Name: a customizable chamber for measuring cell migration
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration at JoVE.com

Yazarlar bu proje için finansman sağlamak için Clemson Üniversitesi Yaratıcı Sorgulama program ve NSF CBET1254609 kabul.

1. Bir Konsantrasyon Gradient Oluşturma için Microchannel Chamber Üreten <ol><li> Bir akrilik kalıp parçanın kesilmesi <ol><li> istenen genişlikte akrilik bir parça elde edilir. Tipik olarak 1/16-inç kalınlığında akrilik levhalar kullanmak. Kalın yaprak onları sürecinde kırmaya veya çözgü neden gerekli mekanik gücüm yok iyi ve çok ince yaprak kesmek zordur. </li><li> polidimetilsiloksan (PDMS) içinde bir boşluk üretmek için akrilik parça istenen şekle sahip bir CAD dosyası oluşturun. Bireysel deneysel protokollere uygun istenen degrade elde etmek için kanal genişliği ve uzunluğunu ayarlayın. <ol><li> Iki kare (0.254 cm x 0.254 cm) bir 0.127 cm genişliğinde kanal tarafından (0.254 cm uzunluğunda) bağlı (Şekil 1): Burada, aşağıdaki boyutlardan bir akrilik parça kullanın. </li></ol></li><li> manu göre bir lazer kesici akrilik parça lazer kesme aparatı içine CAD dosyasını içe ve koyunfacturer protokol. NOT: Alternatif olarak, CAD tasarım parça 3D-yazdırın. Bu yöntemin avantajı, diğer maddeler, kalıp için kullanılabilir olmasıdır; Ancak, çözünürlük ve uyarlık lazer kesim ile karşılaştırıldığında 3D baskı ile azaltılabilir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> Şekil 1: Mikrokanal Odası Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) Temsil. Bu görüntü mikrokanal odasını oluşturmak için gerekli akrilik ekin çizim CAD göstermektedir. 1 A) CAD çizim, 1B) inç boyutları ile çizim CAD Side view, 1C) inç boyutları ile çizim CAD Üst bakış Üstten görünüm <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="2"><li&gt; polidimetilsiloksan Dökme (PDMS) <ol><li> Bir ağırlık teknede ticari Elastomer Sertleştirici (örneğin Sylgard 194), ağırlıkça 1 kısım ticari Elastomer baz ağırlığı (örneğin Sylgard 184) 10 kısım karıştırın. Tipik haliyle, Elastomer Sertleştirici 1 g elastomer tabanı 10 g karıştırılır. </li><li> 5 dakika boyunca, bir mikropipet ile taban ve sertleştirme maddesi birleştirmek için karıştırın. </li><li> bir vakum çan kurmak ve hava kabarcığı kaldırmak için 30 dakika süreyle vakum PDMS ile tartın tekne yerleştirin. </li><li> Vakumu kapatın ve tartmak tekne çıkarın. Küçük bir Petri kabındaki akrilik cut-out üstüne PDMS dökün. PDMS tamamen ekleme kapsar emin olun. </li><li> PDMS oda sıcaklığında (en azından 18 saat) bir gecede bekletilmelidir. </li></ol></li><li> PDMS gelen parçayı çıkarma <ol><li> PDMS kür sonra, dikkatlice bir neşter ile akrilik parçası etrafında PDMS keserek çıkartın. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Microchannel Odası Hücreler Kaplama <ol><li> Hücreleri kaplama hazne Sterilizasyon. Not: PDMS, etilen oksit veya diğer teknikleri kullanarak sterilize edilebilir olsa da, hızlı bir UV muamele hücre kültürü çalışmaları için, hızlı, ucuz ve yeterlidir. kısa UV tedavi süresi PDMS parçasının yapısı veya mekanik bütünlüğüne zarar vermedi. <ol><li> Standart bir hücre kültürü kabininde tamamen% 70 etanol ile bölmeyi kapsamaktadır. </li><li> kapaklı kapalı olarak laminer akış kaputu Petri kabı koyun. </li><li> Kaputu kapatın ve UV ışığı açın. 1-2 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalmaktadır. </li><li> laminer akış kaputu açın ve akışını yeniden kurmak için 15 dakika bekleyin. </li><li> % 70 etanol çıkarın. </li><li> steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez odaları yıkayın. her bir yıkama için 1 mL PBS kullanın. PBS kaldırmak ve odaları kapaklı kapalı bir gecede kurumasını bekleyin. NOT: Alternatif olarak, yerineVarsa bir laminer akış kaput kullanarak, sterilizasyon UV odası kutusunu kullanın. alüminyum folyo ile kaplı bir karton kutusunun arkasında bir UV ışık kaynağı koyarak UV kutusu yapın. Alüminyum folyo örnek da aydınlatma sağlamak için ışık yansıtır. </li></ol></li><li> Odasına Hücreler Kaplama <ol><li> Tripan mavi ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. <ol><li> % 0.4 tripan mavisi 400 uL hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. nazikçe cam lamel altında iki bölmeyi doldurarak hemasitometre bu çözümün 100 mcL uygulayın. </li><li> hemasitometre ızgara üzerinde odaklanmak için bir 10X amacı ile bir mikroskop kullanın. hemasitometre 16 meydanlarından biri kümesi içinde canlı boyanmamış hücreleri saymak için bir el taksitli sayacı kullanın. </li><li> 16 kareler her 4 set halinde hücreleri saymak. 16 kareler 4 setleri ortalama hücre sayısını alın ve 5x10 4 ile çarpın. Bu son sayı numbe olduğunuhücre süspansiyonu hücre / ml r. </li></ol></li><li> Her bir bölme bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. Bu ~ 30,000 / cm2 &#39;lik bir yakın konfluent hücre yoğunluğuna çevirir. </li><li> Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). </li></ol></li></ol> 3. Dekstran Sırılsıklam Agaroz Blokları <ol><li> Bir agaroz blok oluşturma <ol><li> 3D baskılı kalıbın (2 mm x 2 mm x 2 mm arasında) agaroz% 3 dökün. </li><li> 30 dakika kabarcıkları uzaklaştırmak için agaroz bir vakum odasına katılaşmasına izin verin. </li><li> kalıptan agaroz bloğunu çıkarın. Not: Alternatif olarak, 2 mm kalınlığında, küçük bir Petri kabı içine agaroz% 3 dökün. bir neşter ya da başka kesici alet kullanılarak bir 2 mm x 2 mm x 2 mm&#39;lik bir blok kesin. Bu kalıp sistemi gibi kesin değil ama yapmak için biraz daha kolay olabilir. </li></ol></li><li> tamamen submergkemotaktik faktörü istenen konsantrasyonda bir çözelti e agaroz bloğu. konsantrasyon gradyanı oluşumu değerlendirmek için, floresan dekstran ile birinci bölme yıkayın. dekstran konsantrasyonu ve moleküler ağırlığı, bir çözünür faktör veya ilgi duyulan ilaç ile aynı olmalıdır. </li><li> Agaroz blok gecede ıslatın. </li></ol> Çözünür Faktörü Konsantrasyon Gradient değerlendirin Dekstran Difüzyon 4. Time-lapse <ol><li> mikrokanal odasının küçük bir kare kuyuda dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirin. </li><li> Bir hücre görüntüleme sisteminde mikro odasına yerleştirin veya bir time-lapse özelliği ile başka bir floresan mikroskop kullanın. üreticinin talimatlarına uygun olarak zaman atlamalı başlayın. NOT: Gösterilen sonuçlar GFP filtresi,% 50 ışık, 4/10 pH ve 4X büyütme ile alınır. </li></ol> Hücre Büyüme 5. Time-lapse <ol><li> bir ucunda, mikrokanal bölmesi Levha hücreleribölme. Burada, 3T3 fibroblastların kullanın. Mikrokanal odası içinde, bir oyuğuna 2500 hücreleri ekleyin. 2.2.1 açıklandığı gibi hücreleri saymak. <ol><li> Hücreler ortam eklemeden önce 60 dakika boyunca bölme oturmasına izin (Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 penisilin-streptomisin). % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de kaplanmıştır hücrelerle mikrokanal odası tutun. kanaldan hücre göçü bir mikroskop ile görülebilir. </li><li> bir belirteç ekleme veya mesafeyi hücre ön hamle ölçmek için bir başlangıç ​​yeri olarak hizmet etmek üzere bir belirteç olarak odasında bir mikroskobik kusur kullanın. </li></ol></li><li> Bir agaroz jel (8 mm3 blok) ihtiva eden yerleştirerek gradyanı oluşturulması konsantre büyüme faktörü, kemo-çekici, ilaç veya diğer bir faktör, test edilen mikrokanalın bir ucunda (burada,% 40 FBS, örnek olarak kullanılıyor) bölme. </li><li> Hareketli hücre ön time-lapse fotoğraf çekmek. Burada, sonuçlar fro hücre görüntüleri gösterirnt o bir görüntüleme sistemi kullanılarak 12 saatte çekildi. </li><li> Hücre büyüme hızını ölçmek için hücre ön resimlerini kullanın. ilk hücre ön, kanal duvarları ve referans markeri ile tanımlanan bir çokgen maske oluşturmak için (roipoly) MATLAB polyfit işlevini kullanarak büyüme oranını hesaplayınız. Bu maskenin boyutları ortalama hücre ön hız hesaplanır hangi ön göç mesafesini verir. Diğer çalışmalar benzer bir yöntem 8 kullanmışlardır. NOT: Aynı mesafeden çözünür faktörün konsantrasyonuna her karede hücre büyümesi ön kenarını karşılaştırın. çözünür faktör konsantrasyon gradyanı 1D difüzyon modeli yaklaşımı kullanılarak hesaplanır. </li><li> Phalloidin ve DAPI boyama kullanarak hücrelerin floresan görüntüleri çekmek. <ol><li> Phalloidin ile boyamadan önce hücreleri sabitleyin. <ol><li> 37 ° C &#39;de sıcak bir% 4 paraformaldehid. </li><li> hücreleri karşılamak için yeterli% 4 paraformaldehid ekleyin. hücreleri tutun10 dakika boyunca paraformaldehit. </li><li> 15 dakika her zaman için iki kez PBS ile durulayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li></ol></li><li> hücreler PBS çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli su-geçirimli çözeltisi (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) ilave edin. 10 dakika süre ile çözelti bırakın. </li><li> 5 dakika, her seferinde, PBS ile iki kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li><li> hücreler PBS çıkarın ve 20 dakika çözeltisi (PBS içinde% 1 sığır serumu albümini) bloke ekleyin. </li><li> Bloklama çözeltisi, çıkarın ve her biri 5 dakika bir zaman boyunca PBS ile 2 kez yıkanır. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. </li><li> kullanılmadığı zaman, bu noktadan sonra, alüminyum folyo ile ışıktan hücreleri korur. hücreler PBS çıkarın ve 1 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş Phalloidin 488 1:50 ekleyin. </li><li> her bir yıkama için, 5 dakika süreyle PBS içinde 2 kez yıkayın. Hücreleri karşılamak için yeterli PBS kullanın. Sonra hücrelerden PBS kaldırmak. </li><li> 15 dakika boyunca hücreler PBS içinde 1000: DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol); 1 seyreltilmiştir. </li><li> Kaldır DAPI veher bir yıkama için 5 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> Son yıkama çıkarın ve hücreleri karşılamak için yeterli PBS ekleyin. Hücreler artık floresan mikroskop ile görüntülenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li><li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis.">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li><li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+study+fibroblast+migration.">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li><li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factors,+Matrices,+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells.">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li><li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#181;-Slide+Chemotaxis:+A+new+chamber+for+long-term+chemotaxis+studies.">&#181;-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+Chamber+Assay.">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models.">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li><li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber.">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li><li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette.">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li><li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy.">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations.">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies.">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li><li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device.">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).</li><li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research.">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li><li>Tang, S. K., Whitesides, G. M., Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. , (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research).">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li><li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains.">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bizim mikrokanal odası büyüme faktörleri ve kimyasal çekici yanıt olarak, hücre göçü hızının belirlenmesi ve bir polimer matristen bir ilacın difüzyon oranını ölçmek de dahil olmak üzere amacıyla, bir çok kullanılabilir. Hücrelerin büyümesine ve odanın bir ucunda, bir kemoatraktanttır yerleştirmek için mikrokanal bölmesini kullanmak mümkündür. Hücreler kemoatraktan yanıt olarak büyür ve hücre göçü, hücre göçü oranını belirlemek üzere analiz edilebilir zaman atlamalı görüntü alınarak belirlenebilir. Bu yöntemin Örnek sonuçlar büyüme MATLAB polyfit fonksiyonu kullanılarak 13.4 um / h olduğu tespit edilmiştir Şekil 3 de gösterilmiştir. Bizim mikrokanal bölmesinin başka bir kullanımı, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon oranını ölçmektir. ilgi ilaca benzer molekül ağırlığına sahip bir floresan etiketli dekstran Dru difüzyon modeli kullanılabilirilgi g. Örnekleri degrade bozacak konveksiyon büyük miktarda dikkatle ele alınması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Bu yöntemin temsil edici sonuçları Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Boyden Chamber tahlilinde ile karşılaştırıldığında bu modelin bir avantajı, çünkü düz bir yüzeye ve yapışık hücre tiplerine daha uygun olmasıdır; oysa, hücreler kalarak önce Boyden odasında küçük bir tüp yoluyla düşmelidir. Boyden odası testinin diğer kısıtlılığı bir son nokta deneyi olmasıdır; Bu şekilde, kemotaksis görsel izlenememektedir. Buna karşılık, bizim yöntemi ile, kemotaksis time-lapse görüntüleri 9 ile gözlenmektedir. Kemoattraktantlar ihtiva mikropipetler kullanımı, hücre göçü gözlemlemek için bir yöntem kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemin dezavantajı, düşük verimlilik 10&#39;dur. Dunn kemotaksi odasının th gibi zaman atlamalı görüntüleme ile bağlantılı olarak kullanılan bir deney olane yöntemi, 12 burada 11 ayrıntılı. bölme, bir iç ve dış kuyu yaratmak için cam slayt yüzünde oyulmuş iki konsantrik daireler oluşur ve bir köprü, iki kuyu ayırır. Kemoatraktan, dış oyuk içine yerleştirilir ve hücreler, dış oyuk iç oyuk göç izin verilir. Bu göç görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir time-lapse görüntüleri kullanılarak ölçülür. Boyden tahliline benzer, Dunn odası tahlil sınırlamaları biri kolayca özel çözünür faktör konsantrasyon degradeler oluşturmak için değiştirilemez olmasıdır. Hücre göçü değerlendirmek için başka basit bir teknik, bir in vitro 13 kazımak olduğunu. sadece önceden oluşturulan sıfırdan yakın hücre göçü zaman atlamalı görüntüleri hücre tek tabaka ve yakalama bir çizik oluşturarak gerektirir Bu yöntem, hızlı ve ucuz. ancak buradaner, bu yöntemin en önemli dezavantajı, bir kimyasal faktörler konsantrasyon gradyanı tepkilerini ölçmek için uygun olmadığıdır. Bizim yöntemi potansiyeli kimyasal degrade oluşturmak için kimyasal degrade hücre göçü göreli ölçmek sunuyor. bir kemotaktik faktördür mikrokanal odası içinde kuyu birinde mevcut ise Bizim yöntem olup, hücre mono tabakasında oluşturulabilir bir çizik sıfırdan yöntemi ile birleştirilebilir. Bu ölçümü ve yara iyileşmesi modelleme için izin verir. Bizim cihazın bir başka potansiyel uygulama hücresi büyümesini önleyen maddeler, kanser hücrelerinin tepkisini tespit etmektir. Diğer Mikroakiskan dayalı sistemler, hücre göçü çalışmaları 14, 15 kullanılmıştır. Bu çalışmalar silikon gofret mikroakışkan kanalları oluşturmak için silikon ve / veya lazer işlemede usta kalıpları oluşturmak için temiz odalar ile taşbaskı teknikleri kullanmaktadır. Silikon WAFEr mikro işleme bir mikro odasını üretmek için ucuz malzemeler (PDMS ve akrilik) kullanan bizim yöntemine göre pahalı olabilir. Bizim cihaz küçük 3D kanallar 15 oluşturmak mümkün değildi mikroakışkan cihazları dayalı diğer PDMS sınırlama üstesinden gelir. Bizim yöntem ile, başarılı küçük çaplı kanallı PDMS tabanlı aygıt oluşturduk. Diğer çalışmalar, iki mikro katmanları ve bilgisayar oksijen 16 farklı gradyanlarıyla hücrelerinin göçünü çalışma oksijen rasgele gradyanlar oluşturmak amacıyla kontrol edilen bir çok-kanallı gaz karıştırıcı ile PDMS tabanlı mikroakışkan cihaz kullanmıştır. Bizim cihaz mikrokanal bölmesinin bir ucunda bir gaz karıştırma bölmesinin eklenmesi ile benzer bir şekilde kullanılmak için potansiyel vardır. Mikroakışkan cihazlar genellikle yumuşak litografi teknikleri kullanılarak yapılır; Bu hücre göçü Chambe oluşturmak için adapte edilebilirrs. Bu yöntemler bilgisayar destekli tasarım (CAD) ile kanal desenleri ile bir maske baskı barındırır. Bu maskeler sonra optik litografi ile karşı ışığa ile kaplanmış bir ana kalıp üzerinde tahmin edilmektedir. Ana kalıp yapıldıktan sonra PDMS ana üzerine dökülmekte ve mikroakışkan çalışmalar 17, 18, 19 için kullanılabilecek bir PDMS kalıp oluşturmak için sertleşmeye bırakılır. Kemoatraktan ya chemorepulsive bileşikler gradyanlar 17 oluşturmak için rezervuar birinde yüksek konsantrasyonda odasına yerleştirilir. Bu teknikler bizim set up benzer olmakla birlikte, onlar yüzünden sistem için ana kalıp ve temiz odalar kullanımını yaratma yüksek maliyet pahalı olabilir. öğrencilerin sınıf temelli bir ortamda öğrenmesi için ek olarak, bu yöntemler zor olabilir. kanalları oluşturmak için set-up kullanılan ekler 3D pr dahil çeşitli yöntemler ile oluşturulabilirinting ve lazer kesim. Bu nedenle bizim sistemimiz 3D baskı daha uygun ve yaygın olarak kullanılabilir hale gelir özellikle de nispeten düşük maliyetli için kalıp geniş bir yelpazede oluşturulmasını sağlar. hücre göçünü ve büyümenin ölçülmesi için tabanlı mikro PDMS geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılmaktadır. Örneğin, nörolojik araştırma cihazları PDMS bileşeni sağlamak için mikron boyutunda yivlerle fiziksel bir bariyer ile ayrılmış iki bölmeyi oluşturmak üzere, bir doku kültür kabı veya camın üzerine yerleştirildiği yumuşak litografi teknikleri kullanılarak imal edildi, 20 çalışmaları nöronlar bölme arasındaki büyümek. Time-lapse görüntüleri bariyer geçiş nöronlar göstermek için alındı. Bizim cihaz için üretim yöntemi basit ve her düzeyde araştırmacılar tarafından kullanılabilir iken bu cihazı üretmek için kullanılan micropatterning yöntemi, karmaşıktır. Başka bir çalışmada da si üretilmesi için kolay bir düşük maliyetli bir yöntem kullanılırmikrokanalların üretmek için PDMS bir izlenim yaratmak amacıyla kapaklar oluşturulan bir ana kalıp kullanılarak Milar PDMS mikroakışkan cihaz. Tanımlanan birinin üzerine eden yaklaşımının bir avantajı bu protokol hücreleri 21 orta akış sorun oluşturan iki PDMS tabakalar arasında yapışmayı gerektiren ise eden yöntem kanalları, tek bir adımda imal edilmiş olmasıdır. Sonuç olarak, mikro oda metodu özelleştirilebilir ve farklı sonuçlar elde etmek için kullanılabilir. yöntem, kullanıcının ihtiyaçlarına uyacak şekilde bir konsantrasyon farkı oluşturulmasını sağlar. Ayrıca, cihaz nedeniyle nispeten düşük maliyetli ve her düzeyde araştırmacılar için kullanım kolaylığı için mevcut cihazlar üzerinde bir avantaj sunuyor.

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument used for taking time-lapse images</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Model number VLS2.30</td><td>Laser cutter used for cutting plastic</td></tr></tbody></table>

a customizable chamber for measuring cell migration

Hücre göçü bağışıklık tepkilerinin, büyüme ve yara iyileşmesi önemli bir parçasıdır. Hücre göçü hücreleri, hücre-dışı matris ve çözünen ve çözünmeyen bir kimyasal faktörleri (örneğin, Kemoattraktantlar) arasındaki etkileşimleri içeren karmaşık bir süreçtir. Bu Boyden Chamber tahlilinde, bir bölücünün iki tarafında hücre sayımı yolu ile çalışma gibi hücrelerin göçünü ölçmek için standart yöntemler. Bu teknikler kullanımı kolay; Bununla birlikte, farklı uygulamalar için çok az bir geometrik değişiklik vardır. Bunun aksine, mikroakışkan cihazlar çözünür faktörlerin, 1, 2 özelleştirilebilir konsantrasyon gradyanı hücre göçü için kullanılabilir. Ancak, Mikroakiskan tabanlı deneyleri yapma yöntemleri öğrenmek için zor olabilir. Burada, kimyasal konsantrasyon gradyanı yanıt olarak hücre göçü ölçmek için hücre kültürü odaları oluşturmak için kolay bir yöntem tarif eder. Bizim cep mibütünleştirme oda yönteminin, çeşitli uygulamalar için, hücre göçü incelemek üzere farklı doğrusal konsantrasyon gradyanları oluşturabilir. Bu yöntem kullanımı nispeten kolaydır ve genellikle lisans öğrencileri tarafından gerçekleştirilir. Mikrokanal odası iyi bir Petri kabı içine nihai mikrokanal odasının şeklinde bir akrilik insert yerleştirerek oluşturuldu. Bundan sonra, poli (dimetilsiloksan) (PDMS) ekin üzerine döküldü. PDMS sertleşmeye bırakıldı ve daha sonra da ekleme uzaklaştırılmıştır. Bu, herhangi bir arzu edilen şekil ya da boyutta kuyu oluşturulması için izin verdi. Hücreler, daha sonra mikrokanal odasına ilave edilebilir ve çözünebilir maddeler arzu edilen maddenin bir agaroz blok ıslatılmasıyla kuyu birine eklenebilir. Agaroz blok kuyu birine ilave edilir ve zaman atlamalı görüntüler hücre göçü miktarını belirlemek amacıyla mikrokanal odasının alınabilir. Bu yöntemin varyasyonları bu yöntem HIG yapmak, belirli bir uygulama için yapılabilirhly özelleştirilebilir.

Şekil 2, hücre plakalanmıştır burada kanal, zıt uca yerleştirilen fetal sığır serumu gradyanı yanıt olarak kanal boyunca hücre ön hareketini gösterir. Hücre ön 48 saat (Şekil 2A), 72 saat (Şekil 2B), 96 saat (Şekil 2C), ve 120 saat (Şekil 2B) sonrası kaplama gösterilir. Hücre ön hareketi bu zaman atlamalı görüntüleri ile takip edildi ve göç mesafesi ve büyüme oranı MATLAB polyfit işlevi tarafından hesaplanmıştır. Buradan, ortalama hücre ön hızı 13.4 um / saat (Şekil 3) olarak bulunmuştur. Şekil 4, kanalın bir ucunda bir dekstran batırılmış agaroz blok yerleştirilmesi ve dekstran 12 saat boyunca bir kanal içerisinden difiizyonla geçişine izin oluşturduğu florasan gradyanı gösterir. Bir zaman atlamalı görüntü her saatte alınır ve mesafe boyunca floresan oldu<html> Şekil 4&#39;te gösterilen ve 1D difüzyon modeli ile karşılaştırıldığında, bir kanal ölçülmüş ve çizilmiştir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig2.jpg" /> Şekil 2: Hücre Ön Hareketi. kanalıyla hareket mikrokanal odasında hücre ön Time-lapse görüntüler. Hücre ön turuncu çizgileri işaretlenmiş ve göç mesafesi dahildir. Bu göç mesafesi gösterildiği gibi hücre ön ön plaka üzerinde işaretleme ölçüldü. 1 mm&#39;lik bir ölçek çubuğu beyaz gösterilir. A) 48 saat sonrası kaplama, B) 72 saat sonrası kaplama, C) 96 saat sonrası kaplama, D) 120 saat sonrası kaplama. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> e 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Büyüme Hızı Hesaplama. Time-lapse resimlerle izlenen ön hareketi Hücre. Büyüme oranı 13.4 mm / h ortalama hücre ön hızı elde etmek için MATLAB polyfit fonksiyonunu (roipoly) kullanılarak hesaplanmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55264/55264fig4.jpg" /> Şekil 4: Dextran&#39;ın ile Floresan Gradient. Floresan yoğunluğu her satır belirli bir saatte degrade temsil kanalın mesafe boyunca ölçülen. ImageJ floresan yoğunluğu hesaplanması için kullanılmıştır. Bu analiz kullanılarak yapılabilir | Ölçü aracı. İlk olarak, analiz ve seçin yoğunluğu altında ayarlayın Ölçümleri seçin. Sonra altında ave almak için analiz Tedbir seçinöfke piksel yoğunluğu. Bu şekilde gösterildiği gibi, bu mikron mesafeye göre grafiğe geçirilebilir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration at JoVE.com

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Görüntüleme.  Clemson University.  Bu protokol, aynı zamanda, bir polimer matrisi üzerinden bir ilacın difüzyon hızını belirlemek için kullanılabilir chemoattractants yanıt olarak hücre göçü ölçmek için özelleştirilebilir yöntemi göstermektedir. 

Video: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Tıp

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biyomühendislik

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Biyoloji

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Granül Hidrojel Biyomalzemeler İçinde ve İçine Üç Boyutlu Hücre Migrasyonunun Ölçülmesi

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...