Os autores agradecer Arnim Jenett Aljoscha Nern e outros membros do laboratório Rubin para aconselhamento e partilha de reagentes inéditos e Janelia voar luz equipe do projeto para a geração de imagens confocal. Os autores também agradecer aos membros do laboratório Gália para comentários sobre o manuscrito.

1. moscas preparando-se para experiências MultiColor FlpOut (MCFO) Nota: técnica de The MCFO refere-se a uma versão modificada da excisão de gaveta mediada por Flp parada chamado (FlpOut). Transgénicas MCFO moscas carregam um promotor de choque térmico (hsp)-recombinase Flp e repórteres diferentes sob UAS controlam. Cada repórter consiste de um backbone comum de um myristoylated (myr) super pasta verde proteína fluorescente (sfGFP), no quais 10 cópias de uma marca de epítopo (EG., HA, bandeira ou V5) foram inseridos. As proteínas não-fluorescente resultantes são nomeadas &#34; monstro de espaguete GFPs &#34; (smGFPs) 14 e podem ser detectados usando anticorpos específicos contra as tags epítopo diferente.
<ol><li>Cruz voa com o hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) e a gaveta MCFO para as glia GAL4 motorista linhas apropriadas (veja a tabela de materiais) .
	<ol><li>Como o hsp já está ativo a 25 ° C e poucas células podem sofrer recombinação, levando a uma rotulagem inespecíficos, configurar cruzes a 18 ° C para evitar a leakiness do sistema. Espere cerca de 20 dias a 18 ° C para obter a geração F1. Após o calor choque (consulte a etapa 2), manter as moscas a 25 ° C ( Figura 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Choque de calor Nota: dependendo do local de inserção, a eficiência de hsp-Flp pode diferir; portanto, o tempo de choque do calor ideal tem que ser otimizado. Para este protocolo, foi usado um estoque de mosca MCFO no qual o hsp-Flp foi inserido no cromossomo X (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Transferência a descendência da Cruz na etapa 1.1 (moscas de geração F1, 3-4 dias de idade) em novos frascos contendo alimento e calor chocá-los a 37 ° C em banho-maria. 
	Nota: O jovens moscas (1-2 dias de idade) são muito sensíveis ao choque térmico. Espere 1 ou 2 dias antes de realizar o choque térmico a fim de reduzir a mortalidade causada pelo tratamento. Uso alguns da geração F1 voa como um controle, sem choque térmico.</li>
	<li>Durante o choque de calor, manter moscas em frascos normais com alimentos para diminuir a taxa de mortalidade induzida por estresse. Coloque as fêmeas e os machos em frascos separados.</li>
	<li>Certifique-se de mergulhar o frasco inteiro na água, certifique-se de um choque de calor homogêneo. Use um choque de 5-8 min como ponto de partida adequado para a rotulagem esparsas de células da glia com muitas linhas de motorista GAL4; a duração do choque deve ser otimizada para cada motorista e experiência (tempos de choque de calor mais curtos ou mais longos podem ser necessários).</li>
	<li>Após o choque de calor, colocar os frascos horizontalmente no banco por alguns minutos para permitir que as moscas para se recuperar do choque e calor. 
	Nota: Não é necessário mudar os frascos.</li>
	<li>Manter as moscas a 25 ° C e dissecar (consulte a etapa 3 e 4)-2 ou mais dias após o choque do calor para expressão ideal repórter.</li>
</ol> 3. Preparação de dissecação e soluções <ol><li>o dia da dissecação, preparar solução fresca de fixador em 200 tubos PCR µ l misturando 180 µ l de meio de cultura celular S2 com 20 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) para obter uma solução PFA de 2%. Manter a solução fixador no gelo antes e durante a dissecção. 
	Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. 
	Nota: Misturar 160 µ l de meio de cultura celular S2 com 40 µ l de 20% paraformaldeído (PFA) em um tubo de 200 µ l do PCR para preparar uma solução PFA 4% em vez de uma solução de 2%.</li>
	<li>Usar um tubo de PCR por genótipo com um máximo de 8-10 cérebros pelo tubo para obter melhores resultados de coloração.</li>
	<li>Prepara o cérebro adulto solução de lavagem: albumina de soro bovino 0,5%, 0,5% Triton X-100 em PBS. 
	Nota: Dependendo da mancha, uma solução que contém 1% Triton X-100 pode ser necessários. Uma maior concentração de Triton X-100 aumenta a penetração do anticorpo nos tecidos e é necessário para as regiões de mancha que jazem profundamente dentro do tecido (por exemplo, regiões de sináptica no cérebro adulto Drosophila).</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio: soro de cabra normal de 3%, 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em PBS.</li>
	<li>o cérebro de um adulto lavar a solução e a solução de bloqueio pode ser armazenado a 4 ° C por algumas semanas.</li>
	<li>Colocar a placa de vidro de poços de depressão profunda no gelo e encha cada um bem com as seguintes soluções: uma com etanol a 70%, um com PBS e outra com meio de cultura celular S2.</li>
</ol> 4. Adulto dissecação cerebral <ol><li>posicionar um 3cm dissecando o prato no palco de um estereomicroscópio e preenchê-lo com meio de cultura celular S2 frio. Realizar todas as dissecções neste meio para garantir que o tecido permaneça saudável durante o processo de dissecação. 
	Nota: Use um dissecação prato forrado com vários milímetros de silicone preto que fornece um contraste de bons antecedentes (nas imagens) e preservar a pinça durante a dissecção.</li>
	<li>Anestesiar as moscas do genótipo desejado com CO 2.</li>
	<li>Com fórceps, pegue a voar pelas asas e lave-o em álcool etílico frio de 70% por 30 s, então com PBS frio para adicional de 30 s.</li>
	<li>Transferir a mosca para a bem de depressão profunda que é preenchida com meio de cultura celular S2.</li>
	<li>Repita o mesmo procedimento para todas as moscas com o mesmo genótipo e mantê-las em meio de cultura celular S2 frio até dissection, que vai preservar o tecido. 
	Nota: Anestesiar apenas o número de moscas que pode ser dissecado em um período de cerca de 30 min. longos períodos de incubação em meio de cultura celular S2 pode danificar o tecido.</li>
	<li>Pegar mosca com fórceps e, sob um estereomicroscópio, submergir a voar em meio de cultura celular S2.</li>
	<li>Separar a cabeça do resto do corpo. Descartar o corpo e manter a cabeça submergida em meio de cultura celular de S2. É extremamente importante manter a cabeça com fórceps para toda a duração da dissecação. Se a cabeça começa a flutuar, será difícil para recuperá-lo sem danificar o tecido.</li>
	<li>Começar a dissecação por arrancar um olho, enquanto segura a cabeça pelo menos um fórceps em todos os momentos. Certifique-se de que a ponta da pinça é logo abaixo da retina para evitar danificar o tecido por baixo. Puxe para fora o outro olho e começar a remover a cutícula, até o cérebro aparece.</li>
	<li>Remover todo tecido traqueal e cutícula ao redor do cérebro até o tecido parece limpo. Certifique-se de remover todo o tecido traqueal em torno do cérebro para obter melhores resultados de coloração; os tecidos agora estão prontos para ser corrigido e manchada.</li>
	<li>Manter o meio de cultura de células de todos os cérebros dissecados em S2 frio antes de transferi-los para a solução PFA fim de vez a etapa de fixação.</li>
</ol> 5. Cérebro adulto de coloração < ol> <li>Transferir o cérebro isolado com uma pipeta de P10 para a solução PFA em temperatura ambiente (RT). Para evitar danos aos tecidos, nunca use fórceps para transferir o cérebro após a dissecação. Executar todas as etapas em 200 µ l cadeia da polimerase em um nutator.</li>
	<li>Para todas as etapas, antes de eliminar a velha solução com uma pipeta P200, permitir que o cérebro resolver na parte inferior do tubo. Tente remover o sobrenadante sem aspiração do tecido. Proteger o tecido da exposição à luz.</li>
	<li>Consertar o cérebro em 200 µ l de 2% PFA em meio de cultura celular S2 por 1h ou em 4% PFA durante 30 minutos. Manter os tempos de fixação idêntico entre as amostras a fim de aumentar a reprodutibilidade.</li>
	<li>Depois de 3 (ou mais) lava de 15 minutos cada em 200 µ l de solução, de lavagem de cérebro adulto bloquear os tecidos com 200 µ l de solução de bloqueio por 30 minutos. Tempos de incubação mais em solução de bloqueio são possíveis.</li>
	<li>Incubar o cérebro durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem em um volume total de 200 µ l. 
	Nota: Os tempos de incubação podem variar dependendo do tipo de anticorpo usado. Incubação do tempo pode ser necessária.
	<ol><li>Para a rotulagem dos três marcadores MCFO, incubar o cérebro com anti-HA (1: 500), anti-FLAG (epítopo DYKDDDDK) (1: 100) e os anticorpos primários de anti-V5.</li>
		Anticorpos conjugados diretamente de <li>primária poderiam ser usados em vez da combinação normal primária + secundária (ex., anti-549 V5:DyLight (1: 200)). Neste caso, tratar os anticorpos conjugados diretamente como anticorpos secundários. 
		Nota: Para cada genótipo, manter um pouco de cérebro como controles para verificar a especificidade da coloração. Pular a incubação do anticorpo primário e ir diretamente para a próxima etapa.</li>
	</ol></li> <li>Lavar os tecidos 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de cérebro de um adulto (passo 3.3) de solução de lavagem e incube-os com fluoróforo-conjugados/primário diretamente conjugada com anticorpos secundários diluídos no cérebro adulto, solução de lavagem durante a noite em 4 ° C ou para 4h no RT, em um volume total de 200 µ l Nota: exemplos de anticorpos apropriados: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-549 V5:DyLight (1: 200) e DyLight 647 (1: 100)-conjugados anticorpos.</li>
	<li>Lavar o cérebro 3 vezes durante 1 h em 200 µ l de solução, seguida por uma lavagem final em 200 µ l de PBS durante a noite a 4 ° C ou para 1-2 h em RT de lavagem de cérebro adulto; a etapa de lavagem final em PBS remove quaisquer vestígios de Triton X-100 e é necessária para óptimos resultados de coloração. Montar o cérebro no meio de montagem com um agente antidesvanece-se em lamelas de vidro.</li>
</ol> 6. Montagem de cérebros para a imagem latente espaçador <ol><li>Trim uma imagem para o tamanho adequado, com uma tesoura. Para a microscopia de alta resolução, sanduíche do espaçador de espécime e imagem latente entre as lamelas de vidro dois. 
	Nota: Imagem latente de espaçadores é fina (0,12 mm de espessura) adesivos espaçadores que descascam e grudar lâminas lamelas ou microscópio, permitindo a montagem de espécimes sem compressão.</li>
	<li>Usando fórceps, remova o revestimento adesivo de um piso e aplicar o espaçador, o lado adesivo para baixo, sobre a superfície de uma lamela de vidro (22 x 60 mm). Aplicar 10 µ l de meio de montagem a uma lamela de vidro novo.</li>
	<li>Com um P10 pipeta, transferir o cérebro de tubo de 200 µ l para a lamela, junto à gota de meio de montagem. Juntamente com os tecidos, transferir alguns PBS para manter o cérebro em solução.</li>
	<li>Com um P10 pipeta, mover o cérebro da PBS para a gota de meio de montagem a tentar limitar a quantidade de PBS. Transferi as amostras em meio de montagem a lamela com o espaçador de imagem. Use bastante meios de montagem para cobrir o espécime.</li>
	<li>Remover o outro revestimento adesivo do lado superior do espaçador e adicionar uma lamela de vidro em cima dos espécimes. Com a ponta de uma pinça, aplique uma ligeira pressão sobre a área adesiva para selar. A imagem montados tecidos imediatamente ou armazenar os slides a-20 ° C para posterior análise.</li>
</ol> 7. Aquisição de imagem <ol><li>adquirir pilhas de imagens confocal de fluorescência usando um microscópio confocal com um 40 X (at = 1.2, imersão de água) objectivo ou 63 X (nd = 1,4, imersão de óleo) objectivo (tamanho do pixel = 1.024 x 1.024 no plano XY; Distância entre duas seções confocal = 0,5 µm). Ajustar o ganho do detetor e deslocamento em cada canal de forma que nenhum pixels saturados e valores zero pixel estão presente nas imagens; Isto evita a perda de informações e garante o uso da gama dinâmica plena do detector. 
	Nota: Desde que a imagem em 3D é demorada, as medições podem ser automatizadas pela verificação de amostras múltiplas em paralelo em diferentes locais. Para evitar a evaporação, com o objectivo de imersão de água, usar meio de imersão de óleo especial com índice de refração n = 1,33.</li>
	<li>Processar as pilhas confocal para projeções de densidade máxima, alterações na matiz de canal e ajuste de brilho e contraste usando qualquer software de análise de imagem padrão (veja a Tabela de materiais).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates.">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li><li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila.">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li><li>Corty, M. M., Freeman, M. 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L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Brainbow:+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns.">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li><li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flybow:+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster.">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li><li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. 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Nenhum dos autores tem interesses concorrentes ou conflitantes.

Este protocolo descreve um método fácil e eficiente para estudar a morfologia dos diferentes tipos de células dentro de um tecido de interesse em alta resolução. Com a técnica MCFO, vários repórteres com epítopo diferente tags são usados em combinação para a rotulagem estocástico multicolor (Figura 2). Semelhante a outros métodos, como Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO aumenta a diversidad...

Glia, a população de células não-neuronais do sistema nervoso (NS), foram por muito tempo acreditou que fornecem uma estrutura estática de neurônios e, portanto, não foram estudados em detalhe. No entanto, em humanos, glia constituem a grande maioria das células no NS (~ 90%) e caem em várias categorias diferentes, incluindo astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e células de Schwann. Em Drosophila, glia constituem cerca de 10% das células da NS. Curiosamente, suas morfologias e funções são muito semelhantes aos encontrados em vertebrados1,2. Suas morfologias incluem a barreira hemato - encefálica (BBB) formando epitélios, ensheathing e células astrocyte.
O sistema nervoso central de Drosophila (CNS) é composto das seguintes estruturas principais: regiões do córtex que contêm os corpos celulares neuronais; neuropils que abrigar conexões sinápticas; intervalos de axônio de pequenos e grandes que se conectar a diferentes neuropiles; nervos periféricos que conectam os músculos e órgãos sensoriais com o CNS (Figura 1). Glia encontram-se associados com todas estas estruturas anatômicas: glia Cortex (CG) nas regiões corticais, como astrocyte glia (AIG) e ensheathing glia (EG) nas regiões neuropile, ensheathing glia também estão associados com intervalos de axônio central e periférico nervos (EGN) e finalmente, duas folha-como glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), que juntos formam uma camada contígua que cobre o NS inteiro (Figura 2).
Estudos anteriores mostraram que glia desempenham papéis importantes no desenvolvimento do NS; monitorar os números de celular neuronal por reagir a circula sistemicamente insulin-como peptides, fornecem suporte trófico para os neurônios, tais como o transporte do lactato astrocyte-neurônio e eliminar os neurônios morrendo por fagocitose3,4 , 5 , 6. no NS maduro, glia manter o BBB, ocupam os neurotransmissores e manter a homeostase iónica, atuam como as principais células do sistema imunológico da ns, desde que os macrófagos não podem violar o BBB e modulam a atividade sináptica, bem como comportamento animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Se os diferentes subtipos gliais executam funções especializadas permanece uma importante questão em aberto. No entanto, uma análise sistemática de todo o genoma da glia, especialmente no adulto, é dificultada pela falta de ferramentas genéticas adequadas para sua manipulação. Aqui, um método que permite a caracterização eficiente e fácil de formas de célula para estudar interações célula-célula complexo é apresentado. Esta técnica foi aplicada para caracterizar a morfologia dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto Drosophila , mas, dependendo do driver específico GAL4 usado, isso poderia ser adaptado para estudar neurônios12,13 , qualquer tipo de entrelaçamento de células e em princípio qualquer tecido em qualquer fase do desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>Water bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting dish 30 mm x 12 mmm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-30</td><td>Glass dissection dish</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Glass dissection plates</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>home made with charcoal</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 cell culture medium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit HA-tag</td><td>Cell Signaling</td><td>C29F4</td><td>Primary antibody, dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rat FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Mouse V5-tag:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Conjugated antibody, dilution 1:200</td></tr><tr><td>anti-rabbit AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Secondary antibody, dilution 1:250</td></tr><tr><td>anti-rat DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Secondary antibody, dilution 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Contact company for ordering</td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Microscope, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 driver</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Image J)</td><td></td><td></td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software for automated scanning</td></tr></tbody></table>

application of multicolor flpout technique to study high resolution single cell morphologies and cell interactions of glia in drosophila

Células exibem morfologias diferentes e complexas relações anatômicas. Como as células interagem com seus vizinhos? Que as interações diferem entre tipos de células, ou mesmo dentro de um determinado tipo? Quais os tipos de regras espaciais que eles seguem? As respostas a essas perguntas fundamentais na vivo foram dificultadas até agora por falta de ferramentas para a rotulagem de célula única de alta resolução. Aqui, um protocolo detalhado para atingir células única com uma técnica de FlpOut MultiColor (MCFO) é fornecido. Esse método se baseia em três diferentemente marcados repórteres (HA, bandeira e V5) sob controle UAS que são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de um calor induzida por choque Flp recombinase, que aleatoriamente elimina as fitas FRT-FRT-paragem em células individuais: expressão ocorre apenas em células que expressam também um driver GAL4. Isto leva a uma matriz de cores diferentes células de um tipo de célula dado que permite a visualização da morfologia das células individuais em alta resolução. Como exemplo, a técnica MCFO pode ser combinada com drivers de GAL4 gliais específicos para visualizar as morfologias dos diferentes subtipos gliais no cérebro adulto drosófila .

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a técnica MCFO no cérebro adulto drosófila . A Figura 3 mostra um esquema do método. Três diferentemente a membrana-tag repórteres (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-bandeira e myr-smGFP-V5) sob controle UAS são mantidos em silêncio por um terminador transcricional ladeado por dois sites FRT (FRT-paragem-FRT). Uma onda de choque do calor induz a expressão de re...

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

Aplicação de técnica de FlpOut MultiColor para estudar a alta resolução única célula morfologias e interações de células da Glia em Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

8.1K visualizações.  Ludwig-Maximilians-University Munich. Células exibir diferentes morfologias e estabelecer uma variedade de interações com seus vizinhos. Este protocolo descreve como para revelar a morfologia das células únicas e para investigar a interação célula-célula, usando o sistema de expressão Gal4/UAS bem estabelecido.

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Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociência

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biologia

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Imagens ao vivo da migração das células da glia no Disco Drosophila Eye Imaginal

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ within a given tissue remain limited. The EASI-FISH protocol described here has been adapted to detect the expression of dozens of genes in the intact adult Drosophila central nervous system (CNS) using commercially available reagents. This protocol includes a new gel formulation that enhances gel robustness, enabling multiple rounds of hybridization and allowing the embedding of multiple brains per gel. This improvement increases throughput, facilitates optimal comparison of experimental conditions, and reduces reagent costs. Additionally, by employing the GAL4-UAS system for co-detection of green fluorescent protein (GFP), gene expression can be visualized in specific neuronal or glial cell types. Notably, the high resolution achieved through expansion microscopy, combined with the sensitivity of the method, allows for the detection of single RNA transcripts. This approach effectively integrates high image quality with high throughput, making it a powerful tool for studying gene expression throughout the intact fly brain.

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) is a robust technique that combines expansion microscopy with fluorescence in situ hybridization (FISH) to detect the expression of multiple genes in thick tissue. This protocol outlines recent advancements in the method and its adaptation for labeling the intact Drosophila central nervous system..

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...