Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
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저자들은 AAV1-GCaMP6f의 관대 한 기증으로 하워드 휴즈 의학 연구소의 Janelia Research Campus의 Genetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector (GENIE) 프로젝트의 V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger 및 K. Svoboda에게 감사드립니다. University of Pennsylvania 벡터 코어. 그들은 또한 공 촛점 현미경 검사 서비스에 NIH NS069375 보조금으로 지원되는 Stanford University의 A. Olson과 Neuroscience Microscopy Core에 감사드립니다.

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깨어있는 행동 중에 신경 회로 활동을 이해하는 것은 건강과 질병에서 효과적으로 뇌 기능을 해부하는 데 필요한 신경 과학적 조사의 핵심 단계입니다. 피질은 깨어있는 행동의 맥락에서 연구하는 데 특히 중요합니다. 왜냐하면 그것은 많은 중요한 감각,인지 및 실행 기능에서 중요한 역할을하기 때문입니다. 대뇌 피질의 기둥은 피질의 기본 기능 단위로 생각되며 피질 세포의 집단 수준 활동은 기둥 내의 물리적 위치에 따라 다르다고 알려져 있습니다. 예를 들어 체세포 감각 피질에서 2/3 층의 흥분성 뉴런은 주로 다른 신피질 영역으로 진행하고 다른 피질 네트워크를 변조합니다 30 , 더 깊은 층의 세포는 주로 시상과 같은 피질 하부 영역에 작용합니다 31 . 100의 활동 기록하기자유롭게 행동하는 피험자에서 서로 다른 층을 가로 질러 시간에 따라 동시에 사전에 지정된 피질 세포를 재현하는 것은 대뇌 유사 정보 흐름에 대한 우리의 이해를 크게 향상시켜 실시간 행동 정보 및 작업 관련 시간 정보에 의해 알린 피질 기둥의 미세한 기능 해부를 가능하게합니다. 저울. 이 수준의 신경 회로 데이터를 수집하는 것은 효율적이고 유선형의 소형 현미경 플랫폼을 사용하여 자유롭게 행동하는 피험자 (또는 원하는대로 머리 고정 피험자)에서 대규모 칼슘 2+ 영상을 수행 할 수있게합니다. 세포 형 특정 표적화를 가능하게하고, 만성적으로 이식 된 프리즘 프로브에 의해 제공되는 다층 시야를 이미징하기 위해 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약과 함께 사용되는이 프로토콜은 많은 가능한 응용 중 하나의 사례를 탐구했다 : 마우스의 체성 감각 대뇌 피질 처리 물리적으로 새로운 객체와 결합합니다 ( 그림 5 ).이것은 깨어 있고 자유롭게 행동하는 동물에서 여러 피질 층을 연구하기위한 세포 유형 특이적인 생체 내 접근법의 첫 번째 절차적인 일러스트레이션이며 능동적 인 두뇌의 층류 구조를 이해하는 데 사용할 수있는 실험 방법의 스펙트럼을 확장합니다. 이 기술에서 프리즘 프로브에 의해 가능해진 시각의 망원경 (periscopic) 시야는 관심 부위에 직접적으로 조직의 보존이 요구 될 때 다른 뇌 구조에 적용될 수있다. 예를 들어, CA3 이미징은 해마 기능의 중단없이 달성 될 수있다. Ca 2+ 활동을 이미징하기위한 프리즘 프로브 기반 접근법은 피질에 마이크로 프리즘을 물리적으로 삽입하고 영구적으로 삽입해야하는데, 이는 렌즈 프로브가 삽입되는 피질 병변의 생성과 동일합니다. 이것은 정점 수상 돌기 및 과정의 절단을 포함하여 국소 신경 회로에 혼란을 야기 할 수 있습니다. 티그의 절차는 또한 영역에서 glial 세포의 초기 활성화를 일으킬 것입니다, 이것은 프리즘 얼굴에서 약 150 μm의 조직에 국한 될 것으로 예상되고, 뇌가 치유 된 후 가라 앉을 것으로 예상 22 . 이 기술이 실험을 계획 할 때 동물의 정상적인 회로 해부학 및 / 또는 행동에 영향을 미치는지 고려하는 것은 매우 중요합니다. Behavioral Control Group은 교묘 한 실험 결과를 생성 할 수있는 기준 행동에 중요한 변경이 없도록 항상 수행되어야합니다. 신경 내학 적 조작, 다양한인지 적, 사회적, 운동 적 또는 고유의 행동 패러다임을 가진이 소형화되고 이동성 인 Ca 2+ 영상 기법을 사용하고 다른 생리적 측정 기준과 결합하면 행동 및 신호에서 신경 회로의 기능적 역할을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구가 심화되고 풍부해질 수 있습니다 처리 32 . 억압 또는 활동약물로 조절되는 특정 경로의 작용은이 기술을 사용하여 쉽게 연구 할 수있는 관련 행동에 영향을 줄 수 있습니다 33 . 칼슘 지시자의 표적을 변경해서 다른 세포 유형으로 밖으로 분기하는 것은 다른 강력하고 유용한 신청이고, 다양한 신경 회로 질문을 제시하는 실험적인 공구의 많은 창조적 인 조합을 가능하게합니다.

피질은 주의력, 감각인지 및 하향식인지 조절 1 , 2 , 3 에서 동기 부여, 보상 및 중독 경로 4 , 5에 이르기까지 많은 복잡한 정신 및 행동 기능에서 필수적인 요소입니다. 기능의 기초가되는 전산 과정을 이해하는 것은 많은 정신 및 행동 장애에 대한 임상 적 이해를 향상시키는 중요한 목표입니다. 대뇌 피질 신경 회로 장애 또는 비 적응이 정신 분열병 6 , 자폐증 7 또는 강박 장애 8 과 같은 조건의 특징 인 인식 및 행동 이상을 일으킬 수 있다는 생각을 중심으로 정신과 질환 센터의 많은 현재 이론이 있습니다. 따라서, 공동에서 인구 수준의 신경 활동 데이터를 얻는 것동시 행동 정보의 적절한 컨텍스트 내에서 회로는 매우 중요하며 이상적으로는 미세한 신경 회로 해부를위한 특정 세포 유형을 목표로 할 수 있습니다. 이식 형 그라디언트 굴절률 (GRIN) 마이크로 렌즈와 함께 소형화 된 현미경은 피질 14 , 15 , 16을 포함한 가능한 뇌 영역 9 , 10 , 11 , 12 , 13 의 다양성에서 자유롭게 움직이는 조건에서 뉴런 앙상블에 대한 광학 액세스를 가능하게합니다. 유 전적으로 코딩 된 칼슘 지시약과 결합 된 이동 현미경 검사 시스템을 사용하면 많은 뇌 영역에서 며칠에서 수주에 걸쳐 수백 개의 뉴런을 포괄하는 동일한 세포 집단의 일관된 영상을 얻을 수 있으며,바이러스 벡터 또는 형질 전환 기술을 사용하여 특정 세포 유형을 유 전적으로 표적으로한다. 피질은 서로 다른 기능을 지원하고 피질 층 17 , 18 , 19 내의 세포의 위치에 따라 다른 뇌 영역에 연결하는 것으로 알려져 있으므로 깨어있는 행동 대상에서 동시에 다층 신경 활동을 얻는 데 관심이 있습니다. 여기서 우리는 피질 ( 그림 1 )의 다층보기를 제공하는 이식 프리즘 프로브와 쌍을 이루는 소형 형광 현미경 20을 사용하여 며칠 동안 자유롭게 행동하는 마우스에서 형광으로 표시된 수백 개의 뉴런을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 프리즘 프로브는 두 개의 분리 된 GRIN 렌즈로 구성됩니다 : 프리즘과 원통형 릴레이 렌즈 ( 그림 1 ). 현미경으로부터의 빛은 형광으로 표지 된프로브의 프리즘 부분의 빗변으로부터 반사 된 후, 프리즘 프로브의 촬상면을 따라 위치 된 셀을 포함한다. 세포로부터 방출 된 빛은 프리즘의 빗변으로부터 반사되어 현미경의 목적을 통해 수집되어 현미경의 센서에 도달합니다. 이 절차에 사용 된 프리즘 프로브는 표준 stereotaxic 장비와 함께 사용하기 쉽게되어 있습니다. 소형 형광 현미경 (20 )은 세포가 Ca 2+에 민감한 유 전적으로 코드화 된 형광 지시약으로 특이 적으로 표지 된 후, 단일 세포 분해능을 갖는 연결 집단에서 활동 전위에 의해 유발 된 Ca 2+ 과도 현상을 검출한다. 이 프로토콜에서 우리는 바이러스 벡터 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)에 인코딩 된 칼슘 2 + 표시기를 삽입하고, 프리즘 프로브를 삽입하고, 현미경을 설치 한 다음 somatosensory (S1 뒷다리) 신경 활동 데이터 동물 폭로d를 자유 탐사 중에 새로운 물체 표면으로 이동시킵니다 ( 그림 2 ).

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

생체 내 회로 및 세포 수준의 기능 영상은 뇌의 활동을 이해하는 데 중요한 도구입니다. 2 광자 현미경으로 마우스 피질 뉴런의 고해상도 이미징은 피질 구조, 기능 및 소성에 대한 독특한 통찰력을 제공합니다. 그러나 이러한 연구는 고착 된 동물에 국한되어 연구 할 수있는 행동의 복잡성을 크게 줄입니다. 이 논문에서는 자유롭게 행동하는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 만성 형광 현미경 검사를 수행하는 절차를 설명합니다. 우리는 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 소형 형광 현미경을 사용하여 며칠 동안 새로운 대상 탐사 작업에 종사하는 마우스가 체세포 감각 피질의 여러 층에 걸쳐 수백 개의 뉴런의 칼슘 동역학을 동시에 시각화하고 기록했습니다. 이 기술은 다른 동물의 다른 뇌 영역에 적용되어 다른 행동 paradigms.

여기에 설명 된 프로토콜은 프리즘 프로브 ( 그림 1 )를 사용하여 자유롭게 행동하는 마우스에서 수 개의 대뇌 피질 뉴런에서 세로 다층 칼슘 2+ 영상을 수행하는 효과적이고 효율적인 방법을 설명합니다. 다층 피질 이미징에 대한 이전의 접근법은 머리 고정 동물 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 로 주로 제한되어왔다. 자유롭게 행동하는 맥락에서이 수준의 데이터를 얻기 위해, 소형화 된 현미경 플랫폼이 행동 유연성을 위해 사용되었습니다. 유 전적으로 암호화 된 칼슘 지시약 (GCaMP6f)을 사용하여 특정 세포 집단 (CAMKII + 피질 세포)을 표적으로 삼았다. 만성 다층 시야를 제공하기 위해 프리즘 프로브를 선택했습니다. 그림 2 , 1 단계)에 주입했습니다 ( 그림 2 , 2 단계). 영상 세션 동안 현미경의 위치에 대한 안전하고 임시 도킹 역할을하는베이스 플레이트는 동물의 머리 위에 설치되었으며 ( 그림 2 , 3 단계), 깨어있는 행동 실험에서 여러 세포 층에 걸쳐 대뇌 피질의 활동을 시각화 할 수있었습니다 설치 ( 그림 2 , 4 단계). 원하는 세포 집단이 표적화되도록하기 위해 대표적인 마우스의 사후 뇌관 절 두뇌 단면을 프리즘 프로브 영역과 GCaMP6f 실험실에 상대적으로 표시된 시야와 함께 그림 3 에 표시했습니다somatosensory cortex의 Layer 2/3과 5에서 eled 뉴런. 깨어있는 행동을하는 시스템에서 체세포 감각 피질 뉴런의 활동은 마우스가 오픈 필드 (Day 1), 개체 익숙 함 (Day 2-4) 및 소설 개체 (Day 5)의 세 가지 환경에 노출되었을 때 기록되었습니다 그림 4 ). 1 일에 마우스는 어떤 물건도없는 행동 경기장에 배치되었습니다. 날 2-4에서 마우스는 같은 두 개의 텍스처가 다른 대상 (젤 패드와 나무 블록)으로 경기장에 배치되었습니다. 5 일째, 대상 중 하나가 새로운 대상으로 교체되었습니다. 동물은 매일 20 분 동안 5 일 동안 이미지화되었습니다. 칼슘 2 + 이미지 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 추출 후, 세포 위치에 해당하는 공간 필터를 현미경 기록 데이터의 평균 형광 강도 투영에 중첩시켰다( 그림 5) . 흰 점선은 레이어 2/3과 5 셀을 구분합니다. 각각의 층에서 5 개의 세포로부터의 상응하는 칼슘 2+ 흔적은 두 가지 상이한 행동 문맥 - 개체 익숙 함 및 새로운 대상 노출에서 세포의 발화 패턴을 나타낸다. 레이어 2/3 세포는 마우스가 새로운 대상에 노출 된 날의 레이어 5 세포에 비해 더 활동적이었습니다. 이것은 1, 4 및 5 일에 모든 이미징 된 셀의 threshold 된 발화 활동을 보여주는 래스터 플롯에서도 분명합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> 그림 1 : 자유롭게 움직이는 쥐에서 여러 피질 층을 가로 지르는 생체 내 칼슘 2+ 영상. ( A ) 프리즘 프로브 사양 및 이미지 평면 묘사. 빗변 안쪽의 반사 코팅은 프리즘 프로브 삽입면에서 90 °의 이미징을 허용합니다. 렌즈 cuff는 렌즈 홀더와 통합되어 임플란트 시술을 간소화하고 임플란트시 주위 조직 형광을 잠재적으로 볼 수 있습니다 ( B ) (i). (ii) 나이프 절개 및 바이러스 주사 부위에 대한 프리즘 프로브 편평한면의 위치를 ​​보여주는 그림. ( C ) 마우스 피질에 이식 된 프리즘 프로브를 통해 전체 시야 내의 작은 영역에 대한 빛 경로를 보여주는 생체 내 Ca 2+ 영상 장치 설정의 예. ( D ) 프리즘 프로브 설치 중 시야의 예. 미니어처 현미경은 프리즘 프로브를 고정하는 렌즈 홀더에 부착되어 프리즘 프로브 설치 중에 바이러스 발현을 검사 할 수 있습니다. ( E ) GCaMP6f 표지 S1 세포의 다층 피질 이미징을위한 프리즘 프로브와 현미경의 통합. F보기 필드베이스 플레이트 설치 중. 생체 이미지에 일부 셀이있는베이스 플레이트 설치시 명확한 혈관 패턴이 표시됩니다. 획득 소프트웨어 창에서 DF / F가 켜지면 셀이 더 잘 보입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> 그림 2 : 프리즘 프로브 이식 및 현미경 설치를위한 워크 플로 이벤트의 타임 라인을 보여주는 도식. 주 수는 Y 축을 따라 프로 시저의 X 축 및 워크 플로우 단계에 표시됩니다. ( A ) 마우스 somatosensory 피질의 여러 레이어를 레이블에 동일한 dorso - ventral 축을 따라 바이러스 주입 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40)을 보여주는 그래픽. ( B ) 바이러스 주입 2 주 후, 프리즘 probe는 바이러스 주입 사이트에 평행 한 축에 이식된다. ( C ) 프리즘 프로브 주입 후 약 1 주일 동안, 동물의 현미경으로 발현 여부를 확인하고, 세포 집단이 보이면 머리판에베이스 플레이트를 올려 놓는다. ( D ) 그 동물은 관련 행동 과제 동안 만성 이미징을 준비합니다 (마우스 클립 아트는 UW-Madison Biochemistry MediaLab의 허락을 받아 수정되었습니다). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> 그림 3 : 프리즘 프로브 위치와 GCaMP 표현의 사후 검증. ( A ) 프리즘 프로브 영역과 그 영상화면이 마주 보는 대표적인 마우스 두뇌의 코로나 단면GCaMP6f 발현 세포 (AAV1.CaMKII.GCaMP6f는 2/3 및 5 층의 뉴런에서 발현 됨). ( B ) DAPI에 대한 염색 후 동일한 코로나 뇌 절편. Scale bar = 250 μm ( C ) somatosensory cortex에서 GCaMP6f 발현 세포의 확대도. 스케일 바 = 100 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> 그림 4 : 습관, 익숙 함 및 소설 대상의 마우스 활동 비디오 소프트웨어를 사용하여 비디오를 추적합니다. ( A ) 1 일째에, 동물은 어떤 대상도없는 행동 경기장에 놓이게되었다 (열린 필드). ( B ) 2 일에서 4 일 사이에 동일한 두 개의 질감이 다른 대상 (젤 패드와 나무 블록)이 경기장에 배치되었습니다 (Object Fami거짓말). ( C ) 5 일째, 대상 중 하나가 새로운 대상 (모래 종이가있는 나무 블록)으로 대체되었습니다 (소설 대상 노출). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> 그림 5 : 현미경으로 촬영 한 대표 마우스의 체 감각 피질의 표면 및 심층에서의 칼슘 역학 ( A ) 프리즘 프로브 시야를 통해 현미경 기록의 신경 공간 필터 (녹색 얼룩)와 평균 형광 강도 투영의 병합 된 이미지. 흰 점선으로 표시된 과립과 과립 사이의 경계. 스케일 바 = 100 μm. ( B ) 칼슘은 5 개의 표면 및 깊은 층 셀 (파란색과 빨간색으로 채워진 c패널 A의 ells). 주성분 분석과 독립 성분 분석에 이어 형광의 표준 편차를 나타내는 단위. 수평 눈금 막대 50 초 및 수직 눈금 막대 10 SD ( C ) 공개 필드, 개체 숙지 및 소설 개체 탐색에 표시된 표면 (레이어 2/3) 및 심층 (레이어 5)의 셀 래스터 그림. 눈금 막대 = 100 초. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다.

다층 피질 칼슘<sup&gt; 2+</sup&gt; 프리즘 프로브 및 소형 형광 현미경으로 자유롭게 움직이는 마우스에서 이미징

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K 조회수.  Inscopix Inc..  여기서는 자유롭게 움직이는 마우스에서 여러 피질 층에 걸쳐 세포 - 해상도로 대규모 Ca 2+ 영상을 수행하는 절차를 제시합니다. 이식 프리즘 프로브와 결합 된 소형 헤드 장착 현미경을 사용하여 수백 개의 활성 세포를 동시에 관찰 할 수 있습니다. 

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

연구

행동분석학

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

생물학

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

신경과학

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Superior Colliculus의 Two-photon 및 Wide-field Calcium 이미징

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

저자 스포트라이트: Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

다층 피질 칼슘

요약

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이 비디오의 챕터

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

Microprism를 사용하여 딥 두피 레이어의 생체내 이미징에서

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징