Name: a customizable chamber for measuring cell migration
Uploaded: 2017-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration at JoVE.com

Die Autoren erkennen an der Clemson University Creative Inquiry Programm und NSF CBET1254609 für die Finanzierung für dieses Projekt.

1. Die Herstellung eines Mikrokanal-Kammer einen Konzentrationsgradienten erstellen <ol><li> Schneiden eines Acrylformteil <ol><li> Besorgen Sie sich ein Stück Acryl mit der gewünschten Breite. Normalerweise verwenden Sie 1/16-Zoll-dicke Acrylplatten. Dickere Platten sind schwierig, gut und sehr dünne Bleche zu schneiden die erforderliche mechanische Festigkeit nicht haben, so dass sie während des Prozesses zu brechen oder sich verziehen. </li><li> Erstellen eines CAD-Datei mit der gewünschten Form des Acrylstück einen Hohlraum innerhalb des Polydimethylsiloxans (PDMS) zu erzeugen. Stellen Sie die Kanalbreite und Länge des gewünschten Gradienten relevant für einzelne experimentelle Protokolle zu erreichen. <ol><li> Hier verwenden ein Acryl Stück der folgenden Dimensionen: zwei Quadrate (0,254 cm x 0,254 cm) verbunden mit einem 0,127 cm breiten Kanal (0,254 cm lang) (Abbildung 1). </li></ol></li><li> Importieren Sie die CAD-Datei in die Laserschneidvorrichtung und legen Sie die Acryl-Stück in einem Laserschneider nach dem manulers Protokoll. HINWEIS: Alternativ 3D-Druck, das Stück aus der CAD-Konstruktion. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass alternative Materialien für die Form verwendet werden kann; kann jedoch die Auflösung und die Reproduzierbarkeit, mit 3D-Druck verringert werden im Vergleich zum Laserschneiden. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig1.jpg" /> Abbildung 1: Computer-Aided Design (CAD) Darstellung von Microchannel- Kammer. Dieses Bild zeigt die CAD-Zeichnung des Acryleinsatz erforderlich, um die Mikrokanalkammer zu erzeugen. 1 A) Draufsicht der CAD - Zeichnung, 1B) Seitenansicht der CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll, 1C) Draufsicht einer CAD - Zeichnung mit Abmessungen in Zoll <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li&gt; Gießen des Polydimethylsiloxans (PDMS) <ol><li> In einem Boot wiegen, mischen 10 Gewichtsteile der kommerziellen Elastomerbasis (zB Sylgard 184) mit 1 Gewichtsteil der kommerziellen Elastomer Härters (zB Sylgard 194). Typischerweise wurden 10 g Elastomer Base zu 1 g des Elastomer Härter mischen. </li><li> Rühren Sie die Basis und das Härtungsmittel mit einer Mikropipette für 5 min zu kombinieren. </li><li> Stellen Sie eine Vakuumglocke nach oben und legen Sie das wiegen Boot mit PDMS im Vakuum 30 min eingeschlossene Luftblasen zu entfernen. </li><li> Schalten Sie das Vakuum aus, und entfernen Sie das Boot wiegen. Gießen Sie die PDMS auf der Oberseite des Acryl-Ausschnitt in eine kleine Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die PDMS vollständig den Einsatz abdeckt. </li><li> Lassen Sie die PDMS über Nacht aushärten (mindestens 18 h) bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Entfernen des Einsatzes aus PDMS <ol><li> Nach der PDMS-Härtung, entfernen Sie den Einsatz von sorgfältig die PDMS um das Acryl-Stück mit einem Skalpell zu schneiden. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Ausplattieren der Zellen in einem Mikrokanal Chamber <ol><li> Sterilisieren der Kammer zum Plattieren von Zellen. HINWEIS: Während kann PDMS unter Verwendung von Ethylenoxid oder andere Techniken sterilisiert werden, um eine schnelle UV-Behandlung ist schnell, billig und ausreichend für die Zellkulturstudien. Die kurze UV-Behandlungsdauer beeinträchtigte nicht die Struktur oder die mechanische Integrität des PDMS Stück. <ol><li> In einer Standard-Zellkulturschrank vollständig bedecken die Kammer mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie die Petrischale in Laminar-Flow-Haube mit den Deckel ab. </li><li> Schließen Sie die Haube und schalten Sie das UV-Licht. Expose mit UV-Licht für 1-2 h. </li><li> Öffnen Sie die Laminarströmungsabzug und warten Sie 15 min Volumenstrom wiederherzustellen. </li><li> Entfernen Sie die 70% Ethanol. </li><li> Waschen Sie die Kammern zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Verwenden Sie 1 ml PBS für jede Wäsche. Entfernen PBS und erlauben Kammern über Nacht mit den Deckel ab, um zu trocknen. HINWEIS: Alternativ kann statteine Laminarströmungsabzug der Verwendung eines UV-Kammer-Box für die Sterilisation verwendet werden, wenn ein solcher vorhanden ist. Machen Sie eine UV-Box durch eine UV-Lichtquelle in der Rückseite eines Karton ausgekleidet mit Aluminiumfolie platzieren. Die Aluminiumfolie reflektiert das Licht für eine gleichmäßige Ausleuchtung der Probe zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Plating Cells in Kammer <ol><li> Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer. <ol><li> Füge 100 &amp; mgr; l der Zellsuspension zu 400 ul von 0,4% Trypanblau und vorsichtig mischen. Anwenden 100 ul dieser Lösung in die Zählkammer durch vorsichtiges beide Kammern unter dem Deckglas gefüllt wird. </li><li> Verwenden Sie ein Mikroskop mit einem 10X-Objektiv auf das Gitter auf dem Hämocytometer zu konzentrieren. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler die Live-ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Plätzen auf dem Hämocytometer zu zählen. </li><li> Zählen von Zellen in allen vier Sätzen von 16 Plätzen. Nehmen Sie die durchschnittliche Zellzahl von den vier Sätzen von 16 Plätzen und multiplizieren mit 5x10 4. Diese letzte Zahl ist die number von Zellen / ml in der Zellsuspension. </li></ol></li><li> In 2500 Zellen in eine Vertiefung in jeder Kammer. Dies führt zu einer nahezu konfluenten Zelldichte von ~ 30.000 / cm 2. </li><li> Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin). </li></ol></li></ol> 3. Dextran Soaked Agaroseblöcken <ol><li> Erstellen eines Agaroseblock <ol><li> Pour 3% Agarose in das 3D-Druckform (2 mm x 2 mm x 2 mm). </li><li> Erlauben die Agarose in einer Vakuumkammer zum Verfestigen für 30 min alle Blasen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Agarose-Block aus der Form. HINWEIS: Alternativ pour 3% Agarose in kleine Petrischale in einer Dicke von 2 mm. Schneiden Sie ein 2 mm x 2 mm x 2 mm Block mit einem Skalpell oder einem anderen Schneidwerkzeug. Das ist nicht so präzise wie die Formsystem, aber es kann ein wenig leichter zu tun. </li></ol></li><li> komplett submerge der Agarose-Block in einer Lösung der gewünschten Konzentration des chemotaktischen Faktors. Um die Konzentrationsgradienten Bildung beurteilen, spülen Sie die Kammer zunächst mit fluoreszierenden Dextran. Die Konzentration und Molekulargewicht von Dextran sollte einer löslichen Faktor oder Medikament von Interesse entsprechen. </li><li> Genießen Sie die Agarose-Block über Nacht. </li></ol> 4. Zeitraffer des Dextran Diffusion der löslichen Faktor Konzentrationsgradienten Beurteilen <ol><li> Legen Sie das Dextran getränkten Agaroseblock in einem kleinen Platz und der Mikrokanalkammer. </li><li> Setzen Sie den Mikrokanalkammer in einer Zelle-Bildgebungssystem oder verwenden Sie ein anderes Fluoreszenzmikroskop mit einem Zeitraffer-Fähigkeit. Beginnen Sie mit der Zeitraffer gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die angezeigten Ergebnisse sind mit GFP-Filter genommen, 50% Licht, 10.04 pH-Wert und 4-fache Vergrößerung. </li></ol> 5. Zeitraffer des Zellwachstums <ol><li> Platten Zellen in der Mikrokanalkammer an einem Ende derKammer. Hier verwenden 3T3 Fibroblasten. In 2500 Zellen in eine Vertiefung in der Mikrokanalkammer. Zählen von Zellen, wie in 2.2.1 beschrieben. <ol><li> Erlauben Zellen für 60 min in der Kammer zu sitzen, bevor das Hinzufügen Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin). Halten der Mikrokanalkammer , die mit plattierten Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2. Zellmigration durch den Kanal kann mit einem Mikroskop betrachtet werden. </li><li> Fügen Sie einen Marker oder verwenden Sie eine mikroskopische Defekt in der Kammer als Marker, um als Ausgangspunkt dienen der Abstand zwischen der Zelle Front bewegt sich zu quantifizieren. </li></ol></li><li> Stellen Sie einen Gradienten durch ein Agarosegel Platzierung (8 mm 3 Block) , die das konzentrierte Wachstumsfaktor, chemo-Lockstoff, Medikament oder einem anderen Faktor getestet an einem Ende des Mikrokanals (hier 40% FBS als Beispiel wird verwendet) Kammer. </li><li> Nehmen Sie Zeitrafferbilder der sich bewegenden Zelle Front. Hier zeigen die Ergebnisse, Bilder der Zelle front waren, dass alle 12 h unter Verwendung eines Abbildungssystems genommen. </li><li> Verwenden Sie Bilder der Zelle Front Zellwachstumsrate zu quantifizieren. Berechnen Sie die Wachstumsrate, indem zuerst die MATLAB polyfit Funktion (roipoly) eine polygonale Maske von der Zelle Front, die Kanalwände und der Referenzmarke definiert zu erstellen. Die Abmessungen dieser Maske ergeben die Migrationsdistanz der vorderen, von dem mittleren Zellenfrontgeschwindigkeit berechnet wird. Andere Studien haben eine ähnliche Methode 8 verwendet. HINWEIS: Vergleichen der Rand des Zellwachstumsfront auf jedem Rahmen zu der Konzentration des löslichen Faktors in derselben Entfernung. Der lösliche Faktor Konzentrationsgradienten ist ein 1D-Diffusionsmodell Näherung berechnet. </li><li> Nehmen Fluoreszenzbilder der Zellen Phalloidin und DAPI-Färbung verwendet. <ol><li> Fix-Zellen, bevor sie mit Phalloidin-Färbung. <ol><li> Warm 4% Paraformaldehyd bei 37 ° C. </li><li> Fügen Sie genug 4% Paraformaldehyd Zellen zu decken. Halten der Zellen inParaformaldehyd für 10 min. </li><li> Spülen zweimal mit PBS für 15 Minuten jedes Mal. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. </li></ol></li><li> Entfernen PBS aus Zellen und fügen Sie genug permeabilisierend Lösung (0,1% Triton X-100 in PBS) Zellen zu decken. Lassen Lösung für 10 min. </li><li> Zweimal waschen mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. </li><li> Entfernen PBS aus Zellen und fügen Lösung (1% Rinderserumalbumin in PBS) für 20 min blockiert. </li><li> Entfernen Blockierungslösung und waschen 2-mal mit PBS für jeweils 5 min. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. </li><li> Von diesem Punkt, schützen die Zellen vor Licht mit Aluminiumfolie, wenn sie nicht verwendet werden. Entfernen PBS aus Zellen und fügen Phalloidin 488 1:50 verdünnt in PBS für 1 h. </li><li> Waschen Sie 2-mal in PBS für 5 Minuten für jede Wäsche. Verwenden Sie genug PBS um die Zellen zu decken. Dann entfernen PBS aus Zellen. </li><li> Hinzufügen DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol), verdünnt 1: 1000 in PBS zu den Zellen für 15 min. </li><li> Entfernen Sie DAPI undwaschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 5 Minuten für jede Wäsche. </li><li> Entfernen letzten Waschen und fügen Sie genug PBS Zellen zu decken. Zellen können nun mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly+(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly (dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dynamic+temporal+and+spatial+concentration+gradients+using+microfluidic+devices.">Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices.</a> Lab Chip. 4 (3), 164-167 (2004).</li><li>Darby, I., Hewitson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Differentiation+in+Wound+Healing+and+Fibrosis.">Fibroblast Differentiation in Wound Healing and Fibrosis.</a> Int Rev Cytol. 257, 143-179 (2007).</li><li>Thampatty, B. P., Wang, J. H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+study+fibroblast+migration.">A new approach to study fibroblast migration.</a> Cell Motil Cytoskel. 64, 1-5 (2007).</li><li>Discher, D., Mooney, D., Zandstra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factors,+Matrices,+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells.">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324, 1673-1677 (2009).</li><li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#181;-Slide+Chemotaxis:+A+new+chamber+for+long-term+chemotaxis+studies.">&#181;-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biol. , (2011).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+Chamber+Assay.">Boyden Chamber Assay.</a> Methods Molec Biol. 2, 15-22 (2005).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models.">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models.</a> JCB. 203 (4), 691-709 (2013).</li><li>Saadi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+concentration+gradients+in+2D+and+3D+environments+using+a+microfluidic+ladder+chamber.">Generation of stable concentration gradients in 2D and 3D environments using a microfluidic ladder chamber.</a> Biomed Microdevices. 9, 627-635 (2007).</li><li>Cammer, M., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+Responses+by+Macrophages+to+a+Directional+Source+of+a+Cytokine+Delivered+by+a+Micropipette.">Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source of a Cytokine Delivered by a Micropipette.</a> Methods Mol Biol. , 125-135 (2014).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J Cell Sci. 99 (4), 769-775 (1991).</li><li>Wells, C. M., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration+using+the+Dunn+chemotaxis+chamber+and+time-lapse+microscopy.">Analysis of cell migration using the Dunn chemotaxis chamber and time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol. , 31-41 (2005).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2, 329-333 (2007).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+migration+chip+for+chemotaxis-based+microfluidic+selection+of+heterogeneous+cell+populations.">Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li><li>Wright, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+open+microfluidic+devices+for+chemotaxis+studies.">On-chip open microfluidic devices for chemotaxis studies.</a> Microsc. Microanal. 18 (04), 816-828 (2012).</li><li>Adler, M., Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oxygen+gradients+with+arbitrary+shapes+in+a+microfluidic+device.">Generation of oxygen gradients with arbitrary shapes in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10 (3), 388-391 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 013412 (2011).</li><li>Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chambers+for+cell+migration+and+neuroscience+research.">Microfluidic chambers for cell migration and neuroscience research.</a> Microfluid Tech: Rev Protoc. , 167-177 (2006).</li><li>Tang, S. K., Whitesides, G. M., Fainman, Y., Lee, L., Psaltis, D., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic microfluidic and soft lithographic techniques. Optofluidics: Fundamentals, Devices and Applications. , (2010).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research).">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research).</a> Langmuir. 19 (5), 1551-1556 (2003).</li><li>Aidelberg, G., Goldshmidt, Y., Nachman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Microfluidic+Device+for+Studying+Multiple+Distinct+Strains.">A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains.</a> JoVE. (69), (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unsere Mikrokanalkammer kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich der Bestimmung der Zellmigrationsrate in Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Lockstoffe und Messen der Diffusionsrate eines Arzneimittels aus einer Polymermatrix. Es ist möglich, unsere Mikrokanalkammer zu verwenden, Zellen wachsen zu lassen und einen chemoattractant an einem Ende der Kammer platzieren. Die Zellen wachsen in Reaktion auf die chemische Lockstoffe, und die Zellmigration können, indem sie Zeitrafferbilder quantifiziert werden, die analysiert werden, um möglicherweise die Zellmigration Rate zu bestimmen. Repräsentative Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Figur 3 gezeigt, wo die Wachstumsrate wurde bestimmt 13,4 &amp; mgr; m / h unter Verwendung der MATLAB polyfit Funktion. Eine andere Verwendung unserer Mikrokanalkammer ist es, die Diffusionsgeschwindigkeit eines Wirkstoffes aus einer Polymer-Matrix zu messen. Ein fluoreszierend markierte Dextran eines ähnlichen Molekulargewicht auf das Medikament von Interesse verwendet werden, um die Diffusion des Dru zu modelliereng Interesse. Es ist wichtig zu beachten, daß die Proben müssen sorgfältig als eine große Menge von Konvektion gehandhabt wird, um den Gradienten zu stören. Die repräsentativen Ergebnisse dieses Verfahrens sind in Abbildung 4 dargestellt. Ein Vorteil dieses Modells im Vergleich zum Test Boyden-Kammer ist, dass es wegen der flachen Oberfläche mehr für adhärenten Zelltypen ist; während müssen die Zellen vor Einhaltung durch ein kleines Rohr in der Boyden-Kammer fallen. Eine weitere Einschränkung des Boyden-Kammer-Assay ist, dass es ein Endpunkt-Assay ist; Somit kann die Chemotaxis nicht visuell beobachtet werden. Im Gegensatz dazu mit unserer Methode, Chemotaxis wird durch die Zeitraffer-Bilder 9 beobachtet. Die Verwendung von Mikropipetten enthält Chemoattraktoren haben auch ein Verfahren zur Beobachtung der Zellmigration verwendet. Jedoch ist der Hauptnachteil dieses Verfahrens geringen Durchsatz 10. Die Dunn Chemotaxis Kammer ist ein weiterer Test, der in Verbindung mit Zeitraffer-Bildgebung wie th verwendet wirde Verfahren 11 hier detailliert, 12. Die Kammer besteht aus zwei auf dem Gesicht geschnitzt konzentrischen Kreisen des Glasobjektträger, um eine innere und äußere gut zu schaffen, und eine Brücke trennt die beiden Brunnen. Die chemoattractant wird in die äußere Vertiefung gegeben und die Zellen werden von der inneren und an der äußeren und wandern kann. Diese Migration wird unter Verwendung von Zeitrafferbilder quantifiziert, die Bildanalyse-Software analysiert werden. Ähnlich wie bei der Boyden-Assay, einer der Begrenzungen des Dunn Kammer-Assay ist, dass es nicht leicht individuelle löslichen Faktor Konzentrationsgradienten modifiziert werden kann, zu schaffen. Eine weitere einfache Methode zur Beurteilung der Zellmigration ist ein in vitro 13 zerkratzen. Diese Methode ist schnell und kostengünstig, da es erfordert nur einen Kratzer in der Zellschicht und Erfassung von Zeitraffer-Bilder der Zellmigration der Nähe des zuvor erstellten Grund auf neu erstellen. However, der große Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht geeignet ist, Antworten auf einen chemischen Faktor Konzentrationsgradienten zu messen. Unsere Methode bietet das Potenzial, einen chemischen Gradienten zu erzeugen und die Zellmigration in Bezug auf die chemischen Gradienten zu quantifizieren. Unsere Methode kann mit der Ankratzmethode als Scratch kombiniert werden können, in der Zell-Monoschicht erzeugt werden, während ein chemotaktischer Faktor in einer der Vertiefungen in der Mikrokanalkammer vorhanden ist. Dies ermöglicht die Quantifizierung und Modellierung der Wundheilung. Eine weitere potentielle Anwendung unserer Vorrichtung ist die Reaktion der Krebszellen auf Mittel, um zu bestimmen, die das Zellwachstum hemmen. Andere Mikrofluidik - basierte Systeme wurden auch für die Zellmigration Studien verwendet wurde 14, 15. Diese Studien verwenden lithographische Techniken mit Reinräumen Urformen in Silizium und / oder Laserbearbeitung zu schaffen mikrofluidischen Kanälen in Silizium-Wafern zu schaffen. Silicon wafer Mikrobearbeitung kann im Vergleich zu unserem Verfahren teuer sein, die billiger Materialien (PDMS und Acryl) verwendet einen Mikrokanal Kammer herzustellen. Unsere Vorrichtung überwindet die Begrenzung der anderen PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtungen , in denen es nicht möglich war 15 kleine 3D - Kanäle zu erstellen. Mit unserer Methode haben wir erfolgreich PDMS basiertes Gerät mit kleinem Durchmesser Kanäle erstellt. Andere Studien haben eine PDMS-basierte mikrofluidische Vorrichtung mit zwei Schichten von Mikrokanälen und einer Mehrkanal - Gasmischer verwendet , die Computer gesteuert, um beliebige Gradienten von Sauerstoff zu erzeugen 16 , die Migration von Zellen , die unter unterschiedlichen Gradienten von Sauerstoff zu untersuchen. Es gibt Potenzial für unser Gerät in ähnlicher Weise mit der Zugabe einer Gasmischkammer an einem Ende des Mikrokanals Kammer verwendet werden. Mikrofluidik-Geräte werden oft mit weichen lithographischen Techniken hergestellt; diese können angepasst werden, um Zellmigration chambe zu erstellenrs. Diese Verfahren umfassen das Drucken einer Maske mit Kanalmuster mit Computer Aided Design (CAD). Diese Masken werden dann auf einer Masterform projiziert, beschichtet mit einer lichtempfindlichen, durch optische Lithographie widerstehen. Nachdem der Masterform hergestellt wird, wird PDMS auf dem Master gegossen und um zu härten eine PDMS - Form zu erzeugen , die 17 für mikrofluidische Studien verwendet werden können, 18, 19. Chemoattractant oder chemorepulsive Verbindungen werden in der Kammer in hoher Konzentration in einem der Behälter 17 angeordnet Gradienten zu erzeugen. Während diese Techniken ähnlich unserer Einrichtung sind, können sie aufgrund der hohen Kosten für die Erstellung der Master-Form für das System und die Verwendung von Reinräumen teuer sein. Darüber hinaus können diese Verfahren schwierig für Schüler in einer Klasse basierend Einstellung zu lernen. Die Einsätze in unserem Set-up verwendet, um die Kanäle zu schaffen mit einer Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, einschließlich 3D-printing und Laserschneiden. Somit ermöglicht unser System für die Schaffung einer Vielzahl von Formen für die relativ niedrigen Kosten besonders als 3D-Druck mehr erschwinglich und weithin verfügbar wird. PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtungen zur Messung der Zellmigration und Wachstum wurden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Zum Beispiel in den Neurowissenschaften studiert Forschung 20, wurden Geräte mit Softlithographie - Techniken hergestellt , in dem die PDMS - Komponente auf einer Gewebekulturschale oder Glas , um zwei Kammern zu bilden , gelegt wurde , die durch eine physikalische Barriere mit Mikrongröße Rillen getrennt wurden , damit Neuronen in den Abteilen zu wachsen. Zeitraffer-Bilder aufgenommen wurden Neuronen zu zeigen, die Barriere überqueren. Das Verfahren zur Mikrostrukturierung verwendet, um dieses Gerät zu erzeugen, ist komplex, während die Herstellungsverfahren für unser Gerät einfach und kann von den Forschern auf allen Ebenen verwendet werden. Eine andere Studie auch eine einfache Low-Cost-Verfahren zur Herstellung eines si Herstellungmilar PDMS Mikrofluidik-Vorrichtung eine Masterform erstellt von Klebeband, um mit einem Eindruck in den PDMS zu schaffen Mikrokanäle zu erzeugen. Ein Vorteil unseres Ansatzes über die eine in diesem Verfahren beschrieben wird , ist , dass die Kanäle in unserem Verfahren in einem Schritt hergestellt werden, wobei dieses Protokoll Anhaftung zwischen zwei PDMS Schichten erfordert , die 21 Probleme mit Mittelstrom zu den Zellen erzeugt. Abschließend ist unser Mikrokanalkammerverfahren anpassbar und verwendet werden können, unterschiedliche Ergebnisse zu erzielen. Das Verfahren ermöglicht die Erstellung eines Konzentrationsgradienten, um die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden. Darüber hinaus bietet unser Gerät einen Vorteil gegenüber bestehenden Vorrichtungen aufgrund seiner relativ geringen Kosten und einfache Handhabung für die Forscher auf allen Ebenen.

In order for vital processes such as wound healing, immune responses, and embryonic development to occur, cell migration must take place. Cell migration involves the interaction between cells and neighboring cells, the extracellular matrix, and soluble chemical cues (attractants or repellants). As an example, in the process of wound healing, fibroblasts play an integral role in fibrogenesis and wound contraction, where the cells are recruited to the site of injury to synthesize collagen in order to form the extracellular matrix3. Numerous mechanisms behind the migration of fibroblasts to a wound site have been studied, and they include different mechanical, physical, electrical, and chemotactic factors4. Fibroblasts respond especially well to different concentration gradients of growth factors. These different growth factors work together to optimize tissue regeneration5. While observing the chemotactic response of fibroblasts to growth factor concentrations, one can study the pattern of directional migration of fibroblasts and how they orient themselves around physical obstacles in order to reach their destination. Therefore, the goals of this study were to first develop a system in which fibroblast growth could be tracked under guidance by physical barriers and to secondly model the growth of fibroblasts as they navigate through the system.
Currently, the Boyden chamber assay is the most widely used system to measure the migration of cells6. The Boyden chamber consists of a two-chamber multi-well plate where each well may contain medium with or without chemoattractants7. A filter membrane provides a porous interface between the two chambers in each well; this creates a barrier so that cells cannot pass through unless it is by active migration. Typically, for the Boyden chamber, a chemoattractant is added to the lower chamber, and the system is allowed to equilibrate to form a gradient between the upper and lower wells4. One problem with the Boyden chamber assay is that steep gradients end up forming along a single axis perpendicular with the surface of the membrane. This causes the difference in the chemoattractant concentration between the upper and lower wells to be a lower than what was originally expected. Due to this constraint, the Boyden chamber assay makes it hard to correlate specific cell responses with particular gradient characteristics, such as the slope and the concentration difference. Without these measurements, it is hard to study multi-gradient signal integration.
To address some of the constraints of the traditional Boyden chamber assay, microfluidic assays have been developed to form customizable concentration gradients1. Standard methods for creating microfluidic systems require clean rooms for lithographic techniques. These techniques can be difficult to learn especially in a standard classroom setting. Thus, we have designed a chamber system for measuring cell migration that can be made without using a clean room. Using our system, the wells of the assay can be adjusted to a preferred size, and a linear concentration gradient of customized slope can be produced. This allows for accurate measurement of chemotaxis from random movement. The design is an inexpensive and easy-to-use system to model cell growth in response to different chemical stimuli.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td>poly(dimethylsiloxane) 2-part kit including silicone elastomer base and silicone elastomer curing agent</td></tr><tr><td>Acrylic Sheets</td><td>US Plastic</td><td>44200</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate&amp;ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20s-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Type I, Low EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serium</td><td>Fisher Scientific</td><td>16000036</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td>Cell media components</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24384</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Cell Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AME3300</td><td>Instrument used for taking time-lapse images</td></tr><tr><td>Versa Laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>Model number VLS2.30</td><td>Laser cutter used for cutting plastic</td></tr></tbody></table>

a customizable chamber for measuring cell migration

Die Zellmigration ist ein wichtiger Teil der Immunantwort, Wachstum und Wundheilung. Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, der Wechselwirkungen zwischen Zellen, die extrazelluläre Matrix, und löslichen und nicht-löslichen chemischen Faktoren (zB chemische Lockstoffe) beinhaltet. Standardmethoden für die Migration von Zellen zu messen, wie der Boyden-Kammer-Assay, der Arbeit von Zellen auf beiden Seiten eines Teilers zu zählen. Diese Techniken sind einfach zu bedienen; Sie bieten jedoch wenig geometrische Modifikation für verschiedene Anwendungen. Im Gegensatz dazu können Mikrofluidik - Vorrichtungen verwendet werden , die Zellmigration mit anpassbaren Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren 1, 2 zu beobachten. Allerdings Methoden für Mikrofluidik basierte Assays machen kann schwierig sein, zu lernen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Erzeugung von Zellkulturkammern die Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Konzentrationsgradienten zu messen. Unsere Zelle migration Kammerverfahren verschiedene lineare Konzentrationsgradienten, um zu schaffen Zellmigration für eine Vielzahl von Anwendungen zu untersuchen. Dieses Verfahren ist relativ einfach zu bedienen und wird in der Regel von Studenten durchgeführt. Die Mikrokanalkammer wurde durch Einbringen eines Acryleinlage in der Form des endgültigen Mikrokanalkammer und in eine Petrischale geschaffen. Danach wird Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) wurde auf die Oberseite des Einsatzes gegossen. Das PDMS wurde härten gelassen und dann wurde die Einlage entfernt. Dies ermöglichte die Schaffung von Vertiefungen in jeder gewünschten Form oder Größe. Zellen anschließend in die Mikrokanalkammer hinzugefügt werden können, und löslichen Mittel können durch Einweichen eines Agarose-Block in dem gewünschten Mittels zu einer der Vertiefungen zugegeben werden. Die Agarose-Block wird zu einer der Vertiefungen gegeben, und Zeitraffer-Bilder können in der Reihenfolge der Mikrokanalkammer entnommen werden, die Zellmigration zu quantifizieren. Änderungen dieses Verfahrens kann für eine gegebene Anwendung gemacht werden, diese Methode hig machenhly anpassbar.

Figur 2 zeigt die Bewegung der Zellenfront über den Kanal als Reaktion auf einen Gradienten von fötalem Rinderserum am entgegengesetzten Ende des Kanals angeordnet , von dem die Zellen ausplattiert. Die Zellfront wird bei 48 h (2A) gezeigt, 72 h (2B), 96 h (2C) und 120 h (Figur 2D) Post plating. Die Bewegung der Zellenfront wurde mit diesen Zeitraffer-Bildern verfolgt, und die Laufstrecke und die Wachstumsrate durch die MATLAB polyfit Funktion berechnet wurden. Daraus wurde die mittlere Zellenfrontgeschwindigkeit zu 13,4 &amp; mgr; m / h (Abbildung 3). Figur 4 zeigt das Fluoreszenz Gradienten , der durch ein Dextran durchnässten Agarose Block an einem Ende des Kanals platziert und ermöglicht Dextran für 12 h durch den Kanal zu diffundieren. Ein Zeitraffer-Bild wurde zu jeder Stunde, und die Fluoreszenz über den Abstand genommen von<html> der Kanal wurde gemessen und aufgetragen in Figur 4 und im Vergleich zu einem 1D - Diffusionsmodell , wie gezeigt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig2.jpg" /> Abbildung 2: Zelle Front - Bewegung. Zeitraffer-Bilder der Zelle Front in der Mikrokanalkammer durch den Kanal zu bewegen. Die Zellenfront in orange Linien markiert und die Wanderungsstrecke ist im Preis inbegriffen. Diese Migrationsdistanz wurde aus der Markierung auf der Platte an der Vorderseite der Zellenfront gemessen, wie dargestellt. Eine 1 mm Maßstab ist in weiß dargestellt. A) 48 Stunden nach der Plattierung, B) 72 Stunden nach der Plattierung, C) 96 Stunden nach der Plattierung, D) 120 h nach der Beschichtung. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> e 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55264 / 55264fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: Wachstumsrate Berechnung. Zelle Front Bewegung verfolgt mit Zeitrafferaufnahmen. Wachstumsrate wurde mit der MATLAB polyfit Funktion (roipoly) berechnete durchschnittliche Zellfrontgeschwindigkeit von 13,4 &amp; mgr; m / h zu erhalten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55264/55264fig4.jpg" /> Abbildung 4: Fluorescent Gradient mit Dextran. Fluoreszenzintensität über dem Abstand des Kanals gemessen, wo jede Zeile der Gradient zu einer bestimmten Stunde darstellt. ImageJ wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität zu berechnen. Dies kann getan werden, indem die Analyse | Werkzeug messen. Zuerst wählen Sie Set Messungen unter Intensität analysieren und auszuwählen. Wählen Sie dann unter, um all zu bekommen Analysieren MaßzahlWut Pixelintensität. Dies kann in Abhängigkeit vom Abstand in Mikron aufgetragen werden, wie in dieser Figur gezeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55264/55264fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration at JoVE.com

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen.

Eine Anpassbare Kammer zur Messung der Zellmigration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

a-customizable-chamber-for-measuring-cell-migration

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K Aufrufe.  Clemson University.  Dieses Protokoll Informationen eine anpassbare Methode Zellmigration in Reaktion auf die chemischen Lockstoffe zu messen, die auch die Diffusionsgeschwindigkeit eines Arzneimittels verwendet werden kann, aus einer Polymermatrix zu bestimmen. 

Serie: A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Bewertung der Zelle Invasion und Migration-Prozess: ein Vergleich des Video Mikroskop-basierte Kratzers Wunde Assay und der Boyden Kammer-Test

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Krebsforschung

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Mit Abschottung Mikrofluidiksysteme und Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Medizin

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Biotechnik

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Eine einfache Migration/Invasion Workflow mit einer automatisierten Leben-Zelle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

Quantitative Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion nach synthetischer mRNA-Transfektion

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and epithelial wound healing. Applying a direct current electric field to cultured cells in vitro induces directional cell migration, or galvanotaxis. The 2-dimensional galvanotaxis method we demonstrate here is modified with custom-made poly(vinyl chloride) (PVC) chambers, glass surface, platinum electrodes and the use of a motorized stage on which the cells are imaged. The PVC chambers and platinum electrodes exhibit low cytotoxicity and are affordable and re-useable. The glass surface and the motorized microscope stage improve quality of images and allow possible modifications to the glass surface and treatments to the cells. We filmed the galvanotaxis of two non-tumorigenic, SV40-immortalized prostate cell lines, pRNS-1-1 and PNT2. These two cell lines show similar migration speeds and both migrate toward the cathode, but they do show a different degree of directionality in galvanotaxis. The results obtained via this protocol suggest that the pRNS-1-1 and the PNT2 cell lines may have different intrinsic features that govern their directional migratory responses.

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Verwendung Maßgeschneiderte Galvanotaxis Chambers zu Directional Migration Studie von Prostatazellen

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

Biologie

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

Quantifizierung der dreidimensionalen Zellmigration innerhalb und in granuläre Hydrogel-Biomaterialien

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...