Name: application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila at JoVE.com

Yazarlar Arnim Jenett, Aljoscha Nern ve Rubin laboratuvar tavsiye için diğer üyeleri ve yayınlanmamış reaktifler ve Janelia uçmak ışık projesi confocal görüntüleri oluşturmak için takım paylaşım teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca el yazması üzerinde yorumlar için Galya laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz.

1. hazırlama sinekler çok renkli FlpOut (MCFO) deneyleri için Not: MCFO tekniği sözde Flp aracılı dur kaset eksizyon (FlpOut) değiştirilmiş bir sürümü anlamına gelir. Transgenik MCFO sinekler taşımak bir ısı şok organizatörü (hsp)-Flp recombinase ve farklı gazetecilere UAS altında kontrol. Her gazeteci bir myristoylated (en düşük) süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP), hangi 10 kopya epitope etiketinin içinde ortak bir omurga oluşur (örn., HA, bayrak veya V5) eklenmiş olan. Elde edilen floresan proteinler olarak adlandırılan &#34; Spagetti Canavarı GFPs &#34; (smGFPs) 14 ve farklı epitope Etiketler karşı belirli antikor kullanılarak algılanabilir.
<ol><li>Çapraz MCFO kaset ve hsp Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) ile (bkz. tablo reçetesi) uygun gliyal GAL4 sürücü satırları için uçar .
	<ol><li>Hsp zaten 25 ° C'de etkindir ve kaç hücre bir belirsiz etiketleme için önde gelen rekombinasyon tabi olabilir haçlar 18 ° c sisteminin leakiness önlemek için ayarlayın. 18 ° C'de F1 üretimi elde etmek için yaklaşık 20 gün bekleyin. Sonra ısı (bkz. Adım 2) darbe, 25 ° c ( şekil 3) sinekler korumak.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isı şok Not: ekleme siteye bağlı olarak, hsp-Flp verimliliğini farklı olabilir; bu nedenle, en iyi ısı şok zaman optimize edilmiş olması gerekir. Bu iletişim kuralı için bir MCFO sinek hisse senedi içinde hsp-Flp X kromozomu üzerinde takılı beri kullanılmaktadır (Tablo malzemeleri görmek).
<ol><li>Transfer döl haç adım 1.1 (F1 üretimi sinekler, 3-4 gün eski) gıda ve ısı içeren yeni tüpleri içine şok onları bir su banyosu içinde 37 ° C'de. 
	Not: Genç sinekler (1-2 gün eski) ısı şok çok duyarlıdır. 1 veya 2 ile tedavi kaynaklanan ölüm oranı azaltmak için ısı şok gerçekleştirmeden önce gün daha beklemek. Bazı F1 üretimi uçar ısı şok olmadan bir denetim olarak kullanmak.</li>
	<li>Isı şok sırasında stres kaynaklı ölüm oranı azaltmak için gıda ile normal şişeleri sinekli korumak. Kadın ve erkekler ayrı şişeleri koydu.</li>
	<li>Suda bir homojen ısı şok emin olmak için tüm şişe sokmak emin olun. 5-8 dk şok glia hücreleri birçok GAL4 sürücü satırları ile seyrek etiketleme için uygun bir başlangıç noktası olarak kullanmak; şok süresi her sürücü ve deney (daha kısa veya daha uzun ısı şok kez gerekli olabilir) için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Isı şoktan sonra ısı şoktan sinekler izni vermesi için birkaç dakika için yatay olarak bankta şişeleri yatıyordu. 
	Not: Bu tüpleri değiştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>25 ° C'de sinekler korumak ve onları en iyi muhabir ifade için 2 veya daha fazla gün sonra ısı şok incelemek (bkz. Adım 3 ve 4).</li>
</ol> 3. Diseksiyon hazırlık ve çözümleri <ol><li>diseksiyon, günün hazırlamak 200 µL PCR tüpleri taze sabitleştirici çözümde S2 hücre kültür ortamının 180 µL % 20 paraformaldehyde (% 2 PFA çözüm elde etmek için İngiltere'de yılın) 20 µL ile karıştırılarak. Öncesi ve sırasında diseksiyon sabitleştirici çözüm buz üzerinde korumak. 
	Dikkat: PFA toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir. 
	Not: S2 hücre kültür ortamının 160 µL % 20 paraformaldehyde (PFA) % 2 çözüm yerine % 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlamak için 200 µL PCR tüp içinde 40 µL karıştırın.</li>
	<li>Bir PCR tüp genotip başına en fazla 8-10 beyin tüp başına en iyi boyama sonucu almak için kullanın.</li>
	<li>Hazırlamak yetişkin beyin yıkama çözüm: %0.5 sığır serum albümin, % 0.5 PBS Triton X-100. 
	Not: boyama üzerinde % 1'i içeren bir çözüm bağlı olarak Triton X-100 gerekli olabilir. Triton X-100 daha yüksek bir konsantrasyon antikor doku içine nüfuz artırır ve içten içe doku (Örneğin, sinaptik bölgelerde yetişkin Drosophila beyin) yalan leke bölgelere gereklidir.</li>
	<li>Engelleme çözüm hazırlamak: % 3 normal keçi serum, % 3 normal eşek serum ve % 0,5 PBS Triton X-100.</li>
	<li>Yetişkin beyin yıkama çözüm ve engelleme çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Buzda derin depresyon wells cam levha koymak ve her doldurmak aşağıdaki çözümleri ile iyi: bir % 70 etanol, bir PBS ve S2 hücre kültür orta ile bir.</li>
</ol> 4. Yetişkin beyin diseksiyon <ol><li>3 cm çanak bir stereomicroscope sahnesinde anatomi konumlandırın ve soğuk S2 hücre kültür orta ile doldurun. Doku diseksiyon işlem sırasında sağlıklı kalmasını sağlamak için bu ortamda tüm diseksiyonlarının kuralları. 
	Not: Siyah Silikon (görüntülerde) iyi bir arka plan kontrast sağlayan birkaç milimetre ile kaplı bir diseksiyon tabak kullanın ve forseps diseksiyon sırasında korumak.</li>
	<li>CO 2 ile istenen genotip sinekler anestezi.</li>
	<li>İle forseps, kanatları tarafından sinek kapmak ve soğuk % 70 etanol için 30 yıkayın sonra soğuk PBS için ek 30 ile s s.</li>
	<li>S2 hücre kültür orta ile dolu derin depresyon iyi içine anında transfer.</li>
	<li>Aynı genotip tüm sinekler için aynı işlemi tekrarlayın ve doku korur diseksiyon kadar soğuk S2 hücre kültürü ortamında proje. 
	Not: yaklaşık 30 dk. bir zaman diliminde S2 hücre kültür orta uzun kuluçka zamanlarında disseke sinekler sayısı doku zarar verebilir sadece anestezi.</li>
	<li>Anında Forseps ile kapmak ve S2 hücre kültür Orta hızlı bir stereomicroscope altında daldırın.</li>
	<li>Kafa vücudun geri kalanından ayırmak. Cesedi atmak ve S2 hücre kültürü ortamında batık kafa tutmak. Baş Forseps ile diseksiyon süresi boyunca tutmak son derece önemlidir. Baş yüzmek başlarsa, o dokuya zarar vermeden almak zor olacak.</li>
	<li>Her zaman en az bir Forseps ile kafa tutarak bir göz çekerek diseksiyon başlar. Forseps ucu önlemek için sadece retina altında doku zarar veriyor emin olun. Diğer gözü çekin ve beyin görünene kadar manikür kaldırma başlar.</li>
	Doku temiz görünene kadar <li>tüm trakeal doku ve kütikül beyin çevresinde çıkarın. Beyin en iyi boyama sonuçları için etrafında tüm trakeal doku kaldırdığınızdan emin olun; dokular şimdi sabit ve lekeli hazır.</li>
	<li>Soğuk S2 disseke beyinlerinde hücre kültür Orta İngiltere'de yılın çözümde fiksasyon adım zaman için aktarmadan önce korumak.</li>
</ol> 5. Yetişkin beyin boyama < ol> <li>Oda sıcaklığında (RT) İngiltere'de yılın çözüm içine bir P10 pipet ile izole beyin transfer. Doku hasarı önlemek için hiç beyin sonra diseksiyon aktarmak için forseps kullanın. 200 µL PCR tüpleri bir nutator üzerinde tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm adımları, P200 pipet ile eski çözüm atılmadan önce beyin tüpün dibinde yerleşmek izin vermek için. Doku aspirating olmadan süpernatant kaldırmayı deneyin. Doku ışık pozlama korumak.</li>
	<li>Tamir %2 200 µL beyinlerinde PFA S2 hücre kültür orta 1 h için veya % 4 İngiltere'de yılın 30 dakika. Fiksasyon kez tekrarlanabilirlik artırmak için örnek arasında aynı devam.</li>
	3 (veya daha fazla) ile 15 dakika her 200 µL yetişkin beyninin çözüm, yıkama yıkar sonra <li>engellemek için 30 dakika çözüm engelleme 200 µL kurcalayarak. Çözüm kapatmaktır uzun kuluçka süreleri mümkün.</li>
	<li>Beyni bir yetişkin beyninin çözüm toplam hacmi çok 200 µL yıkama seyreltilmiş birincil antikorlar ile 4 ° C'de gecede Incubate. 
	Not: Kuluçka kez kullanılan antikor türüne bağlı olarak değişebilir. Uzun incubations gerekli olabilir.
	<ol><li>Üç MCFO işaretleri etiketleme için kuluçkaya ile beyin anti-HA (1:500), Anti-bayrak (DYKDDDDK epitope) 1: (100) ve anti-V5 birincil antikorlar.</li>
		<li>Birincil Birleşik-doğrudan antikorlar normal birincil + ikincil kasanın yerine kullanılan (örn., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). Bu durumda, Birleşik-doğrudan antikor ikincil antikor tedavisi. 
		Not: her genotip için biraz beyin boyama özgüllüğü doğrulamak için denetim tutun. Birincil antikor kuluçka atlayabilir ve doğrudan bir sonraki adıma geçin.</li>
	</ol></li> <li>1 h için 3 kez doku yetişkin beyin yıkama çözüm (Adım 3.3) 200 µL içinde yıkayın ve onları yetişkin beyninin çözüm gecede 4'te yıkama seyreltilmiş ikincil fluorophore-conjugates/birincil Birleşik-doğrudan antikorlar ile kuluçkaya ° C veya 200 µL toplam hacmine RT, 4 h için Not: uygun antikorlar örnekleri: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) ve DyLight 647 (1: 100)-Birleşik antikorlar.</li>
	<li>Beynim 1s yetişkin beyin yıkama çözüm, 200 µL PBS gecede 4 ° C'de veya 1-2 h RT için son bir makinaya ardından 200 µL içinde 3 kez yıkayın; PBS son yıkama adımda Triton X-100 herhangi bir iz kaldırır ve için gereklidir En iyi boyama sonuçları. Montaj orta beyinlerinde bir anti-fade ajan ile cam coverslips mount.</li>
</ol> 6. Beyin görüntüleme için montaj <ol><li>Trim görüntüleme bir spacer uygun boyutu makas kullanarak. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için numune ve görüntüleme spacer iki cam coverslips arasında sandviç. 
	Not: Görüntüleme çubukları ince (0,12 mm kalınlığında) olan örneklerin sıkıştırma olmadan montaj sağlayan bu peel ve stick cam coverslips ya da mikroskop slaytlara yapışkanlı çubukları.</li>
	<li>Kullanma forseps, yapışkanlı liner bir yüzeyden kaldırmak ve RONDELA, yapışkanlı yüzü aşağı, bir cam coverslip (22 mm x 60 mm) yüzey üzerinde geçerlidir. Montaj orta 10 µL uygulamak için yeni bir cam coverslip.</li>
	<li>İle bir P10 pipet, transfer beyin 200 µL tüpünden montaj orta damla yanında coverslip. Dokular ile birlikte, çözüm beyni korumak için bazı PBS transfer.</li>
	<li>İle bir P10 pipet, PBS miktarını sınırlamak çalışıyor montaj orta damla için PBS beyin taşıyın. Numuneler montaj orta coverslip görüntüleme rondela ile aktarmak. Numune karşılamak için yeterli montaj medya kullanın.</li>
	<li>Diğer yapışkan liner rondela üst taraftan kaldırın ve cam coverslip örnekler üzerine ekleyin. Bir pens ucu ile mühürlemek için yapışkan alan üzerinde hafif bir basınç uygulayın. Hemen bağlı doku görüntü veya daha sonraki analizler için-20 ° C'de slaytları depolama.</li>
</ol> 7. Görüntü alma <ol><li>confocal floresan görüntüleri bir 40 X confocal mikroskop kullanarak edinme yığını (NA = 1.2, su daldırma) amaç veya 63 X (NA 1.4, yağı daldırma =) amaç (piksel boyutları 1024 x 1024 xy düzlemde; = İki confocal bölümleri arasındaki uzaklığı 0,5 µm =). Dedektör kazanç ve böyle bir şekilde doymuş piksel ve sıfır piksel değerlerini görüntüleri mevcut her kanaldaki uzaklığı ayarlamak; Bu bilgi kaybını önler ve Dedektör tam dinamik aralığının sağlar. 
	Not: 3D görüntüleme zaman alıcı olduğu için ölçümler paralel farklı yerlerde birden fazla örnekleri tarayarak otomatikleştirilebilir. Buharlaşma ile su daldırma amaç önlemek için özel yağ daldırma orta Kırılma indisi n ile kullanın 1.33 =.</li>
	<li>Confocal yığınlar için maksimum yoğunluk projeksiyon, kanal renk ve parlaklık ayarı değişiklikleri işlemek ve herhangi bir standart resim analiz yazılımı kullanarak kontrast (Tablo malzemeleri görmek).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+in+neuroscience:+Architects+in+neural+circuit+design:+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity.">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li><li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly.">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li><li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brain+development+and+homeostasis+by+local+and+systemic+insulin+signalling.">Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling.</a> Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).</li><li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons.">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133 (3), 498-509 (2008).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+and+magic+of+glia:+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease.">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li><li>Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interaction+in+the+insect+nervous+system.">Neuron-glia interaction in the insect nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).</li><li>Oland, L. A., Tolbert, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+interactions+between+neurons+and+glial+cells+during+neural+development+in+insects.">Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects.</a> Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).</li><li>Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions+through+the+Heartless+FGF+receptor+signaling+pathway+mediate+morphogenesis+of+Drosophila+astrocytes.">Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes.</a> Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).</li><li>Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+in+Drosophila+behavior.">Glia in Drosophila behavior.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes.">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li><li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system.">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li><li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy.">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Brainbow:+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns.">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li><li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flybow:+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster.">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li><li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system.">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li></ol>

Hiçbiri-in belgili tanımlık yazar rakip veya çakışan ilgi alanlarına sahip.

Bu iletişim kuralı bir doku yüksek çözünürlükte ilgi içinde farklı hücre türleri morfolojisi çalışmaya kolay ve etkin bir yöntem açıklanır. MCFO tekniği ile farklı epitope etiketleri ile birden fazla gazetecilere çok renkli Stokastik (Şekil 2) etiketleme için birlikte kullanılır. Benzer şekilde Brainbow/Flybow15,16,17gibi diğer yöntemleri, MCFO hücre-hücre etkileşim ?...

Glia, sinir sistemi (NS), Sigara nöronal hücre nüfusu uzun nöronlar için statik bir çerçeve sağlamak sayıyorlar ve bu nedenle ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Ancak, insanlar, glia hücreleri NS (~ %90) büyük çoğunluğu teşkil ve astrocytes, oligodendrocytes, microglia ve Schwann hücreleri de dahil olmak üzere, birkaç farklı kategoride toplanır. Drosophilaiçinde glia hücreleri NS yaklaşık yüzde 10'u oluşturmaktadır. Çoğu intriguingly konularda, kendi türleri morfoloji ve işlevleri omurgalılar1,2' bulunanlara benzer. Kendi türleri Morfoloji epiteli, ensheathing ve astrocyte benzeri hücreler oluşturan kan - beyin bariyerini (BBB) içerir.
Drosophila merkezi sinir sistemi (MSS) aşağıdaki temel yapıdan oluşur: nöronal hücre organları; içeren korteksin bölgeleri Sinaptik bağlantıları liman neuropils; farklı neuropiles bağlanan küçük ve büyük axon yolları; duyu organları ve kaslar MSS (şekil 1) ile bağlanan periferik sinirler. Glia anatomik yapılarla ilişkili bulunur: korteks glia (CG) kortikal bölgelerde astrocyte benzeri glia (ALG) ve neuropile bölgelerinde, ensheathing glia ensheathing glia (EG) ayrıca merkezi axon yolları ve çevre birimi ile ilişkili vardır sinirler (EGN) ve son olarak, iki sayfa benzeri glia, perineurial glia (PG) ve subperineurial (SPG), hangi birlikte tüm NS (Şekil 2) kapsayan bir bitişik katman oluşturur.
Önceki çalışmalarda bu glia göstermiştir NS; gelişiminde önemli rol oynarlar Onlar için sistemik dolaşımdaki İnsülin benzeri peptidler tepki nöronal hücre sayıları izlemek, nöronlar, astrocyte-nöron laktat Servisi gibi trofik destek sağlamak ve ölen nöronlar fagositoz3,4 tarafından ortadan kaldırmak , 5 , 6. olgun NS glia BBB korumak, nörotransmitter kadar almak ve iyonik homeostazı korumak, NS, büyük bağışıklık hücreleri olarak hareket beri makrofajlar BBB ihlal ve sinirsel aktivite yanı sıra hayvan davranışları6 modüle , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Olup farklı gliyal alt türlerinden özel işlevleri gerçekleştirmek önemli bir açık soru kalır. Ancak, glia, özellikle, Yetişkin, sistematik bir genom geniş analizi uygun genetik araçlar onların manipülasyon için eksikliği ile engel olmuştur. Burada, cep şekilleri karmaşık hücre-hücre etkileşimleri çalışmaya verimli ve kolay karakterizasyonu sağlayan bir yöntem sunulur. Bu teknik yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden morfolojisi karakterize etmek için uygulanan, ancak kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlı olarak bu nöronların12,13 çalışmaya adapte , herhangi bir hücre birbirine karışmasının ve prensipte herhangi bir gelişim aşamalarında herhangi bir doku.

<table><tbody><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>Glass dissection dish</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Glass dissection plates</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>home made with charcoal</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 cell culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Primary antibody, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Secondary antibody, dilution 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Secondary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contact company for ordering</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for automated scanning</td></tr></tbody></table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Hücreler farklı türleri morfoloji ve karmaşık anatomik ilişkileri görüntüler. Hücreleri onların komşuları ile nasıl etkileşimde bulunur? Etkileşimleri hücre tipleri arasında ya da belirli bir türün içinde farklı mıdır? Ne tür uzamsal kuralları takip ettiler? Böyle temel soru vivo yanıtları defa yüksek çözünürlüklü tek hücre etiketleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Burada, bir çok renkli FlpOut (MCFO) tekniği ile tek hücreleri hedef için detaylı bir protokol sağlanır. Bu yöntem iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı sessiz tutulduğu üç farklı şekilde etiketlenmiş gazetecilere (HA, bayrak ve V5) UAS kontrol altında kullanır. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-dur-FRT kaset kaldıran bir ısı şok kaynaklı Flp recombinase, ifadesi indükler: ifade yalnızca aynı zamanda bir GAL4 sürücü hızlı hücrelerinde oluşur. Bu farklı renkli hücreleri tek hücre türleri Morfoloji görselleştirme sağlar yüksek çözünürlükte bir belli bir hücre türü bir dizi yol açar. Örnek olarak, MCFO teknik türleri Morfoloji yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden görselleştirmek için belirli gliyal GAL4 sürücüleri ile kombine edilebilir.

Bu bölümde yetişkin Drosophila beyinde MCFO tekniği kullanılarak elde sonuçları örnekleri gösterilmektedir. Şekil 3 yönteminin şematik gösterir. Üç farklı membran öğesini gazetecilere (en düşük myr-smGFP-HA, en düşük myr-smGFP-bayrak ve en düşük myr-smGFP-V5) UAS kontrol altında iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı tarafından sessiz tutulur. Isı şok na...

Watch this Scientific Journal Video about Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila at JoVE.com

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K Görüntüleme.  Ludwig-Maximilians-University Munich. Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.

Video: Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Nörobilim

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biyoloji

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler