamayı gerçekleştirirken zamanla daha kararlı bir aydınlatma sağlayan bir diyot aydınlatıcısı ile çekildi. Burada medya hazırlığını optimize etmek için bahsedilen pek çok nokta açıkça görülebiliyor olsa da, literatürde en büyük ölçekli ekranlar 8 , 11 birbirleriyle iyi çoğalmamaktadır . Bu nedenle, daha çoğaltılabilir fenotipik ekranların üretilebileceği şekilde kültürlerin ve agaroz ortamının hazırlanmasını özenle tarif ettik. ODELAY tahlili şu anda sentetik genetik diziler veya Scan-O-Matic tahlili gibi sabitleme tabanlı testlere kıyasla verimlilik açısından sınırlıdır. Bu yöntemler ölçülen suşların sayısını arttırırken, tek tek hücrelerin çözümlenmesinde bir yeteneği yoktur.Bu nedenle klonal maya suşlarında gözlemlediğimiz nüfus heterojenliğini ölçemez. Bu nüfus heterojenliğinin kökeni şu an anlaşılmamıştır, ancak burada gösterilen teknoloji ve hesaplamanın bir araya getirilmesi altında yatan hücresel mekanizmaları nesnel olarak ele alma fırsatı sunmaktadır 12 . Yazarlar, ODELAY&#39;in şu anda sadece belirli bir mikroskop markası ve vücut tipi için optimize edildiğini belirtmek ister. ODELAY&#39;ı diğer mikroskop sistemler için değiştirmeniz açıktır, ancak açık kaynak API 13&#39;ün bilgisi gerekecektir. Bununla birlikte, hem API, hem de ODELAY betiği farklı sistemlere ve deneysel tahlillere kolayca uyarlanacak şekilde yazılmıştır. ODELAY orijinal olarak maya için geliştirilmiş iken, Mycobacterium smegmatis&#39;in büyümesini gözlemlemek için onu değiştirmeden kullanabiliriz. Diğer koloni oluşturan mikroorganizmaların gözlemlenmesiSağlanan kaynak kodundaki değişikliklerle mümkündür 11 . Genel olarak ODELAY, farklı çevresel koşullar ve genetik karışıklıklar altında yetiştirilen mikroorganizmaları karşılaştırmak için güçlü ve esnek bir araçtır.

Mikroorganizmaların çoğalma fenotipleri belirli bir çevre koşuluna temel oluşturan genetik uygunluğunun güçlü bir göstergesidir. Büyüme klasik olarak 3 farklı büyüme rejimine ayrılmıştır: gecikme fazı, log fazı ve sabit faz büyümesi 1 . Her büyüme evresi, çeşitli çevresel ve genetik koşullara bağlı olarak, çeşitli zindelik yönlerini ortaya çıkarabilir. Örneğin, gecikme süresi veya üstel büyüme başlamadan önce bir organizmanın gecikme fazında geçirdiği süre, bir organizmanın değişen çevresel koşullara tepki verme kabiliyetinin göstergesi olabilir 2 . Günlük faz büyümesindeki katlanma süresi, hücresel uygunluğun en yaygın metriği, bir organizmanın replikasyon için çevresel materyalleri metabolize ederek ve kullanarak bölünme kabiliyetinin genel verimliliğini ortaya koymaktadır. Günlük fazdan sonraki büyümenin hızla azaldığı durağan faz, fitness için başka bir göstergedir; bu normaldirSpot tabanlı maya büyüme tahlillerinde büyüme bitiş noktası olarak kullanılmıştır. Birkaç maya büyüme tahlili şu anda mevcuttur ve mayada büyüme fenotiplerinin değerlendirilmesi için standart yöntemler olarak kabul edilmektedir 3 , 4 , 5 . Bu tahliller öncelikle katı maya veya sıvı ortamda maya yetiştirme yöntemlerine dayanmaktadır. Katı ortamda, koloni tutturma deneyleri az sayıda hücreyi bir iğne ile katı agara aktarır ve maya hücrelerinin belli bir süre boyunca büyümesine izin verilir. Koloniler daha sonra görüntülenecek ve boyutları bir uç nokta 6&#39;da karşılaştırılacaktır . Bu koloni tutturma deneyleri genom geniş ekranlar üretmek için sağlam ve ölçeklenebilir olduklarını kanıtladı. Daha yakın zamanlarda, düz yatay tarayıcılar ve Tek Mercek Refleksi (SLR) kameralar kullanan periyodik görüntüleme, bu tahliller içine koloni gelişimini zamanla kaydetmek için dahil edilmiştir 7 , 8, 9 . Bununla birlikte, bu cihazların çözünürlüğü tek hücrelerin bulunmasını önler ve dolayısıyla bu koloni tutturma deneyleri gecikme süresini doğrudan gözlemez ve kolonilere dönüşen ayrı hücreler arasındaki varyasyonu gözlemleyemez. Sıvı temelli büyüme tahlilleri genom geniş ekranlarını 3 gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Bir sıvı büyüme tahlilini zaman atlamalı mikroskopi ile birleştirmek, genetik olarak aynı bireysel hücrelerin katlanma zamanında popülasyon heterojenliğini ortaya çıkarmıştır; bu, genetik düzenlemeyi ve çevresel adaptasyonu anlamada önemli bir perspektif sunmaktadır. Bununla birlikte, bu test, gecikme süresi ve taşıma kapasitesi gibi büyümenin diğer yönlerini ölçmez. Burada ODELAY 11 olarak adlandırdığımız bir tahlil kullanarak katı ortam üzerinde koloni oluşturan mikroorganizmaların üç büyüme evresinin karakterize edilmesi için bir yöntem sunuyoruz. ODELAY utili kapsarKatı ortamlar üzerine kolonilere büyüyen tek hücrelerin görüntülerini kaydetmek için yüksek verimli zaman atlamalı mikroskopi. Kolonilere dönüşen tek tek hücrelerin bu popülasyonu, terminal son nokta skorlaması gibi daha az hassas ölçümlerle saptanmayan, temelde nüfus heterojenliğini ortaya koymaktadır. Mayadaki yöntemi gösteriyoruz, ancak ODELAY parlak alan mikroskobunda kontrast gösteren herhangi bir organizmaya uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

Mikroorganizmaların büyüme fenotipleri, temel genetik uygunluğunun güçlü bir göstergesidir ve gecikme fazı, log fazı ve sabit faz olmak üzere 3 büyüme rejimine ayrılabilir. Her büyüme evresi, değişik çevresel ve genetik koşullarla ilişkili çeşitli zindelik yönlerini ortaya çıkarabilir. 3 aşamalı büyümenin yüksek çözünürlüklü ve kantitatif ölçümleri genellikle elde etmek zordur. Burada, Maya&#39;nın yaşayan dizilerinin (ODELAY) Tek Hücreli Katına Getirilmesi Değerlendirmesi adlı bir tahlil kullanarak katı ortamdaki 3 büyüme evresinin karakterize edilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. ODELAY, zaman atlamalı mikroskopi kullanarak katı ortamlar üzerine kolonilere büyüyen bireysel hücrelerin büyüme fenotiplerini nicelendirir. Bu yöntem, kolonilere büyüyen genetik olarak özdeş hücrelerdeki her büyüme parametresiyle nüfus heterojenliğini doğrudan izleyebilir. Bu nüfus heterojenliği, genetik ve epigenetik düzenlemeyi anlamaya yönelik benzersiz bir bakış açısı sunar veGenetik ve çevresel bozulmalar. ODELAY yöntemi mayayı kullanarak gösterilirken, parlak alan mikroskopisi ile görülebilen herhangi bir koloni oluşturan mikroorganizma üzerinde kullanılabilir.

<html> Zaman-lapse mikroskobunda büyüyen maya görüntüleri Şekil 3B&#39;de gösterilmektedir. Zaman atlamalı görüntüleri işledikten sonra, maya suşları BY4741 ve BY4742&#39;yi karşılaştıran temsili bir veri seti Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. Bu örnek veri kümesinde plakadaki farklı konumlar arasındaki zaman katlamasında çok az değişiklik vardır. Agaroz ortamı zayıf şekilde hazırlanırsa, agaroz jelinin deforme olmuş bölgesi ile çakışan nokta konumlarında iki katlama süresi ve gecikme süresinde belirgin bir sapma belirgindir. Katlanma sürelerinin göreceli olarak tek biçimli olduğu görülürken, bu örnek gecikme süreleri ölçümlerinde değişiklikler göstermektedir. Daha tutarlı bir veri kümesi Şekil 6&#39;da gösterilmektedir. Bu veri kümesinde gecikme süresi ve katlama süresi eşittir. Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Agar Kalıp Montajı. Agar kalıbın bileşenleri ( A ) &#39;da gösterilmiştir. Tabanı ( B ) &#39;de gösterildiği şekilde monte edin ve tabanı küçük bağlayıcı klipslerle sıkıştırın. Uzun dik parçaları, tabanın boşluğuna ( C ) yerleştirin ve sonra sürgüleri kalıba ( D ) gösterildiği şekilde kampa alın. Agarın cam slayttan ( E ) tutarlı bir şekilde ayrılması için kalıp açısını ve kalıp oyuğunun yönünü gösteren yan görünüş. Başparmak ve parmağınızın konumunu ve ayrıca agarın slayttan ( F ) ayıran düz çizgisine dikkat edin ve yatay oku not edin. Ayırma çizgisi dikey ok yönünde eşit olarak uzağa doğru hareket etmelidir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-sayfa = &quot;1&quot;&gt; <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Şekil 2: Sonication ve Spotting Yöntemi. Plakayı buzlu suda sonikleyin ve plakayı ( A ) desteklemeye yardımcı olmak için bir santrifüj kovası tutucu kullanın. 3.8.1. Adımlardan plakaları agaroz plakaya ( B ) tespit etmek için yerleştirin. Ayrıca, uçların en solundaki uç kutusunun C10 konumunda bir ucu olacak şekilde düzenleyin ve daha sonra uçları kesilerek plaka tutucusunun ( C ) çarpmamasına dikkat edin. Kalan ip uçlarını dört kutuya yerleştirin; böylece içteki 24 ipucu pozisyonları kapanır ( D ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: ODELAY Grafik Kullanıcı Arayüzü. &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ) için Grafik Kullanıcı Arayüzünün bir ekran görüntüsü. Bu arayüz kameranın izlenmesine ve epifloresan ve parlak alan modları için mikroskop aydınlatma ayarlarının yapılmasına izin verir. Kırmızı oklar sırasıyla görüntüleri hızlı bir şekilde elde etmek ve iletilen ışıklı kapıyı açmak için kamerayı etkinleştiren Odak ve İletilen düğmelerin üzerine gelmektedir. Mavi oklar, orijinal için sahneyi hareket ettirmek ve daha sonra orijini &quot;Go Origin&quot; düğmesi ve &quot;Ayarla&quot; düğmesi ile ayarlamak için kullanılır. Yeşil oklar &quot;Reset&quot; ve &quot;ODELAY !!!&quot; ODELAY görüntü modlarını geçerli koşullara sıfırlayan ve ODELAY resim koleksiyonunu başlatan düğmeler. Spotasyondan sonra 0, 3, 6 ve 9. saatte katı ortamda büyüyen maya görüntüleri. &quot;ODELAY_IPT.m&quot; veya &quot;ODELAY_IPT.m&quot; için Grafik Kullanıcı Arayüzünün bir ekran görüntüsü.<html> E ODELAY Görüntü İşleme Aracı ( C ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Şekil 4: Örnek ODELAY Çıkışı. Bu veri kümesi, BY4741 ve BY4742 suşlarının YPD ortamı üzerindeki özelliklerini karşılaştırır. Bu şekil iyi hazırlanmış bir agaroz slaydına bir örnektir; Ancak, otofokus ayarları en uygun değildir. Her sütunda soldan sağa doğru çıkan veriler şöyledir: Koloni alanının 2. Ağzındaki taşıma kapasitesi; Dakikada verilen katlama süresi; Ve gecikme zamanı, dakika olarak verilir. Bu örnekte, agar slaydındaki tüm lekelerin zamanlarının ikiye katlanması, kolona doğru artan katlanma süresinin küçük bir miktarı ile iyi bir şekilde dizilir. Bununla birlikte, gecikme süreleri bu veri kümesinde belirgin olarak değişir._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Şekil 5: Büyüme Eğrisi Örnekleri. Bu örnek, bitişik konumun daha kısa bir gecikme süresi ( B ) gösterdiği halde, zayıf başlangıç ​​odaklanmasının tahmini gecikme süresinin ( A ) artmasına neden olabileceğini göstermektedir. T d , dk katlanma süresidir ve t gecikme dk gecikme süresidir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Şekil 6: İyi Yürütülmüş Deney Deneyinin Örneği. Bir eBir tungsten halojen ampulü bir diyot aydınlatıcısı ile değiştirdikten ve otofokusun doğru ayarlanmasını sağladıktan sonra test edilen BY4742 suşunun bir örneği. Tüm çiftleşme sürelerinin iyi örtüştüğü ve gecikme sürelerinin tutarlı olduğu görülüyor. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Görüntüleme.  Institute for Systems Biology.  Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir. 

Video: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genetik

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Biyoloji

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...