Diese Arbeit wurde von der Fritz-Thyssen-Stiftung (Az.10.14.2.152) unterstützt. Wir sind dankbar, dass die Gewebeeinbettung Anlage und das Mikroskop Core Facility des ZMMK. Wir sind dankbar für die Diskussionen und technische von den Mitgliedern des Labors für Zentrosom und Zytoskelett Biologie unterstützt. Wir danken Li Ming Gooi das Manuskript für das Korrekturlesen.

1. Erzeugung von Brain Organoide (23 Tage) <ol><li> Initiierung von Neuroektoderms (5 Tage) HINWEIS: Die folgenden Punkte sollten vor dem Beginn der Differenzierung in Betracht gezogen werden. Die Umprogrammierung Methode (lentiviral-, Sendai-Virus-, Episomen oder microRNA-Basis etc.) menschlichen iPSCs erhalten sollte idealerweise die gleiche für alle Patienten und iPSC Leitungen steuern. Verschiedene Umprogrammierung Kits und Anweisungen auf der Grundlage veröffentlichter Protokolle sind 15, 16, 17, 18. Die Qualität der menschlichen iPSC Linien ist der Schlüssel für eine optimale Differenzierung zu erreichen. Überwachen Kolonie und der Zellmorphologie mit einem Mikroskop und validieren Pluripotenz durch Testen der Expression von Markern wie Oct3 / 4, Nanog oder TRA-1-60. <ol><li> Kultur menschlicher iPSCs unter feeder freien Bedingungen in Medium A auf einem Teller beschichtet mit Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) Matrix. HINWEIS: Wachsen menschliche iPSCs feeder freie und serumfreien Kultur mit einem definierten Zustand zu erhalten und einen zusätzlichen Schritt zur Entfernung von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) vor Beginn der Differenzierung zu vermeiden. Die optimale Durchgangszahl für die menschlichen iPSCs zur Differenzierung im Bereich von Kanal 15 bei Neuprogrammierung zu Durchgang 70 insgesamt zu starten. Wenn Passagierung lösen hiPSC Kolonien als Zellen, die mit geringer mechanischer Belastung eine geeignete Zellentfernungslösung aggregate verwendet und eine 2-ml serologische Pipette Aggregate auf eine neue Schale zu übertragen. Vermeiden Sie Dissoziation auf einzelne Zellen, wie diese Differenzierung induzieren könnte und Apoptose in den meisten iPSC Linien. Es wurde berichtet , dass eine langfristige, Single-Cell - Passagierung genomische Veränderungen in der menschlichen 19 iPSCs erhöhen könnte, 20. Vermeiden Zellablösung Verfahren, die einen Zentrifugationsschritt erforderlich Entfernungslösung zu entfernen, da dies die Gesamtfähigkeit der iPSCs reduziert. Testalle Kulturen für mikrobielle Kontaminationen, insbesondere Mykoplasmen, auf einer regelmäßigen Basis, denn dies könnte die Qualität der iPS-Zellen und deren Differenzierungsfähigkeit verändern. <ol><li> Mantel eine 60 mm-Gewebekulturschale mit EHS-Matrix gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Auftauen eines Aliquots von 1 × 10 6 menschlichen iPSCs. Same ist das iPSCs in einer 60-mm - Gewebekulturschale in beschichtet EHS - Matrix und die 5 ml Medium A (siehe Materialien Tabelle). Ändern Sie das Medium täglich und Durchgang nach 5 bis 7 Tagen, wenn die Zellen erreichen ~ 80% Konfluenz. HINWEIS: Die Passage die aufgetaute iPSCs bei 80% Konfluenz unter Verwendung von Standardverfahren, wie beispielsweise die enzymfreie Ablösung von Kolonien 21, mindestens einmal , bevor die Differenzierung beginnt. Kurz gesagt, entfernen Sie das iPSC Medium, waschen Sie die einmal Zellen mit vorgewärmten 37 ° C Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium: Nährsalzgemisch F12 (DMEM / F12) und inkubieren Sie die iPS-Zellen nach Angaben des HerstellersReagenz A Anweisungen (siehe die Material Tabelle). Überschreiten Sie die empfohlene Inkubationszeit nicht um Dissoziation zu einzelnen Zellen zu vermeiden. Menschliche iPS sollte abgelöst und variabel als Aggregate werden, nicht als einzelne Zellen. Sie können dann auf neue EHS-Matrix-beschichteten Schalen übertragen werden; iPSC beispielsweise Aggregate, die aus einer 60-mm-Schale zu 4 neuen Schalen mit 60 mm verteilt werden kann. </li><li> Überprüfen Sie für Mykoplasmen mit einem Mycoplasma Detection Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur Mycoplasma frei iPSCs, wie Mykoplasmen die Differenzierungsfähigkeit von iPS-Zellen verändern können. </li></ol></li><li> Dissoziieren iPSCs (80% konfluent) und bereite Reagenz B. eine Einzelzellsuspension unter Verwendung von <ol><li> Waschen Sie die iPSCs einmal mit vorgewärmten (37 ° C) DMEM / F12. </li><li> Fügen vorgewärmten Reagens B ( zum Beispiel 1 ml in einer 60 mm - Schale) und inkubiere die iPSCs für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Flick 20 mal mit einer Fingerspitze auf den Seiten und am Boden vondie Schale, die die iPSCs abzulösen. Überprüfen Sie für die Ablösung von Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Pipette, um die Zellsuspension nach oben und unten in der Schüssel 5 mal mit einer 1-ml-Mikropipette. </li><li> 3 ml Medium A 1 ml Reagens B zu verdünnen und die Zellsuspension in eine 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. </li><li> Spin-down vorsichtig die iPS-Zellen (500 × g) für 4 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml Medium B, und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen. Hinweis: Beachten Sie nur Medium B für Aufwirbelung mit. Vermeiden Medium A verwendet wird, da sie eine zu hohe Konzentration an bFGF enthält, die die Differenzierung inhibieren könnten. </li></ol></li><li> Verdünne die Zellsuspension auf 4,5 x 10 5 Zellen pro ml in Medium B , ergänzt mit 10 &amp; mgr; M rho-assoziiertes Protein - Kinase - Inhibitor (Y-27632). </li><li> Je 100 &amp; mgr; l pro Vertiefung in einer nicht-haftenden, V-Boden, 96-Well-Platte. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig im sus verteiltpension von der Röhre ausgeschüttelt, bevor 100 ul-Portionen Entnahme. Es ist wichtig, dass jede Vertiefung eine äquivalente Anzahl von Zellen, um Neurosphären enthalten sollte homogen in der Größe und Form (rund, definierten Oberflächen) zu erhalten. </li><li> Spin sanft die Platte mit den Zellen nach unten bei 500 xg und Raumtemperatur für 3 min und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie das Medium täglich um 50 &amp; mgr; l Entfernen und Hinzufügen von 50 &amp; mgr; l frischem Medium B in jede Vertiefung für die nächsten 5 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Embedding Neurosphären in EHS-Matrix (4 Tage) <ol><li> Bereiten Neurosphäre Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 ohne (w / o) Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM), 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / L insulin, und 0,05 mM β-Mercaptoethanol. </li><li> Sammeln Sie die Neurosphären witha 200 &amp; mgr; l Mikropipette eine ~ 2 mm Spitze zuvor geschnitten mit einer sterilen Schere verwenden. </li><li> Platzieren Sie die Neurosphären etwa 5 mm voneinander entfernt auf Paraffinfilm (3 x 3 cm 2) in einer leeren 100 - mm - Schale und vorsichtig entfernen , so viel des verbleibenden Mediums wie möglich. </li><li> Einen Tropfen (7 &amp; mgr; l) von EHS Matrix auf jeden einzelnen Neurosphäre. </li><li> Inkubieren der Matrix mit den EHS Neurosphären für 15 min in einem Inkubator abfällt. </li><li> Waschen Sie die Neurosphären vorsichtig aus dem Paraffinfilm, indem sie mit Neurosphere Spülmedium. Zu spülen, verwenden, um eine 1 ml-Mikropipette und 100 mm-Petrischale, die 10 ml Medium Neurosphäre. </li><li> Inkubiere die Neurosphären für die nächsten 4 Tage und mit 2 ml frischem Neurosphere Medium am Tag 2. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Regale in dem Inkubator flach sind, so dass die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären nicht zusammen auf einer Seite des Tellers verklumpen werden. </li></ol> 3. Organoide in einem Rotations SuspensionKultur (14 Tage) <ol><li> Bereiten brain organoiden Medium durch Vermischen der folgenden Bestandteile: 1: 1-Mischung aus DMEM / F12 und Medium C (v / v), 1: 200 (v / v) Supplement 1, 1: 100 (v / v) Ergänzung 2 w / o Vitamin A, 1: 100, L-Glutamin, 0,05 mM MEM, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1,6 g / l Insulin, 0,5 uM Dorsomorphin, 5 &amp; mgr; M SB431542 und 0,05 mM β-Mercaptoethanol. </li><li> 100 ml Gehirn organoiden Medium zu jedem Zentrifugenkolben durch seine Seitenarme und sie in einem Inkubator für die Vorwärmung für mindestens 20 min. </li><li> Stellen Sie ein mitreißendes Programm bei 25 Umdrehungen pro Minute auf, nach dem Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Bevor Sie die EHS-Matrix eingebettete Neurosphären in Rotationskolben übertragen, stellen Sie sicher, dass sie alle voneinander getrennt sind. Wenn zwei oder mehr durch EHS-Matrix verbunden sind, trennen sie von der Verbindungsmatrix mit einem Skalpell geschnitten wird. </li><li> übertragen sorgfältig die EHS-Matrix eingebettet Neurosphären in Rotationskolben, enthaltend 100 ml Medium organoiden using eine 2 ml serologische Pipette. Verwenden, um die Seitenarme des Spinner-Flasche, die Neurosphären in den Kolben zu übertragen. </li><li> Platzieren Sie die spinner flasks auf einem Magnetrührstab Plattform in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2; dies ist Tag 0 der organoiden Kultur. </li><li> Ändern Sie das Medium einmal pro Woche (oder öfter, wenn es eine Farbänderung) um die Hälfte des Mediums entfernt und Zugabe der gleichen Menge an frischem Medium. HINWEIS: aus dem Inkubator Wenn die Spinnerflaschen nehmen, warten 3-5 min die Organoide sinken bis auf den Boden des Kolbens zu lassen. Entfernen des Mediums durch die Glaspipettenspitze Platzierung (mit einer Pumpe) auf der Oberfläche der Flüssigkeit; anzusaugen, das Medium vorsichtig durch eine Seitenöffnung / Arm des Kolbens. Diese Manipulationen müssen unter der laminaren Haube erfolgen. </li></ol> 4. Analyse von Brain Organoide <ol><li> Fixierung von Organoiden <ol><li> Sammeln Sie die Organoide am Tag 14 der Rührflasche Kultur with einen Schnitt 1 mL Mikropipette (cut ~ 5 mm). Legen Sie alle von ihnen in einer 60-mm-Schale und waschen Sie sie einmal mit 5 ml warmem DMEM / F12 für 3 min. </li><li> Vorbereiten ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 &amp; mgr; l warm 4% Paraformaldehyd (PFA). Achtung: Tragen Sie Haut- und Augenschutz und das Arbeiten unter der Schutzhaube bei PFA Fixativ Handhabung. </li><li> Platzieren jeder organoiden separat in jedem Röhrchen und fixieren sie für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sie nicht die Organoide länger als 60 min beheben. Um die Organoide zu bewegen, eine Impföse oder andere devise verwenden, die bequem ist. </li><li> Entfernen Sie die PFA und wäscht die Fest Organoide zweimal für jeweils 10 min mit 1 ml PBS. </li><li> Lagern Sie die Organoide in 1 ml PBS bei 4 ° C für bis zu 7 Tage, bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li><li> Das Einbetten der Organoide für Kryoschneiden <ol><li> Entfernen Sie die PBS und füge 1 ml 30% Saccharose in destilliertem Wasser Lösung pro Röhrchen der Organoiden zu entwässern, bevor sie cryofreezing; nach der Zugabe von Sucrose Lösung sollte die Organoide an der Oberfläche schwimmen. Lagern Sie die Organoide über Nacht in Saccharose-Lösung bei 4 ° C; am nächsten Tag haben die Organoide sollten den Boden des Röhrchens herabgesunken. HINWEIS: Organoide kann für bis zu 3-5 Tage bei 4 ° C in einer Zuckerlösung bei Bedarf gespeichert werden. </li><li> Füllen eine Vinylprobenform mit 400 ul optimaler Schnitttemperatur (OAT) -Verbindung und die Verwendung eine Impföse eine organoiden in der Mitte der Form zu platzieren. Beschriften den Rand der Form mit dem Probennamen. </li><li> Einfrieren die organoiden haltigen Form bei -80 ° C bis Kryoschneiden. </li><li> Coat Glas cryoslides mit 0,1% Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) in PBS für 5 min bei Raumtemperatur und ließ die Objektträger trocknen 3 Stunden. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C und erwärmen sie vor dem Gebrauch auf Raum gemäßigten bis. HINWEIS: Die PLL-Beschichtung ist ein wichtiger Schritt, da er die organoiden Scheiben aus davonzuschweben zu verhindern. Sammeln und Speichern von PLL-Lösung bei 4 ° C für bis zu 3Monate. Vor der Wiederverwendung filtert es mit einer 0,22-um-Spritze und lassen Sie es auf Raumtemperatur warm. </li><li> Abschnitt cryofrozen Organoiden in 20-50 um dicke Scheiben auf PLL-beschichtete Glas cryoslides 22. Lassen Sie die Folien mit den Abschnitten 1 h bei Raumtemperatur trocknen. Speichern der Abschnitte bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung. </li></ol></li></ol> 5. Immunfluoreszenzanfärbung von organoiden Sections HINWEIS: Für die allgemeine Charakterisierung von Organoiden, mit nestin Färbung, ein neuralen Vorläufer Marker und TuJ1, ein pan-neuronalen Marker, wird empfohlen. Als weitere Beispiele, Immunofluoreszenzfärbung mit phospho-Vimentin (p-VIM), die mitotische apikalen radialen Gliazellen Etiketten und Arl13b, für Flimmer, werden beschrieben. Um zu testen, die Apoptose, verwenden Sie die Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) -Test. Legen Sie die Folien in einer Kunststoff-Box während der Inkubationen sie vor Staub zu schützen, Licht,und auszutrocknen. <ol><li> Tauen Sie die Folien für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen des Objektträgers zweimal mit 200 ul PBS-Glycin (0,225 g Glycin in PBS) für 3 min, um die PFA-induzierte Autofluoreszenz zu löschen. </li><li> Permeabilisieren die Abschnitte mit 200 ul 0,5% Triton X100 / 0,1% Tween in PBS-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie sie zweimal mit 200 ul PBS-Glycin-Lösung für 3 min. </li><li> Inkubieren sie mit 200 ul 0,5% Fischgelatine / 0,1% Triton X100 in PBS für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C Bindung unspezifischer Antigen zu blockieren. HINWEIS: Wenn ein TUNEL-Test erforderlich ist, führen Sie den Test gemäß dem Protokoll des Herstellers. Beginnen Sie mit dem TUNEL-Test vor der Immunfärbung durchgeführt wird, wie es mit sekundären Antikörpern stören könnten und Fluorophore löschen, wenn danach verwendet. </li><li> Verdünne die Antikörper in Blocking-Lösung in den folgenden Konzentrationen: Nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; TuJ1, 1: 200;Arl13b, 01.20; und sekundärer Antikörper, 1: 1000. </li><li> Inkubieren mit 200 &amp; mgr; l der ersten primären Antikörpern (zB Nestin) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Verdünne die erste (anti-Maus 488) Sekundärer Antikörper: 1: 1000 in Blocking-Lösung und den Objektträgers in 200 &amp; mgr; L für 1-2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Von nun an schützt immer die Folien aus Licht. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Inkubieren mit 200 &amp; mgr; l des nächsten primären Antikörper (zB TuJ1) für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen 3 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; L des nächsten sekundären Antikörpers (Anti-Kaninchen-647) für 1-2 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen 3 x 3 min. mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; l von 4&#39; , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer 30 nM concentration in PBS für 15 min bei Raumtemperatur für die Kernfärbung. </li><li> Waschen 2 x 3 min mit 200 ul Blockierungslösung. </li><li> Wäsche 1 x 1 min mit 200 ul destilliertem Wasser und lassen die Abschnitte für 10-20 min trocknen, bis kein offensichtlicher Wassertropfen mehr sichtbar ist. </li><li> Montieren der Schnitte mit Medium einbettet. Lagern Sie sie von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu mehreren Wochen. </li><li> Fahren Sie mit der mikroskopischen Analyse zu Bild einen Überblick über die organoiden, ventrikulären Zone, primitive Kortikalplatte und andere Bereiche von Interesse. </li><li> Verwenden , um ein konfokales Mikroskop mit einem Objektiv und 63X Ölfluoreszenzfilter, ausgewählt gemäß dem Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sekundärantikörper 1 verwendet wird , 10. </li></ol>

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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

MCPH ist eine komplexe menschliche Erkrankung des Nervensystems , die nicht in Tiermodellen in vivo oder in einfachen menschlichen Zellkulturansätze in vitro rekapituliert werden kann. Die klinische Manifestation der MCPH beginnt während des ersten Trimesters zu erscheinen, wenn sie früh beginnt die Neurogenese. Somit stellen die 3D Gehirn Organoide ein zuverlässiges experimentelles System MCPH Entwicklung zu modellieren. Darüber hinaus 3D menschliches Gehirn Organoide ist ein idealer Ansatz, da i) sie ermöglichen die Anpassung eines Spektrum von Patientenproben mit verschiedenen genetischen Hintergründen, ii) sie organisiertes Gewebe zeigen Typen unterschiedliche neuronale Zelle enthält, und, was wichtig ist, iii) verschiedene Differenzierung Stadien der Entwicklung des Nervensystems in diesem in vitro - Ansatz werden auf ihre in vivo Pendants verbunden 25, 26, 27. Zum Beispiel ist die neuronale Rosette eine äquivalente Struktur zu der Entwicklungs neuronalenTube. Lancaster et al. die doppelte Anzahl von Patienten verwendet iPSCs iPSCs verglichen zu steuern, um bei der Erzeugung von Patienten Organoide erfolgreich zu sein. Bemerkenswert ist , mit dem Protokoll hier beschrieben, durch die bestehenden Methoden zu modifizieren, könnten wir 4 Startsteuerung und Mikrozephalie Gehirn Organoide aus den gleichen Zellzahlen generieren. Dies war möglich durch die definierten Kulturbedingungen iPSCs und aufgrund einer gerichteten Differenzierung. In diesem Protokoll wurde organoiden Generation verbessert, indem den häufigsten durchgeführten EB Bildungsschritt ersetzt durch neuronale Differenzierung direkt von iPSCs einleitet. Zweitens in Schritt 3 Dorsomorphin und SB431542 wurden in das Kulturmedium allein anstelle von Retinsäure ergänzt. Retinsäure isomerisiert wird leicht , wenn das Zellkulturmedium 28 angelegt. Daher ist seine biologische Aktivität weniger definiert als die von stabileren Verbindungen wie Dorsomorphin. Dorsomorphin hemmtder BMP4 Signalweg und SB431542 ist ein Inhibitor des Activin / Knoten Signalweg (TGF-β1 ALK-Inhibitor). Eine Kombination beiden Verbindungen führt zur Hemmung der BMP und das Aktivin / Knoten Signalweg induziert neuronale Differenzierung und reduziert die Differenzierung in andere Linien in verschiedenen Zelllinien aus menschlichem ES oder humanen iPS - Zellen mit einer ähnlichen Effizienz 29. Verbindung Stabilität und universelle Zellantwort auf eine Verbindung , sind wichtige Punkte für ein Protokoll zur Festlegung, die an verschiedene Zelllinien Patienten angewandt werden kann , um eine Krankheit in vitro zu modellieren. So organoiden ein robustes und effiziente Differenzierung Ergebnisse in homogenem Gehirn Kulturen und schließlich in reproduzierbaren Daten. Mit diesen Modifikationen kritische Schritte in dem Protokoll zur Einleitung der Differenzierung in Schritt 1. An dieser Stelle minimiert werden, ist es wichtig, die iPSCs in eine Einzelzellsuspension eines sanft dissoziierennd zu verteilen, sie genau und gleichmäßig in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Rho-assoziiertes Protein-Kinase-Inhibitor (Y-27632) muss während der ersten 24 h zu Medium B zugegeben werden, da sie die Überlebenszeit von iPSCs bei ihrer Dissoziation einzelner Zellen unterstützt. Es ist wichtig, Zellen in engen Kontakt miteinander zu bringen, indem sie bis auf den Boden der Vertiefungen zu drehen. Sobald Neurosphären am Ende von Schritt 1 gebildet werden, kann der erfolgreiche Abschluss des weiteren experimentellen Verfahrens zu erwarten. Im Fall neurospheres die Pluripotenz der humanen iPS-Zellen nicht bilden, die Nichteinhaltung der Zellen in 96-Well-Platte, und die Schleudert Bedingungen zu prüfen. Das gesamte Verfahren am Tag 0 von Schritt 1 soll nicht länger als 1 h aufgrund der Empfindlichkeit der menschlichen iPS-Zellen. Medium Änderungen in den folgenden Tagen muss sorgfältig durchgeführt werden, Scherkräfte zu vermeiden, um nicht zu zerstören frisch gebildete Zellkontakte zwischen den Zellen. Es ist bemerkenswert, dass centrosomal-Mutanten haben defekte Zellproliferation und veränderten Zellzyklus-Dynamik. Somit erfordert MCPH Modellierung ein leistungsfähiges Protokoll, das die Zellfunktionen beeinträchtigt standhalten kann. Daher erlaubt das aktuelle Protokoll für die Erzeugung von homogenen Organoide von hohen Qualität und dient als ein einzigartiges Werkzeug Stammzelle Homöostase im VZ zu studieren. Im Gegensatz zu anderen Protokollen ermöglicht dieses Protokoll, um die Erzeugung von Organoiden von Kontroll- und Patienten iPSCs mit gleichen Zellzahlen beginnen. Für Studien , basierend auf in vitro Differenzierung identische Kulturbedingungen für verschiedene iPSCs sind eine Grundvoraussetzung krankheitsbedingten Veränderungen und zu vermeiden Kultur-Zustand Artefakte zu identifizieren. Neben der Modellierung Mikrozephalie genetischen Ursprungs, kann dieses Protokoll auch auf Mikrozephalie von nicht-genetischem Ursprung angewandt werden, einschließlich von neurotrophic viralen Infektionen, Chemikalien oder Strahlung. 30 Darüber hinaus moderne Molekularbiologie - Tools wie CRISPR / Cas9 genom bearbeitening Technologien können auf 3D Organoide angewendet werden , um spezifische Aspekte des menschlichen Gehirns Entwicklungsparadigma in 31 vitro sezieren, 32, 33. Auf der anderen Seite hat sich die Erzeugung von Gehirn Organoide bisher noch nicht über den ersten und frühen zweiten Trimester der menschlichen Entwicklung 34 gegangen. Überschreiten diese Einschränkung und ermöglicht die Erzeugung von reifen Gehirns Organoiden in vitro würden neue Wege öffnen , um neurodegenerative Erkrankungen zu modellieren , die in späteren Stadien manifestieren, wie beispielsweise Parkinson oder Alzheimer-Krankheit. Für zukünftige Anwendungen, Protokolle Differenzierung spezifischer Regionen, wie das Vorderhirn oder das Mittelhirn zu leiten, könnte von Interesse sein , komplexe neurologische Störungen zu untersuchen wie Autismus und Schizophrenie 35, 36, 37, </sbis&gt; 38. Wichtig ist, dass bestimmte Aspekte berücksichtigt werden, wenn Schlussfolgerungen aus organoiden Studien zeichnen. Die erste Einschränkung besteht darin, dass es keine offensichtliche Vaskularisierung in Organoiden ist. Somit Gasaustausch und Nährstoffversorgung in vitro nur annähernd in vivo Bedingungen. Zweitens, da Gehirn Organoide nicht zu komplexen Organsystemen verbunden ist, mangelt es das organoiden Modell eine vollständige Immun, Stoffwechsel- und Hormonsystem. Dennoch stellt das Fehlen dieser Aspekte manchmal einen Vorteil. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Organoide können immunsupprimierten in - vivo - Modelle ersetzen , wenn die Wirkung des Immunsystems in der Pathogenese von Erkrankungen des Gehirn Adressierung. Mit dem Einsatz von Spinnerflaschen, kann eine große Anzahl von Organoiden für biochemische Experimente erzeugt wird, ganze Transkriptom-Sequenzierung Analyse und Hochdurchsatz-Drogenscreenings. Zusammengenommen mit usingt dieses aktuelle Protokoll kann ein Gehirn Organoide aus menschlichen iPS-Zellen erzeugen, die dann in einem breiten Spektrum von Anwendungen eingesetzt werden können, von Krankheit Modellierung Drogentestplattformen, um zuverlässig Tierversuche in Zukunft zu ersetzen.

Menschliche Entwicklung des Nervenstörungen, wie Mikrozephalie, nur schlecht in Tiermodellen untersucht werden, aufgrund der Tatsache, dass das menschliche Gehirn haben eine erweiterte kortikalen Oberfläche, ein einzigartiges Merkmal der sich von nicht-menschlichen Tieren. Dieser Aspekt macht die menschliche Entwicklung des Gehirns einen komplexen Prozess, der nicht ausreichend in einem 2D untersucht werden, in vitro Zellkultursystem. Schwellen 3D-Kulturtechniken ermöglichen die Erzeugung von gewebeähnlichen Organoide aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS). Die in - vitro - Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in einer 3D - Suspensionskultur ermöglicht die Bildung von verschiedenen Zelltypen in einer angemessenen und regionsspezifische Weise, was zu einem organisierten, geschichteten Gewebe 1, 2, 3. Dank Laboratorien, die 3D-Kulturtechnologien Pionierarbeit geleistet und die Komplexität der Organbildung entmystifiziert, aus Stammzellen beginnen,entwickeln wir eine robuste Methode Gehirn Organoide der Erzeugung frühe Ereignisse der menschlichen Gehirn Entwicklung zu beschreiben und Mikrozephalie in vitro 1, 2, 3 zu modellieren. Es ist bemerkenswert , dass wir die ursprüngliche Methode , entwickelt von Lancaster et al angepasst. zerebrale Organoide 1 zu erzeugen. Diese Methode wurde nach unseren experimentellen Anforderungen modifiziert. Das Ziel einer Studie von Gabriel et al. war die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Stammzell Wartung während der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen. Um dies zu tun, wurde eine mechanistische Studie durch die Analyse von neuralen Vorläuferzellen (NSC) in 3D durchgeführt Gehirn Organoide von einem Patienten stammte Mikrocephalie 4. Dieser Patient trug eine Mutation in CPAP, ein konserviertes Protein zentrosomalen für Zentrosom Biogenese 5 erforderlich. Eine weithin akzeptierte hypoThese ist , dass Mikrocephalie das Ergebnis einer Erschöpfung des NPC - Pools ist, und dies könnte entweder zum Zelltod oder zu einem vorzeitigen Differenzierung 1, 6, 7, 8, 9 liegt. Durch die Analyse der ventrikulären Zonen (VZs) von Mikrocephalie brain Organoiden, wurde gezeigt , dass eine beträchtliche Anzahl von NSC asymmetrischer Zellteilung zu unterziehen, im Gegensatz zu Gehirn Organoide von einem gesunden Spender stamm 4. Umfangreiche mikroskopische und biochemische Analysen von microcephalic Gehirn Organoide ergab eine unerwartete Rolle für CPAP in rechtzeitige Zilien Demontage 4. Insbesondere mutierte CPAP mit retardierten cilium Demontage- und verzögerte Zellzyklus - Wiedereintritt verbunden ist , auf die Differenzierung von vorzeitiger NSC führenden 4. Diese Ergebnisse legen nahe, eine Rolle für Zilien in Mikrozephalie und thEIR Beteiligung während der Neurogenese und Gehirngröße Kontrolle 10. Der erste Teil dieses Protokolls ist eine Beschreibung eines dreistufigen Verfahrens homogene brain Organoiden zu erzeugen. Wie bereits erwähnt, wurde das ursprüngliche Lancaster Protokoll angepasst und modifiziert unser Ziel 1 zu entsprechen. Erstens sind menschliche iPSCs Kultur in einem definierten feeder freien Zustand auf Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix. Dieser Schritt vermeidet die Variationen von Feeder-abhängigen pluripotenten Stammzellkulturen. In diesem Protokoll zur Induktion neuronaler Differenzierung zu bilden direkt von iPSCs neuralen Epithel beginnt. Durch den Embryoidkörper (EB) Bildungsschritt übersprungen, die neurale Differenzierung erfolgt in einer kontrollierteren und Weise gerichtet. Dieser Ansatz begrenzt die spontane und ungerichteten Bildung anderer Keimzellschichten, wie Mesoderm und Endoderm. Durch dieses Protokoll anwenden, können Neurosphären neuronale Rosetten enthalten am Tag geerntet werden 5 für EHS-Matrix und Einbettung stationäre Suspensionskultur. Das organoiden Medium für den dritten Schritt unseres Protokolls verwendet wird mit Dorsomorphin und SB431542 ergänzt. Dorsomorphin ist ein niedermolekularer Inhibitor von knochenmorphogenes Protein (BMP) und SB431542 hemmt die TGF &amp; bgr; / Activin / Knoten Signalweg. Die Kombination dieser Faktoren könnte neuronale Differenzierung mehr fördert effizienter als Retinsäure allein 11, 12, 13, 14. Insgesamt ermöglichen diese Modifikationen die reproduzierbare Erzeugung von brain Organoide mit minimalen Variationen in Organoiden. Wichtig ist, dass diese Methode microcephalic Gehirn Organoide von Patienten zu iPSCs robust erzeugt aufgebracht, die Mutationen in Genen tragen, die Zentrosomen und Zellzyklusdynamik beeinflussen. Der zweite Teil dieses Protokolls gibt Anweisungen br vorzubereitenain Organoide für die Analyse und Interpretation von zellulären Defekte in Mikrozephalie. Dazu gehören Fixierung, Kryoschneiden, Immunofluoreszenzfärbung und konfokale mikroskopische Analyse. Dieses Protokoll wird dem Leser eine detaillierte Beschreibung der erwarteten Ergebnisse liefern und mit Anleitung zur Interpretation.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>Arl13b</td><td>proteintech</td><td>17711-1-AP</td><td>ARL13B rabbit polyclonal antibody&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CELLSPIN system</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>183001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>32670</td><td>4&amp;prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco, US</td><td>31331093</td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P5499</td><td>Compound C; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Embedding medium</td><td>AppliChem</td><td>A9011, 0100</td><td>Mowiol; embedding medium; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified</td></tr><tr><td>Fish gelatin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>G7765-250ML</td><td>Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>A1067,1000</td><td>Glycine for molecular biology; multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inoculation loop with needle, disposable (1 &amp;micro;L)</td><td>Sigma Aldrich, US</td><td>BR452201-1000EA</td><td>multiple suppliers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I3536-100MG</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, US</td><td>25030081</td><td>L-glutamine (200 mM)</td></tr><tr><td>Medium A</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05850</td><td>mTeSR1 (hiPSC medium)</td></tr><tr><td>Medium B</td><td>Stem cell technologies</td><td>#05835</td><td>Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium</td></tr><tr><td>Medium C</td><td>Gibco, US</td><td>21103049</td><td>Neural Basal Medium</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco, US</td><td>11140035</td><td>MEM non-essential amino acids solution (100x)</td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza, Switzerland</td><td>#LT07-218</td><td>Mycoplasma detection kit; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Novus biologicals</td><td>NBP1-92717</td><td>Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>AppliChem</td><td>A3813, 0500</td><td>4% in PBS, store solution at -20 &amp;deg;C; caution: wear skin and eye protection and work under hood&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco, US</td><td>18912014</td><td>See manufacturer&amp;acute;s instructions; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco, US</td><td>15140122</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P8920-100ML</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>pVim</td><td>MBL</td><td>D076-3S</td><td>Phospho-Vimentin (Ser55) mAb</td></tr><tr><td>Reagent A&amp;nbsp;</td><td>Stem cell technologies</td><td># 05872</td><td>Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer&amp;acute;s protocol; alternative products from muliple suppliers available</td></tr><tr><td>Reagent B&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>A6964-100ML</td><td>Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 &quot;enzymatic cell dissociation solution&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Research Cryostat Leica CM3050 S</td><td>Leica biosystems</td><td>CM3050 S</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1067</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Spinner flask 250 mL</td><td>IBS Integra Bioscience</td><td>182026</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734, 1000</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Superfrost ultra plus microscope slides</td><td>Thermo scientific, US</td><td>J3800AMNZ</td><td>Slides should be labeled with a &quot;+&quot; and positively charged</td></tr><tr><td>Supplement 1</td><td>Gibco, US</td><td>17502048</td><td>N-2 supplement (100x)</td></tr><tr><td>Supplement 2 w/o Vitamin A</td><td>Gibco, US</td><td>12587010</td><td>B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, NL</td><td>4565</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura, NL</td><td>4583</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A1388,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T2200</td><td>&amp;beta;-Tubulin III (rabbit polyclonal)</td></tr><tr><td>TUNEL assay</td><td>Promega, US</td><td>G3250</td><td>DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween 20 for molecular biology</td><td>AppliChem</td><td>A4974,0500</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>waterproof sheet</td><td>BEMIS company, inc.</td><td>PM996</td><td>Parafilm &amp;ldquo;M&amp;rdquo;; multiple suppliers</td></tr><tr><td>Y-27632&amp;nbsp;</td><td>Selleckchem.com</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco, US</td><td>31350010</td><td>2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers</td></tr></tbody></table>

generation of ipsc-derived human brain organoids to model early neurodevelopmental disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Die Erzeugung von brain Organoide erfordert mindestens drei Wochen ununterbrochener Kultivierung (1A). Um reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen, empfehlen wir, dass die Forscher jeden Schritt dokumentiert und, was wichtig ist, vermeidet jegliche Änderungen in Bezug auf Medienkomponenten, Zeitpunkte und die Handhabung von Zellen. Hier geben wir einen Überblick darüber, wie zu beurteilen, ob kritische Meilensteine ​​erreicht, um sich Organoide von ausreichender Qualität am Ende des Experiments zu erhalten. Die Bildung von Neurosphären in einer 96-Well - Platte soll von Tag deutlich sichtbar sein 4. Neurosphären können als gut definierten Bereichen auf dem Boden jeder Vertiefung (1B, Schritt 1) erkannt werden. Am Tag 5 sollte neurospheres ~ 500 &amp; mgr; m im Durchmesser sein und eine glatte Oberfläche, mit einem hellen Rande weist eine dunkele Mitte umgibt. Es könnte möglich sein, bereits neuronale rosettenartigen erweitert stru zu beobachtenctures innerhalb dieser hellen Rand (1C, von Schritt 2 beginnen). Wenn die Neurosphären auseinander fallen oder erscheinen eher wie Zellaggregate, die Differenzierung soll nicht weiter fortgesetzt werden. Schließlich Organoide sollten eine ähnliche Größe während des Differenzierungsprozesses in Spinnerflaschen (1D, Schritt 3) erhöhen und zeigen. Siehe die Tabelle zur Fehlerbehebung (Tabelle 1) für weitere Informationen. Die Qualität der Kindertages 14 Organoide sollte durch Lichtmikroskopie überprüft werden. VZs besteht aus dicken Schichten aus Nestin-positiver NSC / radial Gliazellen mit einer Palisade Kernform an der apikalen Seite. Auf der anderen Seite werden die primitiven Kortikalis reichlich TuJ1-positiven Neuronen auf der basalen Seite enthalten, räumlich getrennt von der apikalen Seite (Figur 1E). Wichtig ist, TuJ1-positive Neurone werden sollten nicht an der apikalen Seite der VZ gesehen. <p class="jove_content" fo:keep-together.wiDünn page = &quot;1&quot;&gt; Um die Teilungsebene der apikalen radialer Gliazellen (args) zu analysieren, empfehlen wir die Verwendung von phospho-Vimentin (p-VIM) und Arl13b Färbung. Arl13b bezeichnet die primären Zilien der innersten args das Lumen der VZ auskleiden. Somit dient die Arl13b-positive ciliated Region als Orientierungshilfe zu lokalisieren und die Teilungsebene der p-Vim-positiven args in Anaphase zu analysieren. Typischerweise werden die VZ eines 14 Tage alten Steuer organoiden zeigen eine signifikante Anzahl von ARG, deren Teilungsebenen horizontal ausgerichtet. Ein horizontal ausgerichtetes Teilungsebene ist von wesentlicher Bedeutung für die frühe Expansion der symmetrischen args (1F und G) 23,24. Wenn ausreichend ARG Expansion erreicht ist, beginnt die Neurogenese, ändern sich die teilender Zellen , ihre Ausrichtung auf das Lumen und die Teilungsebene schaltet von horizontalen (symmetrisch) zur Vertikalen (asymmetrisch) 4, 12, 24. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55372/55372fig1.jpg" /> Abbildung 1: Erzeugung von Gehirn Organoide von Human iPS - Zellen. (A) Arbeitsablauf des Differenzier Protokolls. Schritt 1: Starten der Differenzierung. Während dieser Phase tritt die Bildung von Neurosphären aus menschlichem iPSCs in einer 96-Well-Platte. Die Zeitdauer beträgt 5 Tage. Schritt 2: Einbetten der Neurosphären in EHS Matrixtröpfchen. Ein stationärer Suspensionskultur von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären hat eine Zeitdauer von 4 Tagen. Schritt 3: Organoide in Spinnerflaschen. Die Übertragung von EHS-Matrix eingebettet Neurosphären flasks Spinner erfolgt. Die Zeitdauer beträgt 14 Tage. (B) ein Neurosphäre in einer Multi-Well - Platte. Repräsentative Bild eines Neurosphere am Tag 4 in einer 96-Well-Platte in Schritt 1 dargestellt. Die Kugel sollte mit einer glatten, runden Oberfläche (rot arro auf dem Boden des Schachtes, deutlich sichtbar seinw). (C) Morphology of Neurosphären vor der EHS - Matrix Einbettung. Neurospheres am Tag gesammelt 5 von Schritt 1 sollte groß und weisen eine glatte Oberfläche mit einem hellen Rand (Halterung und Pfeil) gleichmäßig sein. (D) Organoide in Spinnerflaschen. Ein Rührkolben mit Gehirn Organoide während Schritt 3 (rote Pfeile) wird hier gezeigt. (E) Immunfluoreszenz - Bildgebung von gefriergeschnitten Organoide einen typischen VZ und primitive kortikale Platte anzeigt. Die linke Tafel zeigt die Kernfärbung von Zellen an der VZ. Die VZ erstreckt sich von der apikalen Seite (Lumen L) zu der basalen Seite (gelbe Linie). Man beachte, dass Zellen innerhalb der Anzeige VZ Palisade artigen Kerne, was darauf hindeutet, dass sie Gliazellen radial sind. Die rechte Tafel zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von Nestin-positiver NSC (grün) innerhalb der VZ und TuJ1-positiver Neuronen (magenta) in der primitiven Kortikalis. Maßstabsbalken = 50 um. (F) Immunfluoreszenz - Bildgebung von Organoiden gefriergeschnitten. zwei Beispielevon VZs gefärbt mit p-Vim und Arl13b (I und III). Die durch weiße Quadrate markiert sind rechts für jede Bildeinfügung (ii und iv) vergrößert. Die Teilungsebene der Anaphase apikalen radialen Gliazellen (args). Dividieren apikalen radiale Gliazellen an der apikalen Seite der VZ sind p-Vim-positive (magenta). Beispiele für symmetrisch Dividieren args gezeigt sind (weiße Quadrate und -einsätze). Die Teilungsebene ist als eine weiße Linie angegeben. Die Teilungsebene eines der Anaphase Zelle ist horizontal an die Lumenoberfläche Linie (gelb gepunktete Linie) und wird durch Arl13b Färbung (grün) markiert. Maßstabsbalken = 50 um. (G) stellt diese schematisch die vertikale oder horizontale Ausrichtung des ARG in der Anaphase relativ zu dem Lumen. Die sich teilende Zellen von Kontroll Organoide am Tag 14 werden überwiegend horizontal ausgerichtet (0-30 °) relativ zu der Lumenoberfläche des VZ. Die apikalen Seite des Lumens durch die primären Zilien von args ausgekleidet, die die Lumenfläche der VZ (grüne Linie) angeben. Im Gegensatz dazu most die radialen Gliazellen Mikrocephalie Organoide zeigt eine vertikal ausgerichtete (60-90 °) Teilungsebene. Die weiße Linie zeigt die Achse der Teilungsebene. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55372/55372fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55372/55372fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problem: </td><td> Mögliche Gründe: </td><td> Vorschläge: </td></tr><tr><td> Schritt 1.1.1.2 </td><td rowspan="2"> Schlechte Effizienz der Reprogrammierung </td><td rowspan="2"> Prüfen hiPSCs für Pluripotenz Marker: Wenn Qualität niedrig ist, manuell undifferenzierte Kolonien holen für einige Passagen pluripotente Kolonien zu bereichern </td></tr><tr><td> Menschliche iPS-Zellen differenzieren vor Beginn der Differenzierung </td></tr><tr><td></td><td> Stress aufgrund der frühen Passagierung oder passaging als einzelne Zellen </td><td> Nicht Passage vor Konfluenz von 80% erreicht ist. Passage als Aggregate, nicht einzelne Zellen </td></tr><tr><td></td><td> Kontamination mit Mykoplasmen </td><td> Test für Mykoplasmen-Kontaminationen </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> Schlechte Qualität des hiPSCs </td><td> Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) </td></tr><tr><td> Neurosphären überhaupt nicht oder nicht auseinander fallen am Tag 5 nach dem Beginn der Differenzierung bilden </td><td> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung ist zu niedrig oder zu hoch </td><td> zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung </td></tr><tr><td></td><td> hiPSC Medium wurde anstelle von neuronalen Differenzierungsmedium verwendet, </td><td> Verwenden neuronaler Differenzierungsmedium </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> Zentrifugationsschritt war zu hart oder zu mild </td><td rowspan="2"> Spin 96-Well-Platte 500 × g für 3 min und prüfen, ob Zellen an dem zentral angesammeltBoden jeder Vertiefung </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> Nein Y-27632 bei Beginn der Differenzierung </td><td> Verwenden Y-27632, um das Überleben der Zelle zu verbessern </td></tr><tr><td></td><td> Die Zellen hafteten und wuchsen an der Unterseite der Platte </td><td> Stellen Sie sicher, dass eine nicht-haftende 96-Well-V-Bodenplatte verwendet wird. </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> Kein täglicher Medienwechsel </td><td> Ändern halbe Menge des Mediums täglich </td></tr><tr><td> Neurosphären sind nicht homogen in der Größe </td><td rowspan="2"> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung nicht gleich war </td><td rowspan="2"> Mischen Sie den Schlauch mit Einzelzellsuspension vor jeder Entnahme von 100 ul Zellsuspension </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td></td><td> Mediumwechsel wurde nicht für jeden gut täglich durchgeführt </td><td> Stellen Sie sicher, erhält jeder gut tägliche Medienwechsel </td></tr><tr><td> Schritt 2 </td><td> hiPSC wurden nicht int distanzierteo einzelne Zellen vor Beginn der Differenzierung </td><td> Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, wenn hiPSC auf einzelne Zellen nach Accutase Behandlung dissoziiert sind. Wenn es noch werden aggregiert, Pipettenzellen 10 mal auf und ab mit 100 ul Mikropipette und erneut prüfen oder wiederholen Accutase Behandlung </td></tr><tr><td> Neurospheres keinen hellen Rand oder runde Oberfläche anzuzeigen; sie bilden große Zysten an der Oberfläche </td><td> Ab Anzahl der Zellen pro Vertiefung zu hoch war </td><td> zählen genau die Anzahl der Zellen und verteilen sie gleichmäßig in jede Vertiefung </td></tr><tr><td></td><td> Mediumwechsel wurde für jede Vertiefung nicht täglich gemacht </td><td> Ändern Sie die Hälfte Medium täglich </td></tr><tr><td> Schritt 2.7 </td><td> Schlechte Qualität des hiPSCs </td><td> Verbesserung der Qualität von hiPSCs (siehe oben) </td></tr><tr><td rowspan="3"> EHS-Matrix eingebettet Neurosphären haften und verklumpen </td><td> Nicht genügend Medium (Volumen) </td><td> Zur Verfügung stellenMinimum von 10 ml Medium in einem 100 mm Petrischalen </td></tr><tr><td rowspan="2"> Regal des Inkubators nicht einmal </td><td> Legen Schüssel auf einer ebenen Fläche </td></tr><tr><td> Nachdem in Inkubator platziert, bewegen sich die Schale, so dass Neurosphären gleichmäßig verteilt sind </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fehlerbehebung Tabelle.

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

20.5K Aufrufe.  University of Cologne. Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described. 

Serie: Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a three-dimensional system. Here we present a relatively straightforward and inexpensive method that yields brain organoids. In this protocol human pluripotent stem cells are broken into small clusters instead of single cells and grown in basic media without a heterologous basement membrane matrix or exogenous growth factors, allowing the intrinsic developmental cues to shape the organoid&#39;s growth. This simple system produces a diversity of brain cell types including glial and microglial cells, stem cells, and neurons of the forebrain, midbrain, and hindbrain. Organoids generated from this protocol also display hallmarks of appropriate temporal and spatial organization demonstrated by brightfield images, histology, immunofluorescence and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Because these organoids contain cell types from various parts of the brain, they can be utilized for studying a multitude of diseases. For example, in a recent paper we demonstrated the use of organoids generated from this protocol for studying the effects of hypoxia on the human brain. This approach can be used to investigate an array of otherwise difficult to study conditions such as neurodevelopmental handicaps, genetic disorders, and neurologic diseases.

This protocol was generated as a means to produce brain organoids in a simplified, low cost manner without exogenous growth factors or basement membrane matrix while still maintaining the diversity of brain cell types and many features of cellular organization.

Eine statische selbstgesteuerte Methode zur Generierung von Hirnorganoiden aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

<meta charset="utf8"></head><body>Generierung von Organoiden des menschlichen Gehirns mit residenten Mikroglia unter Verwendung von iPSC-abgeleiteten HPCs

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for studying human brain development and pathogenesis of neurological diseases. However, the lack of incorporation of microglia in the human brain organoids is still a major hurdle for 3D models of neuroinflammation. Current approaches include either the incorporation of fully differentiated microglia into mature brain organoids or the induction of microglial differentiation from the early stage of iPSC-derived embryoid bodies (EBs). The first approach misses the stage when microglial differentiation interacts with the adjacent neural environment, and the later approach is technically challenging, resulting in inconsistency among the final organoids in terms of the quantity and quality of microglia. To model brain organoids with microglia to study the early interactions between microglial and neuronal development, highly pure hematopoietic progenitor cells (HPC) differentiated from human iPSCs were incorporated&#160;into iPSC-derived EBs to make brain organoids. Using immunostaining and single-cell RNA sequencing (sc-RNA-seq) analysis, we confirmed that HPCs were incorporated into the 3D organoids, which eventually developed into brain organoids with both microglia and neurons. Compared to brain organoids without HPCs, this approach produces significant microglial incorporation in the brain organoids. This novel 3D organoid model, which consists of both microglial and neural development properties, can be used to study the early interactions between innate immune and nervous system development and potentially as a model for neuroinflammation and neuroinfectious disorders.

<meta charset="utf8"></head><body>Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

We present a protocol to generate a human brain organoid with resident microglia by incorporating Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hematopoietic progenitor cells (HPCs) into organoid development.

Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Generation of 3D Midbrain Organoids from Human-Induced Pluripotent Stem Cells

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain development, facilitating precise disease modeling, and advancing therapeutic research. This protocol outlines a method for generating midbrain-specific organoids using induced pluripotent stem cells (iPSCs), employing a strategic differentiation approach. Key techniques include dual-SMAD inhibition to suppress SMAD signaling, administration of fibroblast growth factor 8b (FGF-8b), and activation of the Sonic Hedgehog pathway using the agonist purmorphamine, guiding iPSCs towards a midbrain fate.
The organoids produced by this method achieve diameters up to 2 mm and incorporate a diverse array of neuroepithelial cell types, reflecting the midbrain&#39;s inherent cellular diversity. Validation of these organoids as authentic midbrain structures involves the expression of midbrain-specific markers, confirming their identity. A notable outcome of this methodology is the effective differentiation of iPSCs into dopaminergic neurons, which are characteristic of the midbrain.
The significance of this protocol lies in its ability to produce functionally mature, midbrain-specific organoids that closely replicate essential aspects of the midbrain, offering a valuable model for in-depth exploration of midbrain developmental processes and the pathophysiology of related disorders such as Parkinson&#39;s disease. Thus, this protocol serves as a crucial resource for researchers seeking to enhance our understanding of the human brain and develop new treatments for neurodegenerative diseases, making it an indispensable tool in the field of neurological research.

This protocol describes a novel method for creating 3D midbrain organoids from human induced pluripotent stem cells, guiding their formation to mimic native midbrain tissue, thereby aiding in the study of development and disorders.

Erzeugung von 3D-Mittelhirn-Organoiden aus human-induzierten pluripotenten Stammzellen

The development of midbrain organoids (MOs) from human pluripotent stem cells (hPSCs) represents a significant advancement in understanding brain ...

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental defects whose underlying mechanisms remain to be elucidated. A major roadblock is the lack of effective models recapitulating the early-onset neuronal impairment seen in the patients. Advances in the technology of induced pluripotent stem cells (iPSCs) enable the generation of three-dimensional (3D) brain organoids that can be used to investigate the impact of diseases on the development and organization of the nervous system. Researchers, including these authors, have recently introduced human brain organoids to model mitochondrial disorders. This paper reports a detailed protocol for the robust generation of human iPSC-derived brain organoids and their use in mitochondrial bioenergetic profiling and imaging analyses. These experiments will allow the use of brain organoids to investigate metabolic and developmental dysfunctions and may provide crucial information to dissect the neuronal pathology of mitochondrial diseases.

We describe a detailed protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived brain organoids and their use in modeling mitochondrial diseases.

Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Zusammenfassung

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Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

Ableitung eines Organoids des menschlichen Gehirns mit Mikroglia-Entwicklung

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