Bu çalışma Fritz Thyssen Vakfı (Az.10.14.2.152) tarafından desteklenmiştir. Biz doku gömme tesisi ve CMMC mikroskop çekirdek tesisine minnettarız. Biz Sentrozom ve Sitoiskelet Biyoloji Laboratuvarı üyeleri tarafından sunulan tartışmalar ve teknik destek için müteşekkiriz. Yazıları ve düzeltilmesi için Li Ming Gooi teşekkür ederim.

Beyin Organoids 1. Nesil (23 gün) <ol><li> Nöroektoderm başlatılması (5 gün) NOT: Aşağıdaki noktalar farklılaşma başlamadan önce düşünülmelidir. İnsan iPSCs elde etmek üzere yeniden programlama yöntemi (lentiviral- sendai-virüs- epizomal-, veya mikroRNA bazlı vs.), ideal hastada için aynı ve iPSC hatları kontrol edilmelidir. Çeşitli yeniden programlama kitleri ve yayınlanmış protokollere göre talimatları 15, 16, 17, 18 mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalite optimal farklılaşma gerçekleştirmek için bir anahtardır. Bir mikroskop ile koloni ve hücre morfolojisi Monitör ve Oct3 / 4, Nanog veya TRA-1-60 Markerlerin ekspresyonunu test ederek pluripotensini doğrulamak. <ol><li> Engelbreth-Holm-Swarm ile kaplanmış bir tabak üzerinde kültür ortamı A içinde besleyici içermeyen koşullar altında kültür insan iPSCs(EHS) matris. Not: İnsan iPSCs büyütün besleyici içermeyen ve serumsuz tanımlanmış bir kültür muhafaza edilmesi için ve farklılaşma başlamadan önce fare embriyonik besleyici hücreler (MEF&#39;ler) çıkarılması için ek bir adım önlemek için. İnsan iPSCs için en uygun geçiş sayısı, toplam geçit 70 yeniden programlama üzerine geçit 15 farklılaşma aralığını başlatın. pasaj, yeni bir çanak agrega aktarmak için düşük mekanik stresle uygun bir hücre ayırma çözeltisi ve 2 ml serolojik pipet kullanarak agrega hücreleri gibi hiPSC koloniler ayırmak. bu en iPSC hatlarında farklılaşmayı ve apoptosis edilebileceği gibi tek hücrelere dissosiyasyonu kaçının. Uzun vadeli, tek-hücreli pasajlama insan iPSCs 19, 20 genomik değişiklik artırabilir olduğu bildirilmiştir. Bu iPSCs genel canlılığını azaltır, sıyrılma çözeltinin ayrılması için bir santrifüj aşamasını gerektirir hücre ayırma işlemleri, kaçının. Ölçekmikrobiyal kontaminasyonlarla, düzenli olarak özellikle mikoplazma, tüm kültürler bu iPSCs kalitesini ve bunların farklılaşma kapasitesinin değiştirmesi nedeniyle. <ol><li> Kaplama, üreticinin talimatlarına uygun olarak EHS matris ile bir 60 mm doku kültürü çanağı. </li><li> 1 x 10 6, insan iPSCs bir kısım çözülme. EHS matris içinde kaplandı ve ortam A 5 mL (Malzeme Tablo) ihtiva eden bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde iPSCs Seed. Hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında 5 ila 7 gün sonra günlük orta ve geçit değiştirin. Not: Geçiş farklılaşmasını başlamadan önce en az bir kez, örneğin koloni 21 enzim içermeyen ayrılması gibi standart yöntemler kullanılarak% 80 birleşme çözülmüş iPSCs. üreticinin aşağıdaki iPSCs Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), ve inkübe: Kısaca, iPSC orta kaldırmak önceden ısıtılmış 37 ° C Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı ile bir kez yıkama hücreleriReaktif A kullanılarak talimatları (malzeme tabloya bakınız). Tek hücrelere ayrışma önlemek için tavsiye edilen inkübasyon süresi aşmayın. İnsan iPSCs müstakil ve agrega gibi tek değil hücreleri olarak yüzen edilmelidir. Daha sonra, yeni EHS matris kaplı tabaklara transfer edilebilir; örneğin, iPSC bir 60 mm çanak 4 yeni 60 mm&#39;lik tabaklara dağıtılabilir agrega. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir mikoplazma algılama kiti ile mikoplazma için kontrol edin. mikoplazma iPSCs farklılaşma yeteneğine değiştirebilir olarak, sadece mikoplazma içermeyen iPSCs kullanın. </li></ol></li><li> iPSCs (% 80 kaynaşık), ayrıştırmaları ve reaktif B ile tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak <ol><li> Önceden ısıtılmış (37 ° C), DMEM / F12 ile bir kez iPSCs yıkayın. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika ve% 5 CO2 için iPSCs (60 mm tabak içinde, örneğin, 1 mL) önceden ısıtılmış reaktif B ilave edin ve inkübe edilir. </li><li> tarafında ve alt tarafında bir parmak ile Flick 20 katçanak iPSCs ayırmak için. Mikroskop altında hücrelerin dekolmanı kontrol edin. </li><li> 1 ml mikropipet ile tabak içinde yukarı ve aşağı 5 kez hücre süspansiyonu pipetle. </li><li> reaktif B 1 mL seyreltik ve 15-ml santrifüj tüpü içinde hücre süspansiyonu toplamak için ortam A 3 mL ekleyin. </li><li> Yavaşça oda sıcaklığında 4 dakika boyunca iPSCs (500 x g) aşağı doğru döndürün. </li><li> Ortam B&#39;de 1 mL hücre pelletini ve bir hemositometrede hücre sayısını. NOT: yeniden süspanse edilmesi için sadece orta B&#39;yi kullanarak farkında olun. Bu farklılaşmasını inhibe olabilir bFGF bir çok yüksek bir konsantrasyonda, olarak, ortam, bir kaçının. </li></ol></li><li> 10 uM rho-ilgili protein kinaz önleyicisi (Y-27632) ile desteklenmiş ortam B&#39;de ml başına 4.5 x 10 5 hücre hücre süspansiyonu seyreltin. </li><li> Bir yapışkan olmayan, V tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, oyuk başına 100 uL ekleyin. NOT: emin olun hücreler eşit sus dağıtılır100 uL kısımları alınmadan önce tüpü her çalkalayarak pansiyon. Her bir boyut ve şekil (yuvarlak, oluşturulan yüzeylerin) içinde homojen nöroküreleri elde etmek üzere bir eşdeğer hücre sayısı içermelidir önemlidir. </li><li> Yavaşça 3 dakika boyunca 500 x g&#39;de oda sıcaklığında hücreler plaka aşağı spin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> 50 mcL kaldırılması ve önümüzdeki 5 gün boyunca her kuyuya taze ortam B 50 mcL ekleyerek günlük orta değiştirin. </li></ol></li></ol> EHS Matrix 2. gömülmesi Neurospheres (4 gün) <ol><li> W / olmadan (100 (h / h) takviyesi 2: 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak neurosphere orta hazırlayın o) A vitamini, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM esansiyel olmayan amino asitler (MEM), 100 U / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insülini, ve 0.05 mM β-merkaptoetanol. </li><li> Neurospheres espri toplayınha bir ~ 2 mm uç kullanılarak 200 uL mikropipet daha önce steril bir makas ile kesilmiştir. </li><li> Boş 100 mm tabak içinde yaklaşık 5 mm uzaklıkta parafin film (3 x 3 cm 2) üzerinde birbirinden nöroküreleri yerleştirin ve dikkatli bir sürede geri kalan ortam kadar çıkarın. </li><li> Her bir neurosphere üzerine EHS matrisinin bir damla (7 uL) ilave edilir. </li><li> EHS matris, bir kuluçka makinesi içinde 15 dakika için neurospheres ile damla inkübe edin. </li><li> neurosphere ortamla onları yıkanmak suretiyle parafin filmden dikkatle nöroküreleri yıkayın. temizlemek için, 1 ml mikropipet ve neurosphere ortamı 10 mL içeren yeni bir 100 mm Petri kabı kullanılır. </li><li> Sonraki 4 gün boyunca nöroküreleri inkübe ve 2 gün sonra, taze neurosphere orta 2 ml. NOT: EHS matris gömülmüş Neurospheres yemeğin bir tarafta yığın birlikte olmayacak şekilde kuluçka raflar düz olduğundan emin olun. </li></ol> Bir döner süspansiyon 3. OrganoidsKültür (14 Gün) <ol><li> 200 (h / h) takviyesi 1, 1: 100 (h / h) takviyesi 2 w / o 1: DMEM / F12 ve orta C (h / h), 1: 1 karışımı, aşağıdakileri karıştırarak beyin Organoid orta hazırlayın Vitamin A, 1: 100, L-glutamin, 0.05 mM MEM, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1.6 g / L insulin, 0.5 uM dorsomorphin, 5 uM SB431542 ve 0.05 mM β-merkaptoetanol. </li><li> yan kollar üzerinden her bükme şişesi beyin Organoid ortamın 100 ml ilave edilir ve en az 20 dakika boyunca ön ısıtma için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> üreticinin talimatlarına göre, 25 rpm&#39;de bir karıştırma programı kurun. NOT: döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri aktarmadan önce, hepsi ayrıldığından emin olun. İki veya daha fazla EHS matris boyunca bağlı ise, bir bisturi ile bağlantı matrisi kesilerek ayırın. </li><li> Dikkatle Organoid ortamın 100 mL içeren döndürücü şişelere EHS matris gömülmüş nöroküreleri transferi bize2 ml serolojik pipet ing. şişe içine nöroküreleri aktarmak için bükme şişesi yan kollarını kullanın. </li><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile bir inkübatör içerisinde bir manyetik karıştırma platformu üzerinde döndürme şişeleri yerleştirin; Bu Organoid kültürün gün 0&#39;dır. </li><li> (Ya da daha sık bir renk değişimi olduğunda) orta yarısını kaldırılması ve taze ortam aynı miktarda ekleyerek haftada bir ortam değiştirin. Not: kuluçka döndürme şişeleri çekerken, organoids şişenin tabanına iner izin 3-5 dakika bekleyin. sıvının yüzeyi üzerinde (bir pompaya bağlı) bir cam pipet yerleştirerek orta çıkarın; dikkatli bir şekilde bir yan açıklık / şişenin kolu ile orta aspire. Bu manipülasyonlar laminer kaputun altında yapılmalıdır. </li></ol> Beyin Organoids 4. analizi <ol><li> Organoids fiksasyonu <ol><li> spinner şişesi kültür wi 14. gününde organoids toplayınbir kesim 1 ml mikropipet (kesim ~ 5 mm) th. 60 mm tabak hepsini koyun ve 3 dakika için sıcak DMEM / F12 5 mL kez yıkayın. </li><li> Sıcak% 4 paraformaldehit 500 uL (PFA) ile 1.5 ml tüp hazırlanır. Dikkat: PFA fiksatif tutarken bir emniyet başlık altında cilt ve göz koruması ve iş giyin. </li><li> her biri ayrı ayrı ve her bir tüp içinde oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca, onları gidermek organoid yerleştirin. daha uzun 60 dakika boyunca organoids düzeltmek etmeyin. organoids taşımak için bir aşılama döngü veya uygun başka herhangi bir vasiyetle kullanın. </li><li> PFA çıkarın ve 1 mL PBS ile her biri 10 dakika için iki kere sabit organoids yıkayın. </li><li> sonraki kullanıma kadar, en fazla 7 gün boyunca 4 ° C&#39;de 1 mL PBS içinde organoids saklayın. </li></ol></li><li> Cryosectioning için organoids katıştırma <ol><li> PBS çıkarın ve cryofreezing önce organoids kurutmak için tüp başına damıtılmış su çözeltisi içinde% 30 sukroz, 1 mL eklemek; Sukro ekledikten sonrase Çözelti organoids yüzeyde yüzen olmalıdır. 4 ° C&#39;de sukroz çözeltisi gece boyunca organoids saklayın; Bir sonraki gün geçtikçe, organoids tüpün dibine batmış olması gerekirdi. Not: gerekirse Organoids, sukroz çözeltisi içinde 4 ° C&#39;de en fazla 3-5 gün saklanabilir. </li><li> Optimum kesme ısısı (OCT), bileşik 400 uL bir vinil numune kalıbı doldurmak ve kalıp merkezindeki bir organoid yerleştirmek için bir aşılama döngü kullanılır. Numune adıyla kalıp kenarını etiketleyin. </li><li> cryosectioning kadar -80 ° C &#39;de organoid içeren kalıp dondurun. </li><li> Kat cam, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 poli-L-lizin çözeltisi (PLL) ile cryoslides ve izin slaytlar, 3 saat boyunca kurutulur. 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın ve kullanmadan önce oda ılımana onları ısıtın. NOT: uzağa yüzmesini Organoid dilim önleyecektir olarak PLL-kaplama, önemli bir adımdır. Toplamak ve en fazla 3 kadar 4 ° C&#39;de saklayın PLL çözeltisiaydır. tekrar kullanılmadan önce, 0.22 mikron bir şırınga ile filtre edilir ve oda sıcaklığına kadar sıcak sağlar. </li><li> PLL kaplı cam üzerinde 20-50 um kalınlığında dilimler halinde Kısım cryofrozen organoids 22 cryoslides. bölümlerle Slaytlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca kurumasına izin verin. daha sonra işlenene kadar -80 ° C&#39;de bölümleri saklayın. </li></ol></li></ol> Organoid Bölümlerin 5. Immunofluorescent Boyama NOT: Nestin, bir sinirsel kök işaretleyici ve Tuj1, bir pan-nöronal marker ile boyama organoids genel karakterizasyonu için, tavsiye edilir. Ek örnekler, mitotik apikal radyal glial hücreleri etiketler fosfo-vimentin (p-um), ve Arl13b ile immünofloresan boyama gibi, kirpiksi cisim için tarif edilmiştir. apoptozu test etmek için, DSB&#39;leri (TdT) dUTP Nick Sonu Etiketleme (TÜNEL) deneyi kullanmaktadır. tozdan korumak için inkubasyon sırasında plastik bir kutu içinde slaytlar yerleştirin, hafif,ve kurutma. <ol><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için slaytlar çözülme. </li><li> PFA-kaynaklı otoflüoresan söndürmek için 3 dakika süre ile PBS-glisin, 200 uL (PBS içerisinde glisin 0.225 g) ile, iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> % 0.5 Triton X-100&#39;ün 200 uL / ​​oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS çözeltisi içinde% 0.1 Tween ile bölümleri permeabilize. </li><li> 3 dakika için PBS-glisin çözeltisi 200 uL ile iki kez yıkanır. </li><li> Spesifik olmayan antijen bağlanma bloke etmek için oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca PBS içinde% 0.5 balık jelatini 200 uL /% 0.1 Triton X 100 ile inkübe edin. NOT: Bir TÜNEL deneme gerekiyorsa, üreticinin protokolüne uygun olarak tahlil gerçekleştirin. ikincil antikorlar müdahale ve sonrasında kullanıldığında fluorophores gidermek edebileceğiniz gibi, immun boyama yapmadan önce TÜNEL tahliline ile başlayın. </li><li> Nestin, 1: aşağıdaki konsantrasyonlarda çözüm engelleme antikorlar seyreltilir 200; p-um, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 1:20; ve ikincil antikorlar, 1: 1,000. </li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de 1-2 saat boyunca, ilk birincil antikor 200 uL (örneğin, Nestin) ile inkübe edin. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> bloke etme çözeltisi içinde 1.000 ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca 200 uL slayt inkübe: ilk (anti-fare 488) sekonder antikoru 1 seyreltin. Şu andan itibaren her zaman ışıktan slaytlar korur. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C (örneğin, Tuj1) aşağıdaki primer antikor 200 uL kuluçkalayın. </li><li> bloke etme çözeltisi, 200 uL 3 x 3 dakika yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bir sonraki ikincil antikor (anti-tavşan 647) 200 uL ekleyin. </li><li> 3 x 3 dakika yıkayın. bloke etme çözeltisi, 200 uL. </li><li> 30 nM konsantre en az 4&#39; , 200 uL, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyinnükleer boyama için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde entration. </li><li> bloke etme çözeltisi 200 uL 2 x 3 dakika yıkayın. </li><li> damıtılmış su 200 uL 1 x 1 dak yıkanır ve belirgin bir su damlası daha fazla görünür hale gelene kadar bölümler, 10-20 dakika boyunca kurumaya bırakın. </li><li> orta gömme bulunduğu bölümleri monte edin. onları birkaç haftaya kadar 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş olarak saklayın. </li><li> görüntüye mikroskopik analizi organoid, ventriküler bölge, ilkel kortikal plaka ve ilgilenilen diğer alanlarında bir bakış ile devam edin. </li><li> 1, 10, kullanılan floresan boya etiketli sekonder antikor göre seçilen bir 63X yağ objektif ve flüoresan filtreler ile konfokal mikroskop kullanın. </li></ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501, 373-379 (2013).</li>
<li>Eiraku, M., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generation+of+three-dimensional+retinal+and+cortical+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues.</a> Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CENPJ+mutation+causes+Seckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome.</a> J Med Genet. 47, 411-414 (2010).</li>
<li>Wollnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+mechanism+for+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A common mechanism for microcephaly.</a> Nat Genet. 42, 923-924 (2010).</li>
<li>Thornton, G. K., Woods, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+microcephaly%3A+do+all+roads+lead+to+Rome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Primary microcephaly: do all roads lead to Rome?</a> Trends Genet. 25, 501-510 (2009).</li>
<li>Barbelanne, M., Tsang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+autosomal+recessive+primary+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly.</a> Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).</li>
<li>Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+in+neural+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proliferation control in neural stem and progenitor cells.</a> Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPAP+promotes+timely+cilium+disassembly+to+maintain+neural+progenitor+pool%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool.</a> EMBO J. 35, 803-819 (2016).</li>
<li>Mak, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+greatly+improve+conversion+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+the+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage.</a> Stem Cells Int. , (2012).</li>
<li>Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+bone+morphogenic+protein+and+activin%2Fnodal+signals+promote+highly+efficient+neural+induction+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells.</a> J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Bai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+analysis+of+genome+alterations+induced+by+single-cell+passaging+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).</li>
<li>Garitaonandia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+risk+of+genetic+and+epigenetic+instability+in+human+embryonic+stem+cells+associated+with+specific+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions.</a> PLoS One. 10, e0118307(2015).</li>
<li>Ohnuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+passage+of+human+pluripotent+stem+cells+by+controlling+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations.</a> Sci. Rep. 4, 4646(2014).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+freezing+and+cryosectioning+E12.5+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Yingling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cell+proliferation+requires+LIS1+for+precise+spindle+orientation+and+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division.</a> Cell. 132, 474-486 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+step+for+the+cell%2C+a+giant+leap+for+mankind%3A+a+hypothesis+of+neocortical+expansion+during+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution.</a> Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).</li>
<li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).</li>
<li>Dhara, S. K., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).</li>
<li>Christie, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+synthetic+retinoid+derivatives+as+inducers+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation.</a> Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+enhancement+of+neural+differentiation+from+human+ES+and+iPS+cells+regardless+of+their+innate+difference+in+differentiation+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.</a> Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).</li>
<li>Gabriel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Zika+Virus+Isolates+Induce+Premature+Differentiation+of+Neural+Progenitors+in+Human+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids.</a> Cell stem cell. , (2017).</li>
<li>Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Characterization+of+a+MYF5+Reporter+Human+iPS+Cell+Line+Using+CRISPR%2FCas9+Mediated+Homologous+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination.</a> Sci. Rep. 6, 18759(2016).</li>
<li>Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genomic+correction+methods+in+human+iPS+cells+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods. 101, 27-35 (2016).</li>
<li>Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Isogenic+Human+iPS+Cell+Line+Precisely+Corrected+by+Genome+Editing+Using+the+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System.</a> Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165, 1238-1254 (2016).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA%2FGlutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162, 375-390 (2015).</li>
<li>D'Avanzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+in+3D+culture%3A+challenges+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives.</a> Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH in vivo ya da insan hücre kültürü, in vitro olarak yaklaşımlar hayvan modellerinde değinmeyecek edilemez bir karmaşık insan nöro hastalıktır. MCPH klinik tezahürü erken nöron başladığında, ilk trimesterde görünmeye başlar. Böylece, 3D beyin organoids MCPH gelişimini modellemek için güvenilir deneysel sistemi temsil etmektedir. Buna ek olarak, 3D insan beyni organoids önemlisi, iii) çeşitli farklılaşma i) çeşitli genetik arka planı olan hasta numunelerinin spektrum...

Böyle mikrosefali gibi İnsan nörogelişimsel bozukluklar, sadece kötü nedeniyle insan beyni uzun bir kortikal yüzeye, insan olmayan hayvanlardan farklı benzersiz bir özelliğe sahip olması nedeniyle hayvan modellerinde incelenebilir. Bu özellik, insan beyin gelişimi yeterli in vitro hücre kültürü sisteminde, bir 2D incelenecek bir karmaşık işlemi yapar. Gelişmekte olan 3D kültür teknikleri uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doku benzeri organoids üretilmesini sağlar. 3B süspansiyon kültüründe pluripotent kök hücrelerinin in vitro farklılaşma organize, tabakalı doku, 1, 2, 3 sebebiyet veren, zamanında ve bölgeye özgü bir şekilde, çeşitli hücre tiplerinin oluşmasını sağlar. 3D kültür teknolojilerini öncülük ve kök hücrelerinden başlayarak, organ oluşumu karmaşıklığını demystified laboratuarlar sayesindeinsan beyin gelişimi erken olayları tanımlamak için ve in vitro, 1, 2, 3 mikrosefali model beyin organoids üreten güçlü bir yöntem geliştirdi. Biz Lancaster ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem adapte olması dikkat çekicidir. serebral organoids 1 oluşturmak için. Bu yöntem deneysel gereksinimlerine göre değiştirildi. Gabriel ve diğerleri arasından bir çalışmanın amacı. beyin gelişimi sırasında nöral kök hücre bakımı hücresel ve moleküler mekanizmaların analiz etmektir. Bunu yapmak için, mekanik bir çalışma mikrosefali hasta 4 türetilen 3D beyin organoids nöral projenitör hücreler (NPC) analiz ederek gerçekleştirildi. Bu hasta CPAP, sentrozom biogenezinin 5 için gerekli olan korunmuş centrosomal proteininde bir mutasyonun taşıdı. Bir yaygın olarak kabul hipoTez mikrosefali NPC havuz tükenmesi sonucu olduğunu ve bu, hücre ölümüne veya erken farklılaşma 1, 6, 7, 8, 9 ya da bağlı olabilir. Mikrosefali beyin organoids ventriküler dilimleri (VZS) analiz ederek, bu NPC önemli sayıda sağlıklı bir vericiden 4 türetilmiş beyin organoids farklı olarak, asimetrik hücre bölünmesinin olmadığı gösterilmiştir. Mikrosefalik beyin organoids kapsamlı mikroskopik ve biyokimyasal analizler zamanında kirpikler sökme 4 CPAP için beklenmeyen bir rol ortaya çıkardı. Spesifik olarak, mutasyona uğramış CPAP NPC 4 erken farklılaşmasına yol açan, gecikmeli kirpik sökme ve gecikmeli hücre döngüsü yeniden giriş ile bağlantılıdır. Bu sonuçlar mikrosefali ve th cilia bir rol oynadığını düşündürmektedirnörogenez ve beyin büyüklüğü kontrol 10 sırasında EIR tutulumu. Bu protokolün birinci parçası homojen beyin organoids oluşturmak için üç aşamalı bir yöntemi bir açıklamasıdır. Daha önce belirtildiği gibi, orijinal Lancaster protokol adapte ve amacımızı 1 uyacak şekilde değiştirildi. İlk olarak, insan iPSCs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris üzerinde tanımlı bir besleyici içermeyen durumda kültürlenir. Bu adım, besleyici bağımlı pluripotent kök hücre kültürlerinin varyasyonları önler. Bu protokol, sinir farklılaşmasının indüksiyonu, sinir epiteli iPSCs şirketinden başlar oluşturulur. embriyoit gövde (EB) oluşturma aşamasını, daha kontrollü ve yönlendirilmiş bir şekilde sinir farklılaşma ilerler atlanarak. Bu yaklaşım, mezoderm ve endoderm gibi germ hücre katmanları, spontan ve yönsüz oluşumunu kısıtlar. Bu protokolü uygulayarak, nöral rozetler içeren Neurospheres EH için 5. günde hasat edilebilirS matrisi gömme ve sabit süspansiyon kültürü. Protokolde üçüncü adımı için kullanılan Organoid ortam dorsomorphin ve SB431542 ile takviye edilir. Dorsomorphin kemik morfojenik protein (BMP), küçük moleküllü inhibitörüdür ve SB431542 TGF / aktivin / düğüm sinyal yolunu inhibe eder. Bu faktörler bir araya sinir farklılaşmasını daha etkili bir tek 11, 12, 13, 14-cis retinoik asit teşvik edebilir. Hep birlikte, bu modifikasyonların organoids boyunca en az varyasyonları ile, beyin organoids tekrarlanabilir üretilmesini mümkün kılmak. Önemli olarak, bu yöntem sağlam sentrozom ve hücre döngüsü dinamiklerini etkileyen genlerinde mutasyon taşıyan hasta iPSCs gelen mikrosefalik beyin organoids oluşturmak için uygulanmıştır. Bu protokolün ikinci bölümü br hazırlamak için talimatlar verirain analizi ve mikrosefali hücresel kusurların yorumlanması için organoids. Bu tespit, krio-bölümleme, immünofloresan boyama ve odaklı mikroskopik analiz içerir. Bu protokol beklenen sonuçların ayrıntılı bir açıklama ile ve yorumlanması için rehberlik okuyucu sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Beyin organoids üretilmesi, sürekli kültürleme (Şekil 1A), en az üç hafta gerekir. tekrarlanabilir sonuçlar başarmak için araştırmacı her adımda belgeleyen ve daha da önemlisi, orta bileşenleri, zaman noktaları ve baz muameleleri ile ilgili herhangi bir değişiklik önler öneririz. Burada, kritik kilometre taşları deney sonunda yeterli kalitede organoids elde etmek için ulaşılır eğer nasıl değerlendirileceğini bir özetini verir. 96 oyuklu bi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders at JoVE.com

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

generation-ipsc-derived-human-brain-organoids-to-model-early

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K Görüntüleme.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

Video: Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC'den Türetilmiş HPC'leri Kullanarak Yerleşik Mikroglia ile İnsan Beyni Organoidlerinin Üretilmesi

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Orta Beyin Organoidlerinin Üretilmesi

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental defects whose underlying mechanisms remain to be elucidated. A major roadblock is the lack of effective models recapitulating the early-onset neuronal impairment seen in the patients. Advances in the technology of induced pluripotent stem cells (iPSCs) enable the generation of three-dimensional (3D) brain organoids that can be used to investigate the impact of diseases on the development and organization of the nervous system. Researchers, including these authors, have recently introduced human brain organoids to model mitochondrial disorders. This paper reports a detailed protocol for the robust generation of human iPSC-derived brain organoids and their use in mitochondrial bioenergetic profiling and imaging analyses. These experiments will allow the use of brain organoids to investigate metabolic and developmental dysfunctions and may provide crucial information to dissect the neuronal pathology of mitochondrial diseases.

We describe a detailed protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived brain organoids and their use in modeling mitochondrial diseases.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Orta Beyin Organoidlerinin Üretilmesi

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi