Name: hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples
Uploaded: 2016-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples at JoVE.com

We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.

1. Sabitleme ve katıştırma <ol><li> reaktif hazırlama <ol><li> 10x Fosfat tamponlu tuz (PBS) <ol><li> 80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 gr 2 Na HPO 4 ve 2.4 gr KH 2 PO 4 800 ml çift distile su (GKD 2 O) ekleyin ve HCl ile pH 7.4 ayarlayın. 1 L &#39;lik bir toplam hacme O GKD 2 ekleyin, sonra 1000 ul dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyin ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Mağaza PBS gece boyunca 20 dakika sonraki gün boyunca 121 ° C&#39;de, oda sıcaklığı ve otoklavda. </li></ol></li><li> 1X PBS <ol><li> , HPO 4, 0.01 M Na 2 bir nihai konsantrasyon elde etmek üzere GKD 2 O 1:10 oranında 0.002 M KH 2 PO 4, 0.003 M KCI ve 0.13 M NaCI hazır ve 10X PBS ile seyreltilir. </li></ol></li><li> Paraformaldehid (PFA) fiksatif Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. Davlumbaz altında hazırlayın. Eldiven giy. <ol><li> 250 ml PFA fiksatif hazırlamak için, 100 ısıtmakmi 1 x 70 PBS - 80 ° C ve NaOH 1.750 ul ekle. Daha sonra paraformaldehit 10 g ekleyin ve çözülene kadar iyice karıştırın. Buz üzerinde solüsyonu yerleştirilir ve daha sonra H2 ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın SO 4 - soğutulduktan sonra, (260, 100 ml 270 ul). </li><li> , 1 x PBS ile 250 ml hacim ayarlama% 0.25 nihai konsantrasyona 625 ul glutaraldehit ekleyin. Fiksatif süzülmesini kolaylaştırmak için 250 ul, Triton X-100 ve 250 ul Tween 20 ekleyin. Not: PFA sabitleyici olarak sabitleme yeteneğini kaybetmeden bir ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> DEPC ile muamele edilmiş su ile etanol içerisinde farklı konsantrasyonlarda (% 30,% 50,% 70,% 85 ve% 95) hazırlayın. </li></ol></li><li> Bitki numune toplama <ol><li> aksiller tomurcukları <ol><li> Dört yaprak aşamasında olgun Orkide orkide bitkileri kullanın. Dikkatle ellerini kullanarak yaprak orta damarı aşağıdaki yaprak yırtarak yaprakları kaldırmak. </li><li> Dikkatli için keskin bir neşter kullanabilirsinizully Monopodial sap üzerinde üçüncü ya da dördüncü yaprağın tabanından koltuk altı tomurcukları kaldırın. </li></ol></li><li> Tohum örneği <ol><li> tozlaşma sonra 4 ayda olgun orkide tohum kabukları hasat. bir neşter ile uzunlamasına tohum kabukları kesin. nazikçe açılış tohum pod sallamak ve filtre kağıdı üzerinde kuru tohumları bırakın. </li></ol></li><li> Protocorm <ol><li> Bir 1/2 x Murashige ve Skoog agar plakası olgun orkide tohumları ekmek ve doku kültürü, 12 saat aydınlık döneminde odası ve 25 ° C&#39;lik sabit bir sıcaklıkta büyür. Ekimden sonra 7 hafta yeşil protocorm tadına bakın. </li></ol></li><li> Protocorm benzeri cisimler (PLB&#39;ler) <ol><li> Adım 1.2.3.1 aynı büyüme koşulları altında, daha önce 10 ve yer tarif edildiği gibi T2 agar yenileyici üzerinde orkide PLB&#39;ler büyütün. 8 mm - 5 yükseklikte 10 PLB&#39;ler toplayın. </li></ol></li><li> yaprak örnek <ol><li> Aşamasında tarif edildiği gibi olgun Orkide Orkide alınan yaprak dokusu, toplamak1.2.1.1. </li><li> İkinci Yeni geliştirilen yapraktan yaprak dokusu (7 mm uzunluk x 5 mm genişlik) küçük bir parça kesmek için keskin bir neşter kullanın. </li></ol></li><li> kök örnek <ol><li> Adım 1.2.1.1 açıklanan aynı bitki kullanılarak, keskin bir neşter kullanılarak kök ucu dokusunun 1 cm uzunluğunda teşrih. </li></ol></li><li> genç başak <ol><li> uzunluğu 10 cm sapı çiçek uç kısmından genç başak doku kesmek için keskin bir neşter kullanın. </li></ol></li><li> Çiçek tomurcuğu <ol><li> orkide çiçek sapı çapı 5 mm küçük bir çiçek tomurcuğu tüketim. çiçek tomurcuğu dokusundan uzunlamasına (kalınlık 3 mm) bir bölümünü kesin. </li></ol></li><li> Yaprak dokuları ve tahılların başakçık dokular <ol><li> pirinç, buğday, mısır bitkileri ilk yeni geliştirilmiş yapraklardan 1 cm uzunluğunda yaprak ayası doku kesilir. </li><li> bitkilerden 10 Spikelets (pirinç, buğday ve mısır) anthesis&#39;e bir gün önce toplayın. </li></ol></li></ol></li><li> tespit<ol><li> 15 ml buz gibi soğuk PFA fiksatif içeren bir cam sintilasyon şişesi içine transfer hemen bitki örneklerini düzeltildi. </li><li> 4 ° C soğuk bir odada bitki örneklerinin bir vakum (~ 720 mm Hg) uygulayın. 15 vakum tutun - 20 dakika (küçük kabarcıklar örneklerinden serbest bırakılmalıdır). dokuların en vakum yayımlanmasından sonra lavaboya kadar bu adımı yineleyin. Gecede vakum tutun ve ertesi gün yavaş yavaş vakumu boşaltmak. </li></ol></li><li> kurutma NOT: sızma adımlarında sabitleme aynı flakon kullanın. Dökün ya da bir önceki adımda çözüm boşaltın ve şişenin içine yeni çözüm 15 ml ile değiştirmek için bir pipet kullanın. dokuların doku bağlı olarak, örneğin daha uzun bir süre orkide aksiller tomurcuk, tohum, protocorm ve PLB ve pirinç, buğday tane sayısı ve mısır gibi sert dokular tedavi; Böyle bir kısa süre orkide çiçek tomurcuğu, genç başak, yaprak ve kök ve pirinç, buğday yaprak ve mısır gibi yumuşak dokuların tedavisi. <ol&gt; <li> Tespit edildikten sonra buz üzerinde 10 dakika süre ile PBS 1X 15 ml örnek bırakın. <ol><li> aşağıdaki gibi, oda sıcaklığında 15 mi etanol seri örnekleri kurutmak:% 30 etanol, 30 dakika,% 50 etanol 30 dakikada,% 70 etanol için 1 saat süre ile, daha sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca% 85 etanol, sert dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika ve daha dokular için 54 dakika karıştırıldı ve daha yumuşak dokular için 30 dakika boyunca iki kez% 100 etanol için% 95 etanol. Not: bitki örnekleri, birkaç ay boyunca 4 ° C &#39;de% 70 etanol içinde saklanır. </li></ol></li></ol></li><li> parafin infiltrasyonu <ol><li> aşağıdaki şekilde oda sıcaklığında, sert dokular için 54 dakika her biri ve yumuşak dokular için 30 dakika boyunca 15 ml etanol ve iksilen yerine karışımı ile örnekleri Infiltrate: etanol / ksilen yerine (2: 1, hac / hac), etanol / ksilen yerine (1 : 1, h / h) etanol / iksilen yerine (1: 2, h / h), ve iki kez de saf ksilen yerine. Dikkat: Ksilen zehirlidir. Davlumbaz bu adımı yapın. </li&gt; <li> gece boyunca sert dokular için, 60 ° C&#39;de bir fırın içinde 15 mi iksilen yerine parafin karışımı ile şişe içinde örnek sızmakta ve yumuşak dokular için 60 dakika boyunca, aşağıdaki gibidir: ksilen yerine / parafin (2: 1, hac / hac), iksilen yerine / parafin (1: 1, h / h) ve ksilen yerine / parafin (1: 2, hac / hac). </li><li> günde iki kez 15 mi saf parafin ile örnek sızarak bir fırın içinde, 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Adımı tekrarlayın ertesi gün 1.5.3. </li></ol></li><li> doku gömme <ol><li> parafin blok dokuların gömmeden önce parafin haznesindeki mum eritmek için önceden doku gömme merkezi 1 saat gücü açın. </li><li> 62 ° C&#39;de ısınma tepsi üzerinde metal kalıpları (taban 3.3 cm uzunluk x 2 cm genişliğinde boyutunu) Isınma ve kalıp tabanına yaklaşık 13 ml erimiş mum dökün. </li><li> ısındı forseps ile kalıbın içine bölüm 1.5.4 itibaren bir doku örneği aktarın ve istenilen pozisyona yönlendirmek. </li><li> kalıp taşıbalmumu katılaşmış kadar dikkatlice serin plaka üzerine, ve bırakın. </li></ol></li></ol> 2. Doku Kesit <ol><li> Parafin kesit yöntemi <ol><li> (Bölüm 1.6.2 de aynı boyutta) bir kalıp üstünde bir gömme kasetin koyarak bir mum üs yapmak erimiş balmumu ile doldurun ve balmumu katılaşmış sonra kalıp çıkarmak. NOT: gömme kaset örnek parafin blok demirlemek bir mum tabanı oluşturacaktır. </li><li> Uygun şekil ve büyüklükte içine parafin blok Trim ve düz bir spatula bazı mum parçaları yerleştirin. balmumu erir kadar alkol yazıcı kullanarak balmumu parçaları ısıtın ve daha sonra blok uymak için Bölüm 2.1.1 balmumu bazında erimiş mum yerleştirin. mikrotom onu ​​kelepçe. </li><li> mikrotom üzerine yeni bir bıçak yerleştirin ve mikrotom bölümlendirilmeleri kolaylaştırmak için 5 derece açı ayarlayın. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi, 11, ince dilimler (10 uM) içinde Örnek parafin bloğu kesin. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Hibrid-Cut kesit yöntemi <ol><li> Bir jilet kullanarak uygun bir boyuta üstündeki bir yamuk yüzeye sahip bir sütun adım 1.6.4 örnek parafin blok Trim. </li><li> Kriyostat sahnenin merkezine bazı Optimal Kesme Sıcaklık bileşik (OCT) ekleyin. Kriyostat aşamasına parafin blok takın ve daha sonra hızlı bir şekilde istenen pozisyona doku bloğu yönlendirin. </li><li> Kriyostaz odasına parafin blok / sahne aktarın. 10 Ekim dakika süreyle -42 ° C&#39;de hızlı dondurma çubuğunda katılaşmaya izin verin. OCT (Şekil 2C) katılaşma sırasında blok hareket etmiyor. </li><li> Kriyostat adaptörü ve oda sıcaklığı Kriyostat adaptöre parafin blok / sahne takmadan önce -20 ° C ve -16 ° C sırasıyla soğumasını bekleyin. kalınlıkta 10 um Bölüm dokular. </li><li> forseps ile doku bölümleri seçin. Bir Poly 800 ul DEPC arıtılmış su ile ilgili bölümleri Float - L - lizin COATed slayt ve 42 ° C&#39;de sıcak bir tabağa slaytlar aktarın. </li><li> Bölümler 42 ° C&#39;de DEPC ile muamele edilmiş su düzleştirmek için izin verir. kenarından suyu boşaltmak için filtre kağıdı kullanın. </li><li> bir gecede 42 ° C sıcak plaka üzerinde slayt koyarak slayt Dağı doku. </li></ol></li></ol> 3. Doku Boyama <ol><li> Parafinden arındırma lamların <ol><li> sıcak plaka slaytları toplayın ve bir boyama rafa koyun. davlumbaz bir boyama kavanoza 150 mi ksilen ilave edin ve 5 dakika boyunca ksilen rafı bırakın. </li></ol></li><li> rehidrasyon <ol><li> DEPC ile muamele edilmiş su içinde etanol çözeltileri farklı konsantrasyonlarda (100,% 95,% 70,% 50,% 30,%) hazırlanması ve sırasıyla farklı boyama kavanoz içine 150 ml doldurun. </li><li> etanol konsantrasyonu, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca her bir adımı azaltmak için bir dizi numune rehidrate. boyama slaytlar aktarın başka kavanoz içeren d bir kavanoz rafifferent etanol konsantrasyonu:% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol,% 50 etanol ve% 30 etanol. </li><li> Rehidrasyon sonra 3 dakika boyunca GKD 2 O örnekleri bırakın. </li></ol></li><li> hematoksilin boyama <ol><li> 1.5 dakika süreyle hematoksilen çözeltisi içinde doku slaytları daldırarak leke doku örnekleri. </li><li> Daha sonra, bir kaç saniye için 12 N hidroklorik asit (HCI) 2 damla ve GKD 2 O kısaca yıkayın - 1 içeren 2 O GKD kısaca durulayın </li></ol></li><li> kurutma <ol><li> % 30 Etanol ve% 50 etanol,% 70 etanol,% 95 etanol ve% 100 Etanol: oda sıcaklığında 3 dakika boyunca etanol konsantrasyonlarının artışının bir dizi numune kurutmak. 5 dakika boyunca davlumbaz ksilen ile numune temizleyin. </li></ol></li><li> Montaj <ol><li> slayt üzerine ksilende göre montaj orta uygun 600 ul bırakın. Dikkatle numune üzerinde bir lamel yerleştirin. İyi kaliteli görüntüler elde etmek için şekillendirme hava kabarcıkları kaçının. </li><li> slaytlar kuru gecede hava izin verin. Ertesi gün, bir mikroskop altında örnek uyun. Not: Görüntüler numunelerin boyutuna bağlı olarak 400X büyütme 25X ele geçirildi. </li></ol></li></ol> İn Situ Hibridizasyon 4. <ol><li> Probe sentezi <ol><li> Klon Orkide aphrodite aktin geni özel kodlama sekansı kullanılarak primerler 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;ve 5&#39;-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC 3&#39; (242 bp PCR amplikonu için) ve CyclinB1 1; gen spesifik kodlama sekansı kullanılarak primerler 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39; ve 5&#39;-ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 &#39;(327 bp PCR amplikonu için) 12 tarif edildiği gibi. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak (örneğin, pGemT) vektörleri içine belirli kodlama dizilerini Arter. </li><li> diyoksijenin oluşturun (DIG) üreticinin talimatlarına göre SP6 / T7 DIG RNA etiketleme kiti kullanılarak sens ve antisens sondaları etiketlis. </li></ol></li><li> In situ hibridizasyon <ol><li> Hibrid-Cut yöntemi kullanılarak elde 2 nci ve 3 üncü aksiller tomurcuk doku dilimleri (10 mikron kalınlığında) Kes ve kaplamalı slayt üzerine dilim monte edin. </li><li> ksilen Deparaffinize doku bölümleri (3.1.1), etanol konsantrasyonu (3.2.2) azaltılmasında rehidrate ve 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de 2 mg / ml proteinaz K ile sindirmek. </li><li> Protokole göre in situ hibridizasyon gerçekleştirmek daha önce 59 ° C ve CyclinB1 60 ° C Aktin için hibridizasyon sıcaklığı ile, örneğin, bazı değişiklikler ile 11,13 tarif;. 1 40 ng DIG işaretli RNA probu ile slayt melezleşme. </li><li> 11 tarif edildiği gibi hibridizasyon sinyalleri tespit etmek için nitro mavi tetrazolyum / 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (NBT / BCIP) solüsyonu kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).</li><li>Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-sectioning+of+plant+tissues.">Freeze-sectioning of plant tissues.</a> Stain Technol. 45, 265-272 (1970).</li><li>Ruan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cryosection+method+for+polyethylene+glycol+hydrogels+used+in+tissue+engineering.">An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering.</a> Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).</li><li>Prychid, C. J., Rudall, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+oxalate+crystals+in+monocotyledons:+A+review+of+their+structure+and+systematics.">Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics.</a> Ann Bot. 84, 725-739 (1999).</li><li>Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematics+and+biology+of+silica+bodies+in+monocotyledons.">Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons.</a> Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).</li><li>Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+calcium+oxalate+monohydrate.">Structure of calcium oxalate monohydrate.</a> Nature. 208, 1197-1198 (1965).</li><li>Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maize+silicon+influx+transporters.">Identification of maize silicon influx transporters.</a> Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).</li><li>Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+silicon+in+preventing+appressorial+penetration+by+the+rice+blast+fungus.">The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus.</a> Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).</li><li>Ma, J. F., Yamaji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+uptake+and+accumulation+in+higher+plants.">Silicon uptake and accumulation in higher plants.</a> Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).</li><li>Chen, W., Tang, C., YL, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+doubling+by+in+vitro+culture+of+excised+protocorms+or+protocorm-like+bodies+in+Phalaenopsis+species.">Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species.</a> Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).</li><li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Hybridization+for+the+Precise+Localization+of+Transcripts+in+Plants.">In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants.</a> J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).</li><li>Park, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+Protocols.">PCR Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 687, (2011).</li><li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation,+expression+profiling,+and+protein+interaction+studies+of+the+core+cell-cycle+genes+in+Phalaenopsis+aphrodite.">Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite.</a> Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).</li><li>Lee, Y. -. I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryology+of+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa:+embryo+development.">Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development.</a> Bot Stud. 49, 139-146 (2008).</li><li>Endo, M., Ikusima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+rhythm+and+characteristics+of+photosynthesis+and+respiration+in+the+leaf+and+root+of+a+Phalaenopsis+plant.">Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant.</a> Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).</li><li>Guo, W. J., Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+leaf+and+plant+age,+and+day/night+temperature+on+net+CO2+uptake+in+Phalaenopsis+amabilis+var.+formosa.">Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa.</a> J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).</li><li>Lewin, J., Reimann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+and+plant+growth.">Silicon and plant growth.</a> Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).</li><li>Kaufman, P. B., Simpson, T. L., Valcani, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica+in+shoots+of+higher+plants.">Silica in shoots of higher plants.</a> Silicon and siliceous structures in biological systems. , 409-449 (1981).</li><li>Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Kranz+anatomy+to+understand+C4+evolution.">Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution.</a> J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).</li><li>Liu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+transcriptional+dynamics+of+maize+embryonic+leaves+during+seed+germination.">Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).</li><li>Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+adaxial+and+abaxial+stomata,+epidermal+structure+and+photosynthesis+to+CO2+enrichment+in+maize+leaves.">Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves.</a> J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).</li><li>Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundstr&#246;m, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-radioactive+in+situ+Hybridization+Protocol+Applicable+for+Norway+Spruce+and+a+Range+of+Plant+Species.">Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species.</a> J. Vis. Exp. (26), (2009).</li><li>Hejatko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+technique+for+mRNA+detection+in+whole+mount+Arabidopsis+samples.">In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples.</a> Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).</li><li>Javelle, M., Timmermans, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+localization+of+small+RNAs+in+plants+by+using+LNA+probes.">In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes.</a> Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).</li><li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+gene+expression+in+plants.">In situ analysis of gene expression in plants.</a> Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).</li><li>Drea, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+method+for+systematic,+high+resolution+in+situ+analysis+of+mRNA+distribution+in+plants.">A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants.</a> Plant Methods. 1, 8 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Bitki hücreleri bitki dokusu kesit sırasında doku yırtılma sorunlara neden sert hücre duvarları, sert elyaflar, kristaller, ve yüksek su içeriğine sahiptir. Parafin esaslı kesit genellikle bitki dokuları kullanılır da, endojen kristaller genellikle (Şekil 1) kesit sırasında bitki dokuyu yırtabilir. Çünkü, bitki hücreleri içinde doğal olarak yüksek su içeriği, kriyostat tabanlı kesit genellikle kırık hücreleri ve kırık doku bölümleri neden olur. Bu çalışmada, Hibrid-Cut adlı bir kombine parafin-gömme ve cryosection protokolü geliştirildi ve kaliteli doku kesitlerinde elde edilmiştir. Bu protokol parafin gömme tanıtarak yüksek su içeriği ile ilgili sorunu giderir, ve (Şekil 3) kesit sırasında düşük sıcaklık altında parafin sertleştirerek yırtılma etkisini azaltır. Bu nedenle, bu değiştirilmiş protokolünü parafin esaslı sezaryen avantajlıdırning veya bitki dokusu bütünlüğünün korunması için cryosectioning. Bu yazının Hybrid-Cut yöntemi kristalleri (Şekil 3-4) yüksek düzeyde içeren vb aksiller tomurcuk, tohum ve PLB gibi Phalaenopsis orkide birçok dokuda doku bütünlüğünü koruduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, yüksek silis (Şekil 5-6) içeren üreme organları ve pirinç, mısır yaprakları ve buğday gibi hububat bitkileri ile uyumludur. Muhtemelen, bu protokol, yüksek elyaf içeren bitkiler odunsu tatbik edilebilir. Genel olarak, sabitleme doku iyice Hibrid-Cut için çok önemlidir. O formaldehit-alkol-asidik asit (FAA) sabitleştirici PFA gibi eksenel vb tomurcukları, kökler, Ancak, PFA RNA bütünlüğünü koruyarak FAA daha iyi çalışır gibi bazı inatçı dokuların doku bütünlüğünü korumak için daha iyidir bulundu. Bu nedenle PFA düzeltmek için tavsiye edilirin situ hibridizasyon (ISH) çalışma örneği. Burada açıklanan protokol RNA ISH deney için tasarlanmıştır. Bu nedenle, tüm reaktifler DEPC işlenerek RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırarak RNA bozulmasını önlemek için hazırlanmıştır. Hibrid-Cut bölümü anatomik çalışmalar, düzenli ters osmoz (RO) su ve onun türevi tampon veya reaktif kabul edin. en az 3 mm numune boyutu ve kalınlığının azaltılması infiltrasyon için yararlıdır. Ayrıca, dehidratasyon ve infiltrasyon artan daldırma süresi sert doku dokular için gereklidir. Bu protokolün Sınırlaması yetersiz fiksasyon, dehidratasyon ve numunenin sızması kaynaklanan sorunlar nedeniyle olabilir. Bu nedenle, her basamak için işlem süresi ayarı kaliteli parafın bir bloğun üretilmesi için çok önemlidir. Normal olarak, sert doku yumuşak dokuya göre işlem süresi daha uzun gerekmektedir. Ayrıca, Hibrid-Cut kombinasyonu wi başarıyla çalışmış olduğunu gösterdiinci ISH seçilen transkript (Şekil 7) dağılımını sağlamak. Özet olarak, bu protokol, bitki anatomisinin çalışma için yararlıdır ve seçilen gen, bir doku-spesifik RNA haritasını sağlar. Buna ek olarak bu tür terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi, floresan in situ melezleme (FISH) ve immün teknikleri gibi diğer moleküler çalışmalar tatbik edilebilir. Sonuç olarak, bu gelişmiş doku kesit protokolü kullanışlı ve bitki toplulukları araştırmacılar için yararlı hem de.

parafin esaslı kesit Bu metod, anatomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. sağlam doku anatomisine korunması morfolojik ve biyolojik çalışmalar için önemlidir. parafin-gömme hücre ve doku morfolojisi korur çünkü parafine gömülü kesit tekniği avantajlıdır. Buna ek olarak, parafın bloklar uzun süreler boyunca uygun bir şekilde muhafaza edilebilir. Bununla birlikte, parafine gömülü kesit hücre içi kristalleri içeren bitki dokuları için uygun değildir. hücrelerin içinde Kristaller genellikle kesit sırasında parafin kurdeleler ve hasar doku bütünlüğünün gözyaşı. Parafin kesit aksine, krio-bölümleme nispeten hızlı ve bölümler fiksasyon, seri dehidrasyon veya orta infiltrasyon 1 gömmeden elde edilebilir. Donuk kesitler bir çok örneğin immünohistokimya gibi uygulamalar, in-situ hibridizasyon ve enzim histokimya ile uyumludur. cryosectioning diğer avantajıBu yöntem, yüksek sıcaklık ve kimyasal tedaviler olarak potansiyel bir denatürasyon süreçleri yoluyla gitmez o kadar hücresel moleküller de doku kesitlerinde 2 içinde korunur. Cryosectioning genellikle parafin esaslı hayvan dokularında çalışmalar için kesit tercih edilir. sıcaklığı donma bazen bölüm bütünlüğünün kalitesini etkileyen buz kristallerinin oluşumuna yol açar Ancak, krio-bölümleme bitkilerde ilk seçenek değildir. Ozmoregülasyon sükroz çözeltiler, polietilen glikol (PEG), ya da gliserol 3 arasındaki dondurma koşulları altında, kristal buz oluşumunu azaltmak için rapor edilmiştir, ancak bir gelişme uygun daha azdır. Farklı ortamlara uyum, farklı bitkiler genellikle farklı doku doku ve bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller 4,5 oluşturmak üzere gelişmiştir var. Örneğin, çözünmeyen kalsiyum oksalat kristalleri ve silika organları oldukça yaygındırBitkiler 6. Silikat kurum / kristaller bitki mimarisini, dürüstlük korumaya yardımcı ve tahıl bitkileri 7-9 hastalık veya haşere önlemek için rapor edilmiştir. Saksı orkide ve kesme çiçek orkide pazar yayıldığını ve büyüyen bir endüstridir. Phalaenopsis aphrodite (güve orkide) Tayvan en önemli ihracat süs bitkileri biridir. Önemli çabalar Phalaenopsis orkide çiçekli süreçlerinin morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri anlamak için yapılmıştır. Phalaenopsis orkide çiçek sivri yaprak dibinde aksiller tomurcuklarından başlatılır. Serin ortam sıcaklığı bir süre sonra (yaklaşık bir buçuk ay), aksiller tomurcuklar büyütmek, dormansi kırmak ve genç çiçek sivri haline yaprak tabanından çıkıntı. fizyolojik, hücresel ve başak inisiyasyon moleküler süreçleri anlamak için, visua sağlam bir anatomik tekniğini geliştirmeye esastırzamanında Lize doku ya da işaretleri. Ancak, orkide dokularda yerde kristallerin varlığı, özellikle koltuk altı tomurcukları, anatomik çalışma zorlaştırır. Burada şimdiye kadar teknik açıdan zor olarak kabul edilmiştir inatçı bitki dokularının bölüm bütünlüğünü geliştirmek için çalıştı. Burada Hibrid-Cut adlı gelişmiş bir protokol göstermektedir. Bir kriyostat kullanarak gerçekleştirilen bir parafin esaslı kesit bir yöntemdir. Parafin gömme bitki dokusunda yüksek su içeriği giderir. parafin blok düşük sıcaklık altında sertleşir Kesit sorunu yırtılma kristal azaltır ve önemli ölçüde doku bütünlüğünü artırır. Bu protokol ölçüde inatçı bitki örnekleri için doku bütünlüğünü geliştirir.

<table><tbody><tr><td>Embedding Center model EC780-1</td><td>CSA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome model RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat model CM 1950</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Scope A1 microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog medium including vitamins</td><td>Duchefa Biochemia</td><td>M0222.0050</td><td></td></tr><tr><td>RNase free surface decontaminant</td><td>Apex</td><td>10-228</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>Bio Basic Inc.&amp;nbsp;</td><td>D801154</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, crystal (KCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Showa</td><td>19430160</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20)</td><td>J.T. Baker</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100)</td><td>J.T. Baker</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials</td><td>Newastar</td><td>DG60805-00020</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator vacuum</td><td>Violet Bioscience Inc.</td><td>TS-402030</td><td></td></tr><tr><td>Rotary vane pump RZ2.5</td><td>Vacuubrand</td><td>36149406</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>J.T. Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Sub-X&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803670</td><td>Xylene substitute</td></tr><tr><td>Paraplast Plus&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>39602004</td><td>Tissue embedding paraffin</td></tr><tr><td>SUPERFROST micro slide glass</td><td>Matsunami</td><td>S7441</td><td></td></tr><tr><td>FSC 22 Clear&amp;nbsp;</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801480</td><td>Optimal Cutting Temperature compound (OCT)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylenes, Purified</td><td>Leica Surgipath</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Merck</td><td>HX305311</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Micromount</td><td>Leica Surgipath</td><td>3801731</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>pGEM T-easy vector</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP stock solution</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrid-cut: an improved sectioning method for recalcitrant plant tissue samples

Bitki bölüm bütünlüğünü korumak hücre, doku, hatta Organ düzeyde detaylı anatomik yapıları incelemek için esastır. Ancak, bazı bitki hücreleri sert hücre duvarlarını, sert lifler ve kristaller var (kalsiyum oksalat, silika, vb) ve yüksek su içeriği genellikle bitki doku kesit sırasında doku bütünlüğünü bozmaya söyledi. Bu çalışma, basit bir Hibrid-Cut doku kesit yöntemi kurar. Bu protokol, parafin esaslı kesit tekniği değiştirir ve farklı bitki doku kesitleriyle bütünlüğünü arttırır. Bitkisel dokular -16 ° C&#39;de kriyostat içinde kesit önce parafine gömüldü. parafin blokları, azaltılmış yırtılma ve çizilmeye ve önemli ölçüde geliştirilmiş doku bütünlüğü düşük sıcaklık altında sertleştirilmiş Kesit. Bu protokol başarıyla gibi üreme Orga gibi kalsiyum oksalat bakımından zengin Phalaenopsis orkide dokuların yanı sıra inatçı dokulara uygulananNS, pirinç, mısır ve buğday yaprak. Buna ek olarak, hibrid-Cut doku bölümleri yüksek kalitede ilgili genlerin mekansal ekspresyonu sağlamak için in situ hibridizasyon (ISH) ile kombinasyon halinde kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, yüksek bir kristal ya da silika içeriği içeren dirençli bitki dokusu için özellikle yararlıdır. Kaliteli doku bölümleri morfolojik ve diğer biyolojik çalışmalar etkinleştirin.

Hibrid-Cut Doku Bölüm bütünlüğü arttırır üreme çiçek yapısının anatomisini anlamak orkide çiçek inisiyasyon yatan mekanizmayı araştırmak için önemlidir. Ancak, Phalaenopsis orkide hücre içi kalsiyum oksalat kristallerinin birikmesi Bu tür çalışmalar bir zorlu görevi yapar. Kesit süreci (Şekil 1) sırasında kristaller neden yırtılma ile ilgili sorunları aşmak için, biz Hybrid-Cut adında bir sistem geliştirdi. Bu protokol, geleneksel parafin gömme ve cryosection tekniklerini birleştirir. Biz ilk Hibrid-Cut onlar doku sertliği ve yüksek kristal içeriği için namlı çünkü Phalaenopsis orkide koltuk altı tomurcukları test. Aksiller tomurcuk doku% 4 PFA giderilmiştir (Protokolü, adım 1.3). Seri etanol dehidratasyon ve parafin mumu i sonranfiltration, aksiller tomurcuk parafin blok içinde gömülü idi. Blok (Şekil 2A) kesit önce uygun bir boyuta kesilmiş oldu. OCT küçük bir miktar daha sonra kriyostat aşamasında (Şekil 2B) ortasına uygulandı. parafin blok sonra OCT üzerinden sahneye yapıştırılır oldu. Aşama (Şekil 2C) kesit önce OCT tam katılaşma sağlamak için 10 dakika boyunca, bir kriyostat inkübe edildi ve daha sonra cryosection bir -16 gerçekleştirilmiştir ° C bölmesi (Şekil 2B). Bir karşılaştırma olarak, Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok düzenli mikrotom kesit tabi tutuldu. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, parafın şeritler ciddi yırtılma mikrotom kesit sonra gözlenmiştir. Doku bütünlüğü ve hücresel yapısı da (Şekil 1B) tatlıya bağlandı. Hibrid-Cut, diğer taraftan,korunmuş yapısal bütünlüğü (Şekil 3B) üretilen sağlam doku bölümleri (Şekil 3A). Uygulama P. Çeşitli Dokusuna Hybrid-Cut Afrodit Ayrıca, hibrid kesilmiş amenability test etmek için, Orkide orkide farklı dokular test edilmiştir. Çünkü sertleşmiş tohum kat iyi doku bütünlüğü ile tohum bölümleri elde etmek genellikle zordur. Bu protokolü kullanarak, tohumların detaylı yapıları (Şekil 4A) kesit sonra korundu. Şekil 4A, protein organları gösterildiği gibi, ortak depolama ürünleri 14, net bir şekilde tespit edilebilir. Hibrid-kesim de başarılı oldu ve bir aylık protocorm sürgün apikal meristem (bir tohum çimlendirilen yapısı) (Şekil 4B) detaylı yapı gösterdi veprotocorm-like-organları (PLB&#39;ler, Şekil 4C). Hücre içi kristaller, kalın ve etli yaprakları PLB. Phalaenopsis orkide bölümlerinde var gözlendi ve Crassulacean asit metabolizmasını (CAM) tipi fotosentez 15 gerçekleştirin. Yaprak kanadın enine kesitinin ksilemini ve floem (Şekil 4D) ihtiva eden büyük bir mezofil hücreleri, vasküler demetler göstermiştir. Birkaç stoma açıklıklar gündüz (Şekil 4D) içinde eksen dışı yaprak yüzeyinde gözlenmiştir. Aslında, CAM bitkileri karbon kazancı maksimize ama aynı zamanda kurak koşullarda 15,16 altında gece onların stomate&#39;lerin açarak su kaybını en aza indirmek için gelişti. P. kök apikal meristem aphrodıte Şekil 4E&#39;de gösterilmiştir. Kök ucu hücreleri çok iyi (Şekil 4E) kesit sonra korundu kristaller, önemli sayıda içerdiği görüldü. Genç çiçek sivri Boyuna bölümleri informat sağlananGenç çiçek primordials (Şekil 4F) mimarisi hakkında iyon. Ayrıca, çanak yaprakları, yaprakları, labellum ve pollinia açıkça 5 mm çiçek tomurcuğu (Şekil 4G) farklılaşmayı tamamlamış genç çiçek tomurcuklarının uzunlamasına bölümünden tanımlanabilir. Kristaller genç çiçek tomurcukları sepals birikmiş olduğunu fark. Kısacası, bu protokol, doku bütünlüğünü korumak için sürekli çalışıyor ve anatomik ve olası hücresel çalışmalar sağlayan sağlam morfolojisi üretir. Hibrid-Cut Tahıl Bitkileri Doku bütünlüğü korur Biz de Hybrid-Cut yüksek silika içeriği 17,18 ihtiva pirinç, buğday ve mısır gibi tahılların üzerinde test. Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, pirinç, buğday ve mısır yaprakların enine kesitlerin doku bütünlüğü anlamlı Hy edilerek geliştirilmiştirbrid-Cut yöntemi. Su kaybını önlemek için yaprak bıçak haddeleme kontrolün odun dokusu, floem, mezofil hücreleri, Stomate&#39;lerin ve bulliform hücreleri açıkça pirinç yaprak kesimlerinden tespit edilmiştir. Kranz anatomisi, mezofil hücreleri ve mısır yaprağı 19,20 vasküler demetleri açıkça tespit edilmiştir. Mısır yaprakları (Şekil 5) ve adaxial ve eksen dışı tarafı hem de stomate&#39;lerin bir yüksek yoğunluklu bulmak ilginç oldu. Mısırda 0,7 adaxial ve eksen dışı stoma oranı daha önce 21 bildirilmiştir. Buna ek olarak, bu protokol, aynı zamanda, pirinç, buğday ve mısır (Şekil 6) gelen spikelets ayrıntılı hücre morfolojisi sağlamak için başarılı bir şekilde çalışmıştır. Spikelets bol miktarda silis 9 içerdiği bilinmektedir. Normalde, bu doku bölümlendirilmeleri iletken zorlaştırmaktadır. İn Situ Hibridizasyon <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;1&quot;&gt; Genomik ve transkriptomik yaklaşımlar yaygın genlerin fonksiyonlarını açıklamak için kullanılır. Gelişimsel ya da çevresel bağlamlarda daki genlerin kopyalanmasına uzamsal dağılımını sağlayan genlerin muhtemel işlevleri yeni bir bakış açısı eklenmesi önemlidir. In-situ hibridizasyon (ISH) doku seviyesinde 11 gen ekspresyonu lokalize geliştirilmiştir 22-25. Buna ek olarak, ISH hücre sağlar ve bazı durumlarda alt-selüler, çok-hücreli organizmalardan 26 mRNA&#39;nın dağılımının çözünürlüğü. ISH sırasında, RNA ve doku bütünlüğü seçilen transkript hakkında güvenilir uzamsal bilgiyi elde etmek esastır. Hibrid-Kesme protokolü kullanılarak ISH test aktin geni (PATC157348) primerleri 5&#39;-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 &#39;ve 5&#39;-AGGACAGAAGTTCGGCTGGC 3&#39; 242 bp PCR amplikon Siklin B1 için kullanılarak klonlandı.:. 1 (PATC146999) gen spesifik kodlama sekansı kullanılarak primerler 5&#39;-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 &#39;Ve 5&#39;ATGAGCATGGCGCTAATACC-3&#39; 327 bp almak için PCR amplikon. ISH, Aktin ve Siklin B1 sonra: 1 gen ifadesi Genç ve olgun koltuk altı tomurcukları izlendi Güçlü sinyaller 3. aksiller tomurcukları tespit ile (Şekil 7). Her iki gen, 2. ve 3. koltuk altı tomurcuklarının meristematik hücrelerde ifade edildi. Bu sonuçlar Hibrid-Cut iyi anatomi korumak ve mekansal gen ifade desenini sağladığını göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig1.jpg" /> Şekil 1: Geleneksel Parafin Bölüm Doku Şiddetli Yırtılma nedenleri Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok düzenli mikrotom kesit tabi tutuldu.. Parafin şeritler şiddetli yırtılma geleneksel mikrotom kesit sonra gözlenmiştir (A) </strong&gt;. Doku bütünlüğü ve hücresel yapısı da (B) tatlıya bağlandı. oklar doku dilim şiddetli yırtılmasına göstermektedir. Ok başı kristal organları gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54754/54754fig2.jpg" /> Şekil 2:. Hibrit-Cut Kesit Yöntemi Bir aksiller tomurcuk doku PFA giderilmiştir ve dokular parafin mumu ile sızmış, susuz olduğunu ve bir parafin blok içinde gömülü. Parafin blok uygun büyüklükte (A) kesilmiş oldu. Optimum kesme ısısı bileşiği (OCT) kriyostat aşama (B) &#39;nin merkezi uygulandı. parafin blok Kriyostat sahnede OCT bağlanmıştır. Düşük sıcaklık altında, parafin blok<html> OCT (C) ile kriyostat aşamasına yapıştırılmıştır. Doku dilimleri -16 ° C (D) kriyostat odasında kesitler alındı. Ölçek çubukları 0,5 cm (A) ve 1 cm (BD) temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54754/54754fig3.jpg" /> Şekil 3: Hibrid-Cut Bölüm Bütünlüğünü geliştirir Phalaenopsis orkide aksiller tomurcuk içeren bir parafin blok (A) kesit Hybrid-Cut tabi tutuldu ve Hibrid-Cut yöntemi mükemmel doku bütünlüğü (B) bölümleri üretti.. ok aksiller tomurcuk dokusunda gömülü endojen kristal organları gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron.rYer = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54754/54754fig4.jpg" /> Şekil 4:. Hibrid-Cut Phalaenopsis orkide Çeşitli Doku Bölümler Farklı orkide Uygulaması dokularda olgunlaşmış aşamasında (A) protocorm uzunlamasına bölümü (B) protocorm benzeri cisimlerin uzunlamasına bölümü (PLB) (C), enine kesit boyunca orkide tohum uzunlamasına bir kesit olarak, melez kesme yöntemi kullanılarak kesitler alındı yaprak ayası (D), kök (E) uzunlamasına kesit, genç çiçek artış (F) ve genç çiçek tomurcukları (G) uzunlamasına bölümünün uzunlamasına kesitidir. Doku kısımları hematoksilin ile boyandı. SC, tohum kabuğu; PB, protein vücut; E,meristem; MP, anne PLB; DP, kızı PLB; Reklam, adaxial yaprak yüzey; Ab, abaxial yaprak yüzey; St, stoma; MC, mezofil hücre; VB, vasküler demet; RC, kök kap; fb, çiçek tomurcuğu; Se, çanak yaprağı; Pe, petal; La labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, yara dokusu. Ok uçları kristaller göstermektedir. Ölçek çubukları 20 um (AE) ve 200 mikron (FG) temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54754/54754fig5.jpg" /> Şekil 5:. Hibrid-Cut Çeşitli Tahıl Bitkileri Yaprak Doku Bütünlüğünü korur geleneksel parafin yöntemi (sol panel) ve bu çalışmada (sağ panel) geliştirilen Hybrid-Cut tekniği kullanılarak yaprak dokusu karşılaştırılması. Fotoğraflar, pirinç, buğday ve mısır yaprak enine kesiti göstermektedir. MC, mezofil hücre; Ph, floem; St, stoma; M.Ö., bu<html> lliform hücresi. Oklar doku dilim yırtılmasını göstermektedir. Ok uçları silika organları gösterir. mavi kesikli çevreler C4 mısırda Kranz anatomi gösterir. Ölçek 20 mikron barlar. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54754/54754fig6.jpg" /> Şekil 6:. Hibrid-Cut Çeşitli Tahıl Bitkilerinde başakçık Doku Bütünlüğünü korur geleneksel parafin ve Hibrid-Cut yöntemleri arasında başakçık bölümlerin doku bütünlüğü karşılaştırılması. Oklar doku dilim yırtılmasını göstermektedir. Ok uçları silika organları gösterir. Ölçek çubukları 20 mikron (pirinç) ve 200 mikron (buğday ve mısır). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;ent <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54754/54754fig7.jpg" /> Şekil 7: Aktin ve CyclinB1 Yerinde Hibridizasyon; Phalaenopsis orkide 2. aksiller tomurcuk ve 3. aksiller tomurcuk Doku dilimleri Hibrid-Cut yöntem kullanılarak hazırlandı Aksiller Bud 1 İfade Kalıpları.. Aktin ve CyclinB1 40 ng toplam 1; DIG etiketli prob hibridizasyonu kullanılmıştır. sens probu, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Oklar aksiller tomurcuk üreme meristemi göstermektedir. Ölçek 100 mikron barlar. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54754/54754fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples at JoVE.com

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

hybrid-cut-an-improved-sectioning-method-for-recalcitrant-plant

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Görüntüleme.  Academia Sinica. This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Video: Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biyoloji

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of tissue specific expression is limited because of problems in dissecting individual tissues. Expression data needs to be confirmed and complemented with expression patterns using e.g. in situ hybridization, a technique used to localize cell specific mRNA expression. The in situ hybridization method is laborious, time-consuming and often requires extensive optimization depending on species and tissue. In situ experiments are relatively more difficult to perform in woody species such as the conifer Norway spruce (Picea abies). Here we present a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including P. abies. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, we could use the protocol to study tissue specific expression of homologous genes in male reproductive organs of one gymnosperm and two angiosperm species; P. abies, Arabidopsis thaliana and Brassica napus. The protocol worked equally well for the species and genes studied. AtAP3 and BnAP3 were observed in second and third whorl floral organs in A. thaliana and B. napus and DAL13 in microsporophylls of male cones from P. abies. For P. abies the proteinase K concentration, used to permeablize the tissues, had to be increased to 3 g/ml instead of 1 g/ml, possibly due to more compact tissues and higher levels of phenolics and polysaccharides. For all species the RNase treatment was removed due to reduced signal strength without a corresponding increase in specificity. By comparing tissue specific expression patterns of homologous genes from both flowering plants and a coniferous tree we demonstrate that the DIG in situ protocol presented here, with only minute adjustments, can be applied to a wide range of plant species. Hence, the protocol avoids both extensive species specific optimization and the laborious use of radioactively labeled probes in favor of DIG labeled probes. We have chosen to illustrate the technically demanding steps of the protocol in our film.
Anna Karlgren and Jenny Carlsson contributed equally to this study.
Corresponding authors: Anna Karlgren at Anna.Karlgren@ebc.uu.se and Jens F. Sundstr&#246;m at Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

We describe a modified DIG in situ hybridization protocol, which is fast and applicable on a wide range of plant species including Norway spruce. With just a few adjustments, including altered RNase treatment and proteinase K concentration, the protocol may be used in studies of different tissues and species.

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

The high-throughput expression analysis technologies available today give scientists an overflow of expression profiles but their resolution in terms of ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a combination of light and electron microscopy. Samples embedded in resin are sectioned into arrays consisting of ribbons of hundreds of ultrathin sections and deposited on pieces of silicon wafer or conductively coated coverslips. Arrays are imaged at low resolution using a digital consumer like smartphone camera or light microscope (LM) for a rapid large area overview, or a wide field fluorescence microscope (fluorescence light microscopy (FLM)) after labeling with fluorophores. After post-staining with heavy metals, arrays are imaged in a scanning electron microscope (SEM). Selection of targets is possible from 3D reconstructions generated by FLM or from 3D reconstructions made from the SEM image stacks at intermediate resolution if no fluorescent markers are available. For ultrastructural analysis, selected targets are finally recorded in the SEM at high-resolution (a few nanometer image pixels). A ribbon-handling tool that can be retrofitted to any ultramicrotome is demonstrated. It helps with array production and substrate removal from the sectioning knife boat. A software platform that allows automated imaging of arrays in the SEM is discussed. Compared to other methods generating large volume EM data, such as serial block-face SEM (SBF-SEM) or focused ion beam SEM (FIB-SEM), this approach has two major advantages: (1) The resin-embedded sample is conserved, albeit in a sliced-up version. It can be stained in different ways and imaged with different resolutions. (2) As the sections can be post-stained, it is not necessary to use samples strongly block-stained with heavy metals to introduce contrast for SEM imaging or render the tissue blocks conductive. This makes the method applicable to a wide variety of materials and biological questions. Particularly prefixed materials e.g., from biopsy banks and pathology labs, can directly be embedded and reconstructed in 3D.

This protocol targets specific cells in tissue for imaging at nanoscale resolution using a scanning electron microscope (SEM). Large numbers of serial sections from resin-embedded biological material are first imaged in a light microscope to identify the target and then in a hierarchical manner in the SEM.

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Nörobilim

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

Kesme ve kesit için doku parafin gömülü için yüzen yöntemi

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Tıp

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

A Simple Dry Sectioning Method for Obtaining Whole-Seed-Sized Resin Section and Its Applications

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are significantly different among different regions of seed. In order to view the morphologies of cells, starch granules and protein bodies clearly, and quantitatively analyze their morphology parameters accurately, the whole-seed-sized section is needed. Though the whole-seed-sized paraffin section can investigate the accumulation of storage materials in seeds, it is very difficult to quantitatively analyze the morphology parameters of cells and storage materials due to the low resolution of the thick section. The thin resin section has high resolution, but the routine resin sectioning method is not suitable to prepare the whole-seed-sized section of mature seeds with a large volume and high starch content. In this study, we present a simple dry sectioning method for preparing the whole-seed-sized resin section. The technique can prepare the cross and longitudinal whole-seed-sized sections of developing, mature, germinated, and cooked seeds embedded in LR White resin, even for large seeds with high starch content. The whole-seed-sized section can be stained with fluorescent brightener 28, iodine, and Coomassie brilliant blue R250 to specifically exhibit the morphology of cells, starch granules, and protein bodies clearly, respectively. The image obtained can also be analyzed quantitatively to show the morphology parameters of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of seed.

This technique allows for the fast and simple preparation of whole-seed-sized resin section for the observation and analysis of cells, starch granules, and protein bodies in different regions of the seed.

Tam Tohum Lu Reişin Elde Edilmesinde Basit Bir Kuru Kesit Yöntemi ve Uygulamaları

The morphology, size and quantity of cells, starch granules&#160;and protein bodies in seed determine the weight and quality of seed. They are ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

Mikoheterotrofik Bitki Dokularında Mantar Kolonizasyonunu Yorumlamak ve Tohumların Simbiyotik Çimlenmesi için Mikroskopi Teknikleri

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...