Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Yazarlar, Howard Hughes Tıp Enstitüsünün Janelia Araştırma Kampüsü&#39;ndeki Genetik Olarak Kodlanmış Nöronal Gösterge ve Efekt (GENIE) Projesinden V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger ve K. Svoboda&#39;ya, AAV1-GCaMP6f&#39;nin cömert bağışlarından dolayı teşekkür etmek istiyorlar Pennsylvania Üniversitesi Vektörel Çekirdek. Ayrıca, konform mikroskopi hizmetleri için NIH NS069375 tarafından desteklenen Stanford Üniversitesi&#39;ndeki A. Olson ve Neuroscience Mikroskopi Çekirdeğine teşekkür etmek istiyorlar.

<ol>
	<li>McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+decision-making+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Development and decision-making in the mammalian cerebral cortex.</a> Brain Res. 472 (1), 1-23 (1988).</li><li>Kwon, S. E., Yang, H., Minamisawa, G., O'Connor, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+and+decision-related+activity+propagate+in+a+cortical+feedback+loop+during+touch+perception.">Sensory and decision-related activity propagate in a cortical feedback loop during touch perception.</a> Nat. Neurosci. 19 (9), 1243-1249 (2016).</li><li>Miller, E. K., Cohen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrative+theory+of+prefrontal+cortex+function.">An integrative theory of prefrontal cortex function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 167-202 (2001).</li><li>Bailey, M. R., Simpson, E. H., Balsam, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+underlying+effort,+time,+and+risk-based+decision+making+in+motivated+behavior.">Neural substrates underlying effort, time, and risk-based decision making in motivated behavior.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 133, 233-256 (2016).</li><li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward-dependent+learning+in+neuronal+networks+for+planning+and+decision+making.">Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making.</a> Prog. Brain Res. 126, 217-229 (2000).</li><li>Ferenczi, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+cortical+regulation+of+brainwide+circuit+dynamics+and+reward-related+behavior.">Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behavior.</a> Science. 351 (6268), aac9698 (2016).</li><li>Anomal, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Processing+in+the+Primary+Auditory+Cortex+of+an+Animal+Model+of+Autism.">Impaired Processing in the Primary Auditory Cortex of an Animal Model of Autism.</a> Front. Sys. Neurosci. 9, 158 (2015).</li><li>Pauls, D. L., Abramovitch, A., Rauch, S. L., Geller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obsessive-compulsive+disorder:+an+integrative+genetic+and+neurobiological+perspective.">Obsessive-compulsive disorder: an integrative genetic and neurobiological perspective.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (6), 410-424 (2014).</li><li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes.">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).</li><li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors.">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li><li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal.">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li><li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+speed+dependence+of+entorhinal+island+and+ocean+cells,+including+respective+grid+cells.">Distinct speed dependence of entorhinal island and ocean cells, including respective grid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (30), 9466-9471 (2015).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entorhinal+Cortical+Ocean+Cells+Encode+Specific+Contexts+and+Drive+Context-Specific+Fear+Memory.">Entorhinal Cortical Ocean Cells Encode Specific Contexts and Drive Context-Specific Fear Memory.</a> Neuron. 87 (6), 1317-1331 (2015).</li><li>Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Type-Specific+Activity+in+Prefrontal+Cortex+during+Goal-Directed+Behavior.">Cell-Type-Specific Activity in Prefrontal Cortex during Goal-Directed Behavior.</a> Neuron. 87 (2), 437-450 (2015).</li><li>Cox, J., Pinto, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+sleep-wake+related+neuronal+activity+in+the+dorsal+pons.">Calcium imaging of sleep-wake related neuronal activity in the dorsal pons.</a> Nat. Comm. 7, 10763 (2016).</li><li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cortical,+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses.">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nat. Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).</li><li>Hooks, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+cortical+and+thalamic+input+to+pyramidal+neurons+in+mouse+motor+cortex.">Organization of cortical and thalamic input to pyramidal neurons in mouse motor cortex.</a> The J. Neurosci. 33 (2), 748-760 (2013).</li><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task.">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nat. Neurosci. 17 (7), 987-994 (2014).</li><li>Rowland, D. C., Moser, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+cortical+modules+to+memories.">From cortical modules to memories.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 24 (1), 22-27 (2014).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat. Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).</li><li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice.">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat. Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+deep+cortical+layers+using+a+microprism.">In vivo imaging of deep cortical layers using a microprism.</a> J. Vis. Exp. (30), (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprisms+for+in+vivo+multilayer+cortical+imaging.">Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging.</a> J. Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).</li><li>Chia, T. H., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-layer+in+vivo+imaging+of+neocortex+using+a+microprism.">Multi-layer in vivo imaging of neocortex using a microprism.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (8), (2010).</li><li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures:+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex.">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Hawrylycz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+cortical+function+in+the+mouse+visual+system+through+large-scale+systems+neuroscience.">Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113 (27), 7337-7344 (2016).</li><li>Petrof, I., Viaene, A. N., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+primary+somatosensory+cortex+projection+to+the+primary+motor+cortex+in+the+mouse.">Properties of the primary somatosensory cortex projection to the primary motor cortex in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 113 (7), 2400-2407 (2015).</li><li>Aronoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+connectivity+of+mouse+primary+somatosensory+barrel+cortex.">Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex.</a> Euro. J. Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).</li><li>Rogan, S. C., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+signaling.">Remote control of neuronal signaling.</a> Pharma. Rev. 63 (2), 291-315 (2011).</li><li>Berdyyeva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zolpidem+reduces+hippocampal+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice:+a+large+scale+calcium+imaging+study+with+miniaturized+fluorescence+microscope.">Zolpidem reduces hippocampal neuronal activity in freely behaving mice: a large scale calcium imaging study with miniaturized fluorescence microscope.</a> PloS One. 9 (11), e112068 (2014).</li></ol>

Yazarlar, gazetenin politikasını okudular ve aşağıdaki rekabet uyuşmazlıklarına sahip oldular: SG, SO ve VC&#39;nin Inscopix&#39;te ücretli çalışanları var.

Uyanıklık davranışı sırasında nöral devre aktivitesini anlamak, sağlık ve hastalıkta beyin fonksiyonunu etkin bir şekilde incelemek için gerekli olan hayati bir nevrofizyolojik araştırmanın seviyesidir. Korteks uyanık davranış bağlamında çalışmak için özellikle önemli bir bölgedir çünkü birçok hayati duyu, bilişsel ve yürütücü işlevlerde önemli rol oynar 28 , 29 . Korteksin korteksdeki temel işlevsel birimi olduğu düşünülür ve kortikal hücrelerin popülasyon düzeyindeki aktivitelerinin sütundaki fiziksel konumlarına göre farklılık gösterdiği bilinir. Örneğin, somatosensoryal korteksteki katmanlardaki 2/3 katmanlı eksitatör nöronlar öncelikle diğer neokortikal bölgelere yönelir ve diğer korteks ağlarını 30 modüle eder, buna karşın daha derin tabakalardaki hücreler esas olarak talamus 31 gibi kortikal bölgelere yansıtılır. Yüz etkinliklerinin kaydedilmesiÖnceden belirlenmiş kortikal hücrelerin eş zamanlı olarak serbestçe davrandıklarında farklı lamina boyunca aynı anda ve güvenilir şekilde kortikal bilgi akışı konusundaki anlayışımızı ilerleteceğini ve kortikal sütunların gerçek zamanlı davranışsal bilgi ve görevle ilişkili zamana bağlı bilgi ile daha ince fonksiyonel diseksiyona izin verdiğini, ölçekler. Bu seviyedeki sinir devresi verilerini toplamak, serbestçe davranıyor konularda (veya istenen baş-sabit konular) büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemeyi gerçekleştirmek için etkin ve düzenli bir minyatür mikroskop platformu kullanılarak mümkün hale gelir. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri ile hücre tipi spesifik hedeflemeyi etkinleştirmek ve kronik implante edilmiş bir prizma probu tarafından sağlanan çok katmanlı bir görüş alanını görüntülerken kullanılan bu protokol, pek çok olası uygulama arasında bir vaka araştırmıştır: farelerde somatosensoriyel kortikal işlemedeki laminar farklılıkların gözlenmesi Fiziksel olarak yeni bir cisim ile etkileşimde bulunur ( Şekil 5 ).Bu, uyanıkken çoklu korteks tabakalarını çalışma özgürlüğü içinde davranan bu tür hücre tipine özgü, in vivo yaklaşımın ilk prosedürel örneğidir ve aktif beyindeki laminer yapıları anlamak için mevcut deneysel yöntemlerin spektrumunu genişletir. Bu tekniğin prizma probu tarafından sağlanan periskopik görüş alanı, doğrudan ilgi alanına doğru doku korunması istenildiğinde diğer beyin yapılarına uygulanabilir. Örneğin, CA3 görüntüleme, hipokampal fonksiyonun kesintiye uğramadan başarılabilir. Ca 2+ aktivitesini görüntüleme için Prism probuna dayalı yaklaşım, bir mikro prizmanın kortekse fiziksel olarak yerleştirilmesini ve kalıcı bir şekilde implantasyonunu gerektirir; bu, lens probunun yerleştirildiği bir kortikal lezyonun yaratılmasına denktir. Bu, apikal dendritlerin ve süreçlerin kesilmesi de dahil olmak üzere, lokal sinirsel devrelerde bozulmalara neden olabilir. TOnun prosedürü aynı zamanda bölgedeki glial hücrelerin ilk kez aktivasyonuna neden olur, ancak bunun prizma yüzünden yaklaşık 150 mikron dokuya lokalize edilmesi ve beynin iyileşmesi sonrasında düşmesi beklenir22. Deney planlanırken bu tekniğin normal devre anatomisini ve / veya hayvanların davranışını etkileyip etkilemeyeceğini düşünmek çok önemlidir. Davranışsal kontrol grupları her zaman karıştırılarak deneysel sonuç üretebilecek temel davranışlarda önemli bir değişiklik olmadığından emin olunması için yürütülmelidir. Sinirsel farmakolojik manipülasyona sahip bu minyatür mobil Ca 2+ görüntüleme tekniğini, çeşitli bilişsel, sosyal, motor veya intrinsik davranış parametrelerini kullanarak ve diğer fizyolojik ölçümlerle birleştirerek sinirsel devrelerin davranış ve sinyaldeki işlevsel rollerini anlamaya odaklanan çalışmaları derinleştirebilir ve zenginleştirebilir Işleme 32 . Bastırma veya aktiviteİlaçlar tarafından modüle edilen bazı yolların ationu, bu teknolojiyi kullanarak kolayca incelenebilen ilişkili davranışları etkileyebilir 33 . Kalsiyum göstergesinin hedeflemesini değiştirerek farklı hücre türlerine dalmak, başka güçlü ve kullanışlı bir uygulamadır ve çeşitli sinirsel devre sorularını çözmek için birçok deneysel araç kombinasyonuna olanak tanır.

Korteks dikkat, duyusal algılama ve yukarıdan aşağıya doğru bilişsel kontrol 1 , 2 , 3&#39;ten motivasyon, ödül ve bağımlılık yolları 4 , 5&#39;e kadar bir çok karmaşık zihinsel ve davranışsal işlevin önemli bir oyuncusu. İşlevinin altında yatan hesaplama süreçlerini anlamak, birçok zihinsel ve davranışsal bozukluğun daha iyi klinik anlayışını sağlamak için önemli bir hedeftir. Birçok psikiyatrik hastalık kuramı, kortikal sinirsel devre disfonksiyonu ya da discoordinasyonun şizofreni 6 , otizm 7 ya da obsesif-kompülsif bozukluk gibi koşulların ayırıcı özelliklerinden biri olan bilişsel ve davranışsal anormallikler altında yattığı fikrinin etrafında toplanmaktadır. Böylece, toplum düzeyinde sinir aktivitesi verileri co eldeEşzamanlı davranışsal bilgi bağlamında rtical devreler çok önemlidir ve ideal olarak ince sinirsel devre diseksiyonu için spesifik hücre tiplerini hedef alabilir. İmplante edilebilir gradyan refraktif indeks (GRIN) mikrolensiyonlarıyla birlikte küçültülmüş mikroskoplar, korteks 14 , 15 , 16 da dahil olmak üzere olası beyin bölgelerinden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 çeşitliliğinden serbestçe hareket eden şartlar altında nöronal topluluklara optik erişim sağlar. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleriyle birleştirilmiş bir mobil mikroskopi sistemi kullanarak birçok beyin bölgesindeki 9 günde haftada yüzlerce nöronun bulunduğu aynı hücresel popülasyonun tutarlı şekilde görüntülenmesi sağlanır veGenetik olarak viral vektör veya transjenik teknikler kullanılarak spesifik hücre tiplerini hedef almıştır. Korteks&#39;in farklı fonksiyonları desteklediği ve hücrelerin kortikal tabakasında 17 , 18 , 19 bulunan yerlerine bağlı olarak farklı beyin bölgelerine bağlandığı bilinmektedir, uyanık davrandıkları konularda eşzamanlı çok katmanlı sinirsel aktivite elde etmekle ilgileniyoruz. Burada korteksi çok katmanlı bir görünüm sunan implante edilmiş bir prizma probu ile eşleştirilmiş olan minyatür flüoresan mikroskop 20&#39;yi kullanarak günlerce serbestçe farları davrandıkça yüzlerce floresan etiketli nöronun nasıl görüntüleneceğini göstermektedir ( Şekil 1 ). Burada kullanılan prizma probu iki ayrı GRIN lensinden oluşur: bir prizma ve bir silindirik röle lensi ( Şekil 1 ). Mikroskoptaki ışık, flüoresan etiketliProbların prizma bölümünün hipotenüsünden yansıyan prizma probunun görüntüleme yüzü boyunca yer alan hücreler. Hücrelerden yayılan ışık aynı zamanda prizmanın hipotenüsünü yansıtır, mikroskopun amacı aracılığıyla toplanır ve mikroskopta sensöre ulaşır. Bu prosedürde kullanılan prizma probu standart stereotaksik ekipmanlarla kolay kullanım için uyarlanmıştır. Minyatür floresans mikroskopu 20 , tek hücreli çözünürlükte nöronal popülasyonlarda aksiyon potansiyelinden uyarılmış Ca 2+ geçişlerini saptar ve bu hücreler özellikle Ca 2+&#39; ya duyarlı genetik olarak kodlanmış fluoresan göstergelerle etiketlenir. Bu protokolde, viral bir vektöre (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) kodlanmış Ca 2+ göstergesi enjekte ediyoruz, bir prizma probu yerleştiriyoruz, mikroskopu taktıktan sonra, birden çok gün somatosensoriyel (S1 arka bacak) nöral aktivite verilerini elde ediyoruz Bir hayvandan maruz kalmaD) serbest araştırmalar sırasında yeni nesne yüzeylerine bırakın ( Şekil 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

In vivo devreler ve hücresel düzeydeki fonksiyonel görüntüleme beyindeki hareketleri anlamada kritik bir araçtır. İki fotonlu mikroskop ile fare kortikal nöronlarının yüksek çözünürlüklü görüntülemesi, korteks yapısı, fonksiyonu ve plastisite ile ilgili benzersiz bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar baş sabit hayvanlarla sınırlıdır ve bu çalışma için olan davranışsal karmaşıklığı büyük ölçüde azaltır. Bu yazıda, serbestçe davranan farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlüğe sahip kronik floresan mikroskobu gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Birkaç gün boyunca yeni bir nesne arama görevinde bulunan fare, somatosensor korteksin çok katmanlarında yüzlerce nöronun kalsiyum dinamiklerini aynı anda görselleştirmek ve kaydetmek için implante edilmiş bir prizma probu ile birlikte entegre bir minyatür floresan mikroskop kullandık. Bu teknik, farklı davranış türlerine göre farklı hayvan türlerinde diğer beyin bölgelerine uyarlanabiliraradigms.

Burada özetlenen protokol, prizm probları kullanarak serbestçe davranan farelerde yüzlerce kortikal nörondan boyuna çok katmanlı Ca 2+ görüntülemeyi gerçekleştirmenin etkili ve etkili bir yolunu anlatmaktadır ( Şekil 1 ). Çok katmanlı kortikal görüntülemeye yönelik önceki yaklaşımlar başlıca sabit hayvanlar 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 ile sınırlandırılmıştır. Bu verilerin seviyesini özgürce davranan bir bağlamda elde edebilmek için davranış esnekliği için minyatür bir mikroskop platformu kullanıldı; Genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörü (GCaMP6f) belirli bir hücre popülasyonunu (kortekste CAMKII + hücreleri) hedeflemek için kullanıldı; Ve bir prizma probu, kronik, çok tabakalı bir görüş alanı sağlamak için seçildi. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Hayvanı görüntüleme için hazırlama iş akışını gösterdik. Etiketli hücrelere optik erişim sağlamak için kronik olarak bir prizma probu implante etmeden önce, uygun bir kalsiyum indikatörü kodlayan bir viral vektör kortekse enjekte edildi ( Şekil 2 , Adım 1) ( Şekil 2 , Adım 2). Görüntüleme oturumları sırasında mikroskop yerleştirilmesi için güvenli, geçici bir platform görevi gören bir taban plakası daha sonra hayvanın başının üzerine yerleştirildi ( Şekil 2 , Adım 3), çok hücreli katmanlar arasındaki kortikal aktivitenin uyanık bir davranış deneyselinde görselleştirilmesini sağladı Kurulum ( Şekil 2 , Adım 4). İstenen hücresel popülasyonun hedeflendiğinden emin olmak için, temsil eden bir fare için post-mortem bir koronal beyin bölümü, Şekil 3&#39;te prizma sondası kanalı ve görüş alanı GCaMP6f laboratuara göre işaretlenmiştirSomatosensoriyel kortekste Katman 2/3 ve 5&#39;de bulunan nöronlar. Açık alan (Gün 1), Nesnelerin Tanıtılması (Gün 2-4) ve Roman Nesnesi (Gün 5) olmak üzere üç farklı ortama maruz kaldığında uyanık sistemli görüntüleme sırasında somatosensor kortikal nöronların aktivitesi kaydedildi ( Şekil 4 ). Gün 1, fare herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi. 2-4. Günlerde fare, aynı iki dokusal açıdan farklı cisimler (bir jel yatağı ve bir ahşap blok) ile arenaya yerleştirildi. 5. gün, nesnelerden biri yeni bir nesneyle değiştirildi. Hayvan 5 gün boyunca her gün 20 dakika boyunca görüntülendi. Ca 2+ görüntü veri analiz yazılımı kullanılarak hücre ekstraksiyonunu takiben, hücre konumlarına karşılık gelen mekansal filtreler, mikroskop kayıt verilerinin ortalama floresan yoğunluğu projeksiyonu üzerine bindirildi( Şekil 5) . Beyaz kesikli çizgi, katmanları 2/3 ve 5 hücrelerini ayırır. Katmanların her birinden 5 hücreye karşılık gelen Ca 2+ izleri, hücrelerin ateşleme modelini iki farklı davranışsal bağlamda göstermektedir: Nesneleri Tanıma ve Roman Nesneye Maruz Kalma. Katman 2/3 hücreleri, fare yeni bir nesneye maruz kaldığı gün katman 5 hücreleriyle karşılaştırıldığında daha aktifti. Bu aynı zamanda, 1., 4. ve 5. günlerde tüm görüntü hücrelerinin eşikli ateşleme aktivitesini gösteren raster çizimlerden anlaşılmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> Şekil 1: Serbestçe hareket eden farelerde çoklu kortikal katmanların karşısındaki In Vivo Ca 2+ Görüntüleme. ( A ) Prizma prob özellikleri ve görüntüleme düzlemi gösterimi. Hipotenürün iç kısmındaki yansıtıcı kaplama, prizma probunun ekleme düzleminden 90 ° görüntüleme sağlar. Mercek cuFf, implantasyon prosedürünü düzene sokan ve implantasyon sırasında çevresel doku floresansının potansiyel olarak görüntülenmesine izin veren lens tutucusu ile bütünleşir ( B ) (i). Virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondası kraniotomisinin ve bıçak kesiğinin yerleştirilmesi ve (ii) bıçak kesi ve virüs enjeksiyon bölgesine göre prizma sondasının düz tarafının konumunun gösterilmesi. ( C ) Fare korteksine yerleştirilen prizma probu vasıtasıyla tam alan içinde küçük bir alan için ışık yolunu gösteren in-vivo Ca 2+ görüntüleme düzeneğinin illüstrasyonu. ( D ) Prizma probu takılması sırasında örnek alan. Minyatür mikroskop, prizma probunu tutan lens tutucusuna tutturularak prizma probu kurulumu sırasında virüs ifadesinin kontrol edilmesine izin verir. ( E ) GCaMP6f etiketli S1 hücrelerinin çok katmanlı kortikal görüntülemesi için mikroskop ile prizma probu entegrasyonu. F Örnek alanTaban plakası kurulumu sırasında. Açık kan damarı deseni, ham görüntüde bazı hücrelerle taban plakası kurulumu sırasında görülür. Toplama yazılımı penceresinde DF / F açıldığında daha fazla hücre açıkça görülür. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> Şekil 2: Prizma Prob İmplantasyonu ve Mikroskop Kurulumu için İş Akışı Olaylarının Zaman Çizelgesi Gösterilen Şematik. Hafta sayısı, X ekseni üzerinde ve Y ekseni boyunca işlemlerin iş akışı adımları üzerinde gösterilir. ( A ) Aynı dorso-ventral eksende fare somatosensoriyel korteksin çok katmanlarını etiketlemek için viral enjeksiyon (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40) gösteren grafik. ( B ) virüs enjeksiyonlarından 2 hafta sonra, bir prizma probuE, virüs enjeksiyon bölgelerine paralel olan bir eksene yerleştirilir. ( C ) Prizma probu implantasyonundan yaklaşık bir hafta sonra, hayvanın mikroskop ile ekspresyonu kontrol edilir ve bir hücre popülasyonu görülebiliyorsa kafaya bir taban plakası monte edilir. ( D ) Hayvan, daha sonra, ilgili davranışsal görevler sırasında kronik görüntüleme için hazırdır (Mouse clip art, UW-Madison Biochemistry MediaLab&#39;ın izninin ardından değiştirilmiştir). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> Şekil 3: Prism Probe Yerinin ve GCaMP İfadesinin Postmostem Histolojik Onaylaması. ( A ) Prizma prob yolunu gösteren ve görüntüleme tarafı bakan temsili fare beynindeki koronal kesitGCaMP6f ifade eden hücreleri (AAV1.CaMKII.GCaMP6f nöronlarda katmanlar 2/3 ve 5&#39;de ifade edilir). ( B ) DAPI için boyanmayı takiben aynı koronal beyin bölümü. Ölçek çubuğu = 250 μm ( C ) Somatosensoriyel kortekste GCaMP6f eksprese eden hücreler ışığında büyütülmüştür. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> Şekil 4: Habitüasyon sırasında Fare Aktivitesi, Tanılama ve Yeni Nesne Pozlama Testi, Video Yazılımı kullanılarak Video İzlenmiştir. ( A ) 1. Gün, hayvan herhangi bir nesneden yoksun bir davranış alanına yerleştirildi (Açık Alan). ( B ) 2-4. Günlerde aynı iki dokusal açıdan farklı nesne (jel ped ve ahşap blok) arenaya yerleştirildi (Object Familiarization). ( C ) 5. günde, nesnelerden biri yeni bir nesneyle (kum kağıdı ile ahşap blok) değiştirildi (Novel Object Exposure). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> Şekil 5: Mikroskop ile Görüntülenen Temsilci Bir Farenin Somatosensor Korteksinin Yüzeysel ve Derin Katmanlarından Kalsiyum Dinamiği. ( A ) Nöronal uzaysal filtrelerin (yeşil bloklar) ve prizma tarama alanı üzerinden mikroskop kayıtlarının ortalama floresans yoğunluğu projeksiyonunun birleştirilmiş hali. Beyaz kesikli çizgi ile gösterilen supragranular ve infragranular tabakalar arasındaki sınır. Ölçek çubuğu = 100 μm. ( B ) Yüzeysel ve derin tabakalı beş örnek hücrenin (dolu mavi ve kırmızı cTemel A ve bağımsız bileşen analizini takiben floresansın standart sapması birimleri belirtir. Yatay ölçek çubuğu 50 s ve dikey ölçek çubuğu 10 SD ( C ) Açık alan, Nesne Tanıtımı ve Roman nesnesi araştırması üzerinde gösterilen yüzeysel (katmanlar 2/3) ve derin katmanlardan (katman 5) hücrelerin raster çizimi. Ölçek çubuğu = 100 s. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

multi-layer-cortical-ca2-imaging-freely-moving-mice-with-prism-probes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K Görüntüleme.  Inscopix Inc..  Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir. 

Video: Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Davranış

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Biyoloji

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Nörobilim

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Superior Colliculus'ta İki Foton ve Geniş Alan Kalsiyum Görüntüleme

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Yazar Gündemi: Superior Colliculus'ta Nöral Kodlamanın ve Görsel İşleme Mekanizmalarının Ortaya Çıkarılması 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Çok Katlı Kortikal Ca

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme