Name: harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Maximilian Boesch, Avusturya Bilim Fonu FWF (hibe numarası J-3807) bir Erwin Schrödinger Kardeşliği tarafından desteklenmektedir.

Bu protokol, standart Kurumsal Etik Değerlendirme Kurulu yönergelerine tamamen uygundur. Burada gösterilen protokol kullanılarak insan veya hayvan dokusu araştırılırsa, araştırmacılar kendi kurumlarının veya ülkelerinin ilgili inceleme kurullarından onay almakla yükümlüdürler. Dikkat: Biyolojik örneklerin güvenli bir şekilde taşınması için standart önlemler bu protokol için geçerlidir. Buna eldiven ve laboratuvar ceketi giymeyi ve mümkün olduğunda biyogüvenlik kabini altında çalışmayı da kapsar. 1. Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> Kanser hücre dizileri <ol><li> Uygun bir insan veya fare kanseri hücre hattını, 10-30 mL uygun ortamda ( örn. ,% 10 ( h / h ) FBS, 2 mM L-glutamin ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş RPMI 1640) 37 ° C&#39;de kültürleyin ve hasat edin % 0.05 tripsin-EDTA veya başka bir de-att ile sindirimi kullanarak alt konfluenttaki hücreler ( yani % 70-90)Renklendirme prosedürü. Hücre sayısını belirleyin ve bir sayım odası ve tripan mavisi boyaması kullanarak canlılığı kontrol edin. Canlı hücrelerin fraksiyonu% 85&#39;i aşmalıdır. NOT: SP bölmelerini barındıran insan kanser hücre dizilerinin örnekleri MCF7 / HTB-22 ve SKBR3 / HTB-30 (göğüs kanseri), A2780 ve SKOV-3 / HTB-77 (yumurtalık kanseri) ve A549 (akciğer kanseri) 26&#39;yı içerir. </li></ol></li><li> Ex vivo tümör dokusu <ol><li> Yeni bir cerrahi tümör örneği alın veya alternatif olarak, nakledilebilen veya genetik olarak tasarlanmış fare tümörü modelinden tümör dokusunu toplayın. 200-1000 mg dokuyu alın ve mekanik ayrıştırma ( örn. , Makas veya bisturi kullanarak) ve enzimatik sindirime ( örn. , Bir kollajenaz / dispase / DNaz kokteyl kullanarak) tek bir hücre süspansiyonu üretin. </li><li> Numuneyi 70 μm&#39;lik bir kesme süzgeci ile süzün. Hücre sayısını belirleyin ve bir sayma odası ve trypan bl kullanarak canlılığı kontrol edinUe boyama. NOT: Sindirim kokteylleri sıklıkla 200 μg / mL kollajenaz P, 0.8 U / mL dispaz ve 25 ug / mL DNase I içerir ve inkübasyon süreleri tipik olarak 20 - 50 dakika arasında değişir. İdeal olarak, doku parçalanması, araştırılan doku için optimize edilmiş bir protokole göre gerçekleştirilir 27,28,29. </li></ol></li></ol> 2. Test Örnekleri <ol><li> Hücre konsantrasyonunu, taze kültür ortamında 1 x 10 6 hücre / mL&#39;ye ayarlayın (boya ekstrüzyonu aktif bir enerji tüketen işlem olduğundan, besin maddesi içeren bir araç önemlidir). Son olarak, 1 mL numuneyi sıradan bir akış sitometrisi / FACS yuvarlak tabanlı tüpe (&#39;test&#39; etiketli) aktarın. NOT: En iyi sonuç için, hücre konsantrasyonunun titrasyona tabi tutulması gerekebilir (örneğin 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2.5 x 10 6 hücre / mL) fakat daha düşük bir hücre konsantrasyonu genelDaha yüksek çözünürlük 19 verir. Sadece maksimum sayıda SP hücresi bulunacağı uygulamaların sınıflandırılması için hücre yoğunluğunu 1 x 107 hücre / mL&#39;ye yükseltmek önerilir. </li><li> Numuneye 10 uM DCV ekleyin ve hafifçe vorteksleme veya 3-5x yeniden süspansiyon ile iyice karıştırın. İnhibisyon kontrollerine geçin. NOT: Optimal sonuçlar, tetikleyici boyanın titrasyonuna (örneğin 2,5; 5; 10; 20 μM) bağlı olabilir, ancak daha yüksek bir boya konsantrasyonu genellikle daha yüksek bir çözünürlük 19 verir. </li></ol> 3. İnhibisyon Kontrolleri <ol><li> Boya içeren hücre süspansiyonundan 250 μL yeni bir akış sitometresi / FACS yuvarlak tabanlı tüp (&#39;kontrol&#39; etiketli) aktarın. Verapamil veya 50 μM FTC ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın. NOT: Verapamil ve FTC, SP analizinde en iyi bilinen inhibitörlerdir, ancak farklı efflux pompa özelliklerine sahiptirlerY: Verapamil, ABCB1 ve ABCB5 de dahil olmak üzere birçok ABC ilaç taşıyıcısını inhibe ederken, FTC ABCG2 6 , 19 için spesifiktir. Tek bir numunenin SP durumu bilinmiyorsa, ayrı tüplerde verapamil ve FTC&#39;nin kullanılması önerilir. </li></ol> 4. Boyama <ol><li> Hem &#39;test&#39; hem de &quot;kontrol&quot; tüplerini kaplayın ve 15 dakikada karıştırmayla yavaş yavaş karanlıkta 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. SP hücrelerindeki boya ekstrüzyonunun çoğu ilk 45 dakikada gerçekleşir, ancak SP olmayan hücrelerdeki boya birikimi (çözünürlüğe katkıda bulunur) yalnızca 75-90 dakika sonra maksimumdır19. </li><li> Boyama tamamlandıktan sonra, hücreleri 3-4 mL buz soğukluğunda PBS içinde yıkayın ve 100 ul (PBS) hacmindeki pelleti tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreleri karanlıkta tutun ve buz üzerinde soğutun ve ek belirteçlerin boyanmasına devam edin. Alternatif olarak, doğrudan akış sitometrisierimesi görülmüştür. </li></ol> 5. Diğer İşaretçiler İçin Maliyetlendirme <ol><li> DCV lekeli hücrelere fluorokrom-konjuge antikorlar istenen bir panel ekleyin, iyice karıştırın ve hücreleri 4 ° C&#39;de 20-30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin. Hücreleri 3-4 mL buz soğukluğundaki PBS&#39;de yıkayın ve ölü hücre ayrımcılığına geçin. NOT: DCV ile kolayca uyumlu ve neredeyse tazminat gerektirmeyen antikor formatları arasında PerCP veya PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 ve BV786 bulunur . DCV ile uyumlu ancak telafi gerektirebilecek formatlar arasında FITC, Alexa Fluor 488, PE ve BV650 bulunur. DCV ile hemen hemen uyumlu olmayan formatlar BV421, V450 ve V500&#39;ü içerir. </li><li> DCV lekeli hücrelere, belirli üreticinin önerdiği konsantrasyonda 7-AAD (veya PI) ekleyin ve örnekleri karanlıkta 5-10 dakika inkübe edin. Örnekleri 70 μm&#39;lik kesme süzgeçleri yoluyla filtreleyin ve akış sitometrik analizlere geçin.</li></ol> 6. Akış Sitometrik Analizi NOT: Lekeleme işlemi sırasında ilgili akış sitometrini açmanız önerilir, böylece her şey örnek hazırlanır hazırlanır ayarlanır. Buna, sistem performans takibi ve tank dolum gibi standart bakım prosedürleri dahildir. <ol><li> Akış sitometresindeki hücreleri elde edin ve bunları iki değişkenli FSC / SSC nokta arsa üzerinde (Şekil 1B) kaplatın. FSC&#39;nin farklı sinyallerini ( yani yükseklik, genişlik, alan) karşılaştırarak çiftler ve agregaları hariç tutun (Şekil 1C). <ol><li> Ölü bir hücre işaretçisi dahil edilmişse canlı hücre fraksiyonuna geçin ( ör . 7-AAD-negatif) ( Şekil 1D ). &#39;Mavi&#39; ve &#39;kırmızı&#39; DCV emisyonu için iki değişkenli nokta arsa üzerinde canlı tekli hücreleri görselleştirin. Bu amaçla, y ekseni üzerinde ( örneğin , 450/50) &#39;mavi&#39; floresans kanalını ve &#39;Kırmızı &#39;floresans kanalı ( örn. , 525/50). </li><li> Her iki kanalı doğrusal moda geçirin ve SP, sol alt çeyrekte arsa tarafına yerleşecek şekilde dedektör voltajlarını buna göre ayarlayın. Tersine, SP olmayan hücre döngüsü dağılımını (G1 ve G2) yansıtan arsa sağ üst çeyrekte bulur. SP&#39;yi kaplatın ve edinimi durdurun ( Şekil 1E ). NOT: DCV tanımlı SP hücreleri, mor bir lazer uyarma kaynağı ( yani , 405 nm lazer hattı) ile donatılmış akış sitometrik aletler kullanılarak tespit edilebilir. SP analizinden spesifik olan, yayılan floresansın lineer modda ve iki değişkenli nokta arsa üzerinde görüntülenen iki ayrı kanalda ölçülmesidir. DCV&#39;nin &#39;mavi&#39; emisyonu yaklaşık 450 nm&#39;de ölçülür ( örn. , Bir 450/40 standart filtre ile) ve DCV&#39;nin &#39;kırmızı&#39; emisyonu yaklaşık 510 - 585 nm&#39;de ölçülür ( örn. , Bir 510/50, bir 525/50 veya 585/15 filtre) 19 . Analizin özel kimyası nedeniyle, SP ve non-SP hücreleri arasındaki ayrım genelde &#39;kırmızı&#39; floresan kanalı 19&#39;da daha yüksektir. </li></ol></li><li> Engelleme kontrollerini yükleyin ve verileri alın. SP hücreleri şimdi ortadan kayboldu ya da büyük oranda azaltıldı ( Şekil 1F ). Gerekirse, bu verilere dayalı olarak SP kapısını rafine edin. </li><li> SP hücreleri tarafından yüzey markörü ekspresyonunu araştırmak için DCV&#39;nin &#39;kırmızı&#39; floresanını x ekseni üzerine bırakın ve logaritmik modda ( örn . APC) y ekseni üzerinde ilgili bir flüoresan kanalı gösterin. Dedektör voltajlarını buna göre ayarlayın ve araştırılan markör (ler) için pozitif boyanan SP hücrelerinin fraksiyonunu ( Şekil 1G ) kaplatın. SP hücreleri tarafından belirli bir işaretleyicinin birlikte ekspresyonu, arsa 30&#39;un sol üst kadranda ilgili bir sinyal verir. </li><li> KaydetmekSP hücrelerini veri ve / veya sıralayabilirsiniz. </li></ol>

<ol>
	<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose?.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells:+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche.">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness.">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li><li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., G&#246;tte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation.">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li><li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase:+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform.">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+&amp;#34;side+population&amp;#34;+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct &amp;#34;side population&amp;#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics.">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li><li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations.">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li><li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate.">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li><li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem/progenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1.">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage.">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li><li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN/PI3K/Akt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells.">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li><li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma.">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li><li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells/cancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas.">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li><li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype.">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).</li><li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells.">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics.">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li><li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population.">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines.">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li><li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry.">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532 (2015).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633 (2011).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein.">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3,+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3.">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li></ol>

Yazarların beyan etmek için çıkar çatışması yoktur. Yazının hazırlanmasına yazarın da katkısı yok.

Kanserin klinik yönetimindeki ilerleme, CSC&#39;leri hedef alan tedavi yöntemlerinin gelişimine bağlıdır. CSC&#39;lerin biyolojik numunelerden güvenilir şekilde izole edilmesine izin veren yöntemler, uygun hedeflerin belirlenmesini hızlandıracak ve bu nedenle bu çabanın kritik önemi altındadır. SP analizi, ABC ilaç taşıyıcılarını ifade eden CSC popülasyonlarını tanımlamak için kurulmuş ve değerli bir tekniktir ve DCV&#39;nin uygulanması, standart akış sitometrik araçlarına uygulanabili...

Primer kanser terapilerinin etkinliği, hastalığın genetik ve moleküler anlayışındaki gelişen ilerlemeler ve terapötik antikorlar ve küçük molekül inhibitörleri gibi hedefli ilaçların ortaya çıkması nedeniyle son on yılda önemli ölçüde iyileşmiştir. Aksine, metastatik ve tekrarlayan hastalık halen tedavi edilemez durumdadır ve morbidite ve mortalite bu klinik ortamlarda yüksek kalmaya devam etmektedir. CSC&#39;ler tümörler içinde ayrı bir alt popülasyonu temsil eder ve klonojenisite / tümöre özdeşlik, çoklu ilaç direnci ve asimetrik hücre bölünmesi 1 , 2 gibi kanonik kök hücre özellikleri ile donatılırlar. Böylelikle, KKSler metastatik ilerlemeyi ve tümör heterojenliğini yönlendirmekle kalmaz aynı zamanda hastayı nüksetmeye yatkınlaştırmak için tedavi sırasında da devam eder. Terapötik CSC eliminasyonu, hastalık tekrarını önlemek ve kanserin uzun süreli iyileşmesine izin vermek için önemli tıbbi bir ihtiyaçtır 3 </sup&gt;. Koruma açığının tanımlanması ve CSC&#39;lerin ortadan kaldırılması için stratejilerin aydınlatılması, sonraki ekspresyon profillemesi ve / veya fonksiyonel inceleme için biyolojik numunelerden arındırılmalarına izin veren yöntemlere bağlıdır. Bunun gibi yöntemler, bu hücrelere özgü yüzey, hücre içi veya işlevsel belirteçlere dayanır. CSC&#39;ye spesifik yüzey işaretleyiciler arasında CD44, CD133, CD24 ve CD90 bulunur ve bunlarla sınırlı olmamak üzere meme kanseri ve kolon kanseri de dahil olmak üzere çeşitli tümör varlıklarındaki CSC popülasyonlarını tanımlamak için kullanılırlar. Bir başka markör olan aldehit dehidrogenaz (ALDH), hücre içi lokalizasyonu gösterir ve enzimatik dönüşümü ışık üreten ilgili bir substrat sağlayarak fonksiyonel olarak tespit edilebilir. Bu testi kullanarak CSC popülasyonları çeşitli tümör varlıklarında da tespit edilmiştir 5 . Tamamlayıcı bir yöntem, genelde SP analizi olarak anılır ve burada m olarak tasvir edilir.<html> Etodolojik detay, 6 , 7 , 8 floresan-loş gövde benzeri hücrelerin küçük popülasyonlarını tanımlamak için ABC ilaç taşıyıcıları tarafından aktif boya akışı kullanmaktadır. Bunu sağlamak için belirli bir numune, pasif difüzyon yoluyla tüm hücrelere giren ve bağlanma için nükleer ve mitokondriyal DNA&#39;yı hedefleyen bir lipofilik DNA bağlama floroforunun mevcudiyetinde inkübe edilir. ABC ilâç taşıyıcısı ifadesi bulunmayan CSC&#39;ler boya biriktirerek parlak floresans oluştururken, CSC aktif olarak flüoresansı düşüren boyayı sıkıştırır. İlaç taşıyıcı aktivitesinin farmakolojik olarak inhibisyonu, SP fenotipini ortadan kaldırır ve işlevsel olarak teyit eder ve kontrol amaçlı kullanılmalıdır. SP özelliklerini sergileyen CSC popülasyonları diğerlerinin yanı sıra yumurtalık kanseri 9 , 10 , prostat kanseri 11 ,&gt; 12, meme kanseri 13 , akciğer kanseri 14 , endometriyal kanser 15 , gliom 16 , 17 ve kemik sarkomu 18 . Önemli bir şekilde, spesifik bir tümör hücresi ayrımcılık stratejisi (bazı konakçı hücre popülasyonları da SP özellikleri sergileyebilir) gibi birincil materyal ilave zorluklar ortaya koymasına rağmen, SP testi hem kanser hücre hatları hem de primer tümör dokusu ile uyumludur . En çok bilinen iki SP taşıyıcı ilaç taşıyıcısı ABCBl / P-glikoprotein / MDRl / CD243 ve ABCG2 / Bcrpl / CD338 8,9,21; Bununla birlikte, diğer ilaç taşıyıcıları SP fenotipinin de bir moleküler belirleyicisi olabilir ( örn. , ABCB5) 22 . ABCB1Verapamil ile etkin bir şekilde bloke edilebilirken, ABCG2&#39;nin aktivitesi fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 ile özel olarak kaldırılabilir. SP analizinin belirli bir gücü, diğer lekelenmelerle ( örneğin , yüzey markörleri ve ALDH) birlikte kullanılabilmesi ve canlı hücre geri kazanımının, bu nedenle aşağı akışlı fonksiyonel araştırmalarla uyumlu olmasını sağlamasıdır. Dahası, SP algılama CSC popülasyonları 9 , 23 arasında ABC ilaç taşıyıcılarının yüksek korunması nedeniyle genel olarak uygulanabilir. Başlangıçta, SP algılama, tetikleyici bir boya 24 olarak Hoechst 33342 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu boya mükemmel bir çözünürlük sağlar, ancak ultraviyole lazer uyarımını gerektirir; Dolayısıyla uygulanabilirliği doğal olarak ileri teknoloji akış sitometri aletleri ile sınırlıdır. DyeCycle Violet (DCV) 25&#39;in ortaya çıkışı yeni avenu açtı.Sp analizleri için geliştirilmiş ve ultraviyole lazer kaynağı olmayan standart akış sitometrik enstrümanlarına (DCV-SP hücrelerini çözmek için mor bir lazer kaynağı yeterlidir) uygulanabilirliğini genişletmiştir. Önemlisi, Hoechst 33342 ve DCV, ortak pompa özgüllüklerini paylaşır, bu da boyanın aynı hücre popülasyonlarını tanımlaması gerektiğini gösterir. Burada, bağımsız laboratuvarlarda hızlı ve kolay üreme için DCV&#39;ye dayalı SP analizinin ayrıntılı bir deneysel protokolünü sunuyoruz. Yazıyı, bu yararlı hücre biyolojik yönteminin optimizasyonuna ve standardizasyonuna katkıda bulunması gereken CSC araştırmacıları için bir kaynak olarak algılıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V35003</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>Dissolve in ethanol</td></tr><tr><td>Fumitremorgin C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>Dissolve in DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD (or propidium iodide - PI)</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Standard cell culture reagents (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sample/cells of interest (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Violet laser source required</td></tr><tr><td>FACS tubes (round-bottom)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Tubes with cap recommended</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cut-off strainers</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Optional but recommended</td></tr><tr><td>Digestion enzyme mix (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, collagenase/dispase/Dnase)</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Only relevant for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td><td>Different suppliers</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>01700</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

Kanser, kök hücre kaynaklı bir hastalıktır ve bu hücrelerin ortadan kaldırılması önemli bir terapötik hedeftir. Kanser Kök Hücrelerinin (CSC) zayıf yönlerinin çözülmesi ve uygun moleküler hedeflerin belirlenmesi, hücre çizgileri ve ex vivo tümör dokusu gibi heterojen örneklerde spesifik ayrımcılığa izin veren yöntemlere dayanmaktadır. Akış sitometrisi / FACS, tek hücreli seviyede biyolojik numuneleri çok parametrik olarak incelemek için güçlü bir teknolojidir ve aşağı akım analizleri için canlı hücrelerin geri kazanılması için seçilen yöntemdir. CD44 ve CD133 gibi yüzey markörlerinin yanı sıra aldehit dehidrogenaz enzimatik aktivitesinin saptanması, FACS tarafından tümör numunelerinden CSC&#39;lerin tanımlanması ve sınıflandırılması için sıklıkla kullanılmaktadır. Metodolojik detaylarda burada açıklanan tamamlayıcı bir yaklaşım, genellikle yan popülasyon (SP) olarak adlandırılan farklı floresan-dim hücrelerinin bir popülasyonunu tanımlayan ABC ilaç taşıyıcıları ile fonksiyonel boya ekstrüzyonunu kullanmaktadır. SPKanser hücreleri kanonik kök hücre özellikleri sergiler ve boya ekstrüzyon ilaç taşıyıcısını (en sık ABCBl / P-glikoprotein / MDR1 / CD243 ve ABCG2 / Bcrp1 / CD338) inhibe eden ajanlar kullanılarak yok edilebilir ve işlevsel olarak teyit edilebilir. Üstelik SP testi, yüzey antijenlerinin boyanması, aldehid dehidrogenaz tespiti ve ölü hücre ayrımcılığı ( örneğin , 7-AAD veya propidyum iyodür (PI)) gibi diğer akış sitometrik değerlendirmeleriyle uyumludur. Bu nedenle, mekanik olarak fenotipik bir parametreden ziyade işlevsel olan CSC tanımlama, izolasyon ve alt karakterizasyon için değerli ve geniş bir şekilde uygulanabilir bir yöntem tanımlıyoruz. Başlangıçta tetikleyici boya olarak Hoechst 33342 ile yapılmış olsa da, burada, mor renkli bir lazer kaynağı ile donatılmış herhangi bir akış sitometresinde çözülebilen daha yeni olan Violet boya dayalı SP fenotipine odaklanırız.

A2780 hücrelerinin temsili bir SP analizi, daha önce% 1&#39;den daha az hücrenin muhasebeleştirilmesi için bir SP&#39;yi barındırdığı gösterilen bir insan yumurtalık kanseri hücre hattının sağlanmasıdır 9 . Hücreler,% 10 ( h / h ) FBS, 2 mM L-glutamin ve 1 x penisilin / streptomis ile takviye edilmiş RPMI 1640 içinde 37 ° C&#39;de kültürlendi ve% 0.05&#39;lik tripsin-EDTA ile işleme tabi tutarak% 85 konfluansa hasat edildi. Hücre...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

harnessing-dna-dye-triggered-side-population-phenotype-to-detect

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

7.6K Görüntüleme.  Kantonsspital St. Gallen.  Kök hücre popülasyonlarının biyolojik örneklerden karakterize edilmesine ve izole edilmesine izin veren yöntemler, kanser ve ötesinde kök hücre hedefli tedavilerin ilerletilmesi için kritik önem taşır. Burada, boya tetiklemeli yan popülasyon fenotipini kullanarak kanser kök hücre izolasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. 

Video: Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Kanser Araştırmaları

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great significance for tumor research. Currently, several techniques are used for the identification and purification of CSCs from tumor tissues and tumor cell lines. Separation and analysis of side population (SP) cells are two of the commonly used methods. The methods rely on the ability of CSCs to rapidly expel fluorescent dyes, such as Hoechst 33342. The efflux of the dye is associated with the ATP-binding cassette (ABC) transporters and can be inhibited by ABC transporter inhibitors. Methods for staining cultured tumor cells with Hoechst 33342 and analyzing the proportion of their SP cells by flow cytometry are described. This assay is convenient, fast, and cost-effective. Data generated in this assay can contribute to a better understanding of the effect of genes or other extracellular and intracellular signals on the stemness properties of tumor cells.

A convenient, fast, and cost-effective method to measure the proportion of side population cells in solid tumor cell lines is presented.

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many studies in the last decades. Therefore, it is important to develop methods to investigate the role of key genes involved in cancer cell stemness. Gastric cancer (GC) is one of the most common and mortal types of cancers. Gastric cancer stem cells (GCSCs) are thought to be the root of gastric cancer relapse, metastasis and drug resistance. Understanding GCSCs&#160;biology is needed to advance the development of targeted therapies and eventually to reduce mortality among patients. In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

In this protocol, we present an experimental design using a conditional knockdown system and an adapted sphere formation assay to study the effect of clusterin on the stemness of patient-derived GCSCs. The protocol can be easily adapted to study both in vitro and in vivo function of stemness-associated genes in different types of CSCs.

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Tıp

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Kolay yan popülasyon hücresi tespiti için alternatif lazer uyarma yöntemi

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized for the isolation of stem cells based on the dye efflux properties of ATP-binding cassette (ABC) transporters. The method was initially employed for the identification and isolation of hematopoietic stem cells (HSCs), but it has now evolved to primarily focus on the identification and isolation of cancer stem cells (CSCs). The traditional detection method of FCM uses a 355 nm laser to excite the dye to detect SP cells. Through this study, we have successfully identified alternative approaches for dye excitation that can effectively replace the detection of SP cells using a 355 nm laser. This is achieved through the utilization of high-power 375 nm or 405 nm lasers. This allows us to exercise enhanced selectivity in the detection of SP cells rather than being solely limited to the 355 nm laser flow cytometry.

Yazar Spotlight: Yan Popülasyon Hücrelerini Analiz Etmek için Hoechst Boyama için Yenilikçi Lazer Teknikleri

Here, we show that high-power 375 nm and 405 nm lasers can effectively excite Hoechst 33342 and serve as a viable alternative to the 355 nm laser for side population (SP) cell detection, thereby expanding the range of available lasers in flow cytometry applications.

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Biyolojik Örneklerden Kanser Kök Hücrelerini Algılamak ve Arıtmak İçin DNA Boya Tarafından Tetiklenen Yan Populasyon Fenotipi Kullanmak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Solid Tümör Hücre Hatlarında Yan Popülasyon analizi

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu