The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1. Kimyasallar <ol><li> 500 mM NaH 2 PO 4 · asitleştirildi içinde H2O (137,99 g / Mol) (pH 500 mM CEPA (144.49 gr / mol) ihtiva eden bir çözelti, ve her ikisi de, 500 mM NaCI (58.44 g / mol) &#39;den oluşan bir çözelti hazırlamak 2.5) ultra saf su ve 0.1 N HCI. çözümler açıktır kadar vorteks ile karıştırın. </li><li> Seri olarak 5 mM ve 50 mM stok elde etmek için aynı çözücü (10 x) 500 mM seyreltik çözeltiler. </li><li> Ultra saf su içinde 1-aminosiklopropan karboksilik asit (101.1 g / mol ACC) içindeki bir 10 mM çözelti hazırlayın. </li><li> -Filtre sterilize -20 ° C&#39;de stok çözümleri ve mağaza alikotları. </li><li> Filtre sterilize selülaz. 4 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol> 2-chloroethylphosphonic acid Ayrışma 2. doğrulanıyor Etilen Üretimi: Üçlü Tepki Testi <ol><li> Buhar fazlı Yöntemiyle Ekotip Columbia tohumları thaliana Arabidopsis Yüzey sterilize: DİKKAT: Aşağıdaki adımı t üretiroksik klor gazı. Davlumbaz tohum sterilizasyon kuralları. <ol><li> Tohum sterilizasyon için 250 ml cam beher karşılamak ve davlumbaz yerleştirmek yeterince derin bir yapışmalı kabı alın. </li><li> A. ekle thaliana bir mikrosantrifüj tüp tohum ve rafa tüp yerleştirin. yapışmalı kabın içine açık tüp içeren raf yerleştirin. Not: klor gazı daha düşük tohum nüfuz sağlamak için yarısı dolu üzerinde bireysel tüpleri doldurmak etmeyin. </li><li> sızdırmaz kapta ticari ağartıcı, 100 ml içeren 250 ml&#39;lik bir beher yerleştirin. Dikkatle ağartıcıya konsantre HCI 3 ml ilave edilir ve derhal kapaklı konteyner mühür. DİKKAT: Ağartıcı ve HCl tohumları, yüzey sterilize edilmesi işlevini görürler toksik klorin gazı üretmek için reaksiyona girer. </li><li> fumehood 4 saat boyunca klor gazı varlığında tohumları inkübe edin. Not: Daha uzun sterilizasyon süreleri çimlenme etkinliğini azaltacaktır. </li><li> Sterilizasyon sonrasında, c izinhlorine gaz daha sonra en az 1 saat süre ile duman davlumbazında havalandırma mikrosantrifüj tüpü mühür. atılmadan önce en az 24 saat boyunca fumehood çamaşır suyu ve HCl karışımı bırakın. Not: Sterilize edilmiş tohumlara, acil kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C &#39;de tohum tutun. yoğunlaşmayı önlemek için ependorf tüp açmadan önce oda sıcaklığına kadar tohum getirin. karanlıkta saklayın tohumları. </li></ol></li><li> 4-sektör Petri Yemekleri (90 x 15 mm) Agar Plakaları hazırlayın: <ol><li> A. büyüme ortamı 110 ml hazırlanması thaliana fidanları: 1 x Murashige ve% 1 ihtiva eden Skoog (MS) bazal ortam 15 (4.33 gr / lt) (ağ / hac) sakroz ve% 0.8 (ağ / hac) ağar. NaOH ile pH 6&#39;ya MS ortamı ayarlayın. </li><li> CEPA&#39;nın ayrışma bakteriyel büyüme ortamı 100 ml hazırlayın: Schramm ve Hestrin 16% 1.5 ihtiva eden (SH) ortamı (ağırlık / hacim) ağar. NaOH ile pH 7&#39;ye SH ortamı ayarlayın. </li><li> otoklav ve tempe tarafından medya sterilize55 ° C su banyosu içinde R. </li><li> MS agar katkılı sonra, steril bir şişeye 40 mi ekleyin. A. pozitif kontrol büyüme ortamı hazırlamak için thaliana fideler, 10 uM ACC bir son konsantrasyon elde etmek üzere, 10 mM ACC 40 ul MS agar 40 ml kısım tamamlar. </li><li> Sektörlü Petri kapları (Şekil 1), uygun kadran ortamın 5 ml ilave edilir ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. üç nüsha olarak tüm tabak hazırlayın. Not: CEPA sonra protokolde kadar büyüme ortamına ilave edilmez. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Şekil 1:. CEPA üçlü müdahale analizi için kullanılan agar plakaları Kur şematik (negatif kontrol (A), pozitif kontrol (B) belirli bir kadran ve deney plakaları görüntülemektedirC). Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="3"><li> Tabakalandırmak A. thaliana Tohumlar Senkron Çimlenme sağlamak için: <ol><li> Yaklaşık elli A. ekle MS veya MS + ACC agar içeren her kadranda üzerine thaliana tohumları. Emin olun tohumlar eşit fide çıkarılmasını ve analizi kolaylaştırmak için dağıtılır. </li><li> Plakalar 4 ° C&#39;de karanlıkta tohumlarının inkübe 3-4 gün ° C. </li></ol></li><li> Üçlü Tepki Testi Bakteriyel Büyüme Medium üzerinde CEPA (SH) ayrıştırmak ve uygulayın: <ol><li> tabakalaşma sonra, 2 saat boyunca floresan ışık tohumları maruz. </li><li> SH agar içeren deney levhaları çeyrek üzerine 500 mM İEKB stok çözeltisinin 10 ul yay (pH 7, Şekil 1) bir son konsantrasyon elde etmek için CEPA&#39;nın1 mM. </li><li> laboratuvar film ile plakaları mühür ve tohum için karanlık bir ortam yaratmak için folyo ile kaplayın. </li><li> Aşağı agar yüzü 3 gün boyunca 23 ° C&#39;de karanlıkta plakaları inkübe edilerek de tohumlar çimlenmeye. Not: Tabaklar yığılmış olabilir, ancak etilen havadan daha hafif olduğu için negatif kontroller altına konulmalıdır. </li></ol></li><li> Üçlü Tepki Testi Verileri Analiz: <ol><li> Alev sterilize forseps ile, bir diseksiyon veya dijital USB mikroskop altında her tedavi ve görünümüne tekabül eden bir plakadan tek fidan kaldırın. fide alt hizalanmış ve fotoğrafı emin olun. </li><li> Her kadranda 30 fideleri (biyolojik çoğaltmak başına 60 fide ve tedavi başına 180 fidan) çıkarın. bir cetvel ile siyah bir arka plan ve fotoğraf ile bir yüzey üzerinde aynı hizaya getirin. </li><li> ImageJ yazılımı 17 kullanarak çoğaltmak fidelerin hipokotil uzunluğu (mm) ölçün. tıklayıp * düz sürükleyerek ölçeği ayarlama *aracı 10 mm uzunluğunda seçin. &quot;Analiz&quot; sekmesi altında &quot;Set Ölçeği&quot; i seçin ve * Parçalı aracını kullanarak 10&#39;a bilinen mesafeyi ayarlamak, tıklayın ve sürükleyin mesafeyi ölçmek için hipokotil ve basın M uzunluğunu seçmek için kullanılır. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA kullanılarak biyolojik çoğaltır araçlarını karşılaştır. Farklılıklar &lt;0.05 anlamlı eğer p olarak kabul edilir. </li></ol></li></ol> Bakteriyel Büyüme boyunca pH 3. Analiz <ol><li> Üç nüsha olarak xylinus Starter Kültürler büyümek ve Ölçmek Komagataeibacter: <ol><li> K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de kültürler inkübe edin. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). 5 ml steril% 0.85 ile NAC (w / v)l Çözelti hücreler iki kez yıkama ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek. </li></ol></li><li> pH Analiz için Kültürleri aşılamak: <ol><li> folyo kapak ile on iki adet 500 ml&#39;lik şişelere% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH suyu (pH 7), 150 ml ilave edilir. K. ile şişeler aşılamak 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda xylinus başlangıç kültürleri. Üç starter kültür kullanılarak, tedavi başına üç biyolojik çoğaltır hazırlamak. </li><li> 5, 50 veya 500 mM İEKB stok çözeltileri 300 ul Ek kültürleri, sırasıyla, 1.0 mM, 0.01, 0.1 nihai CEPA konsantrasyonlar elde, ve. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 300 ul muamele edilmemiş kontrol kültürleri Supplement. </li><li> sıkı şişelere folyo kapak bantlayarak şişeler kapatılır ve 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de 14 gün boyunca kültür inkübe edin. </li></ol></li><li> Her gün, aseptically (10 dakika;, 4 ° C 2,000 x g) santrifüj ile, her şişe ve topak hücrelerinden 5 mi örnek alabilir. temiz bir tüpe süpernatantlar aktarın ve bir pH ölçer kullanılarak her bir biyolojik tekrarında pH&#39;ı ölçülür. </li><li> biyolojik çoğaltır ortalama pH değeri grafik ile zaman ders verileri analiz edin. Not: kültür pH 3.5&#39;in altında düşmemesine önemlidir; 5 bir kültür pH değerinin önemli ölçüde CEPA etilen salınımını azaltan ve 3.5&#39;in altında bir pH değeri, tamamen etilen salınımını inhibe eder. </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li></ol> 4. Koloni Morfolojisi <ol><li> K. büyümek üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri: <ol><li> K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. doğmuş iyileşmesini0.4, 0.3 OD 600 kadar, 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de te kültürleri (yaklaşık 72 saat) ulaşılır. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml hücre, yıkama ve daha sonra hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> % 1.5 SH 25 ml içeren 24 agar plakaları (pH 7) orta hazırlayın (a / h) agar. </li><li> Agar katılaşmış sonra, sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 50 ul ve agar üzerinde, 500 mM CEPA stok solüsyonları yayıldı. herhangi bir değişiklik meydana ve çözücünün 50 ul yayılan ayarlama muamele edilmemiş ve çözücü kontrol plakaları, test bileşiklerini çözmek için kullanılan. </li><li> K. bir döngü dolu (~ 5 ul) ile izole edilmiş koloniler için şerit tabakalar xylinus starter kültür ve parafin film ile onları mühür. üç nüsha olarak tüm plakaları aşılamak. 30 ° C&#39;de beş gün süreyle inkübe edin. </li><li> fotniteliksel bir dijital USB mikroskop kullanarak ve 20X büyütmede ograph koloniler katı ortam üzerinde koloni morfolojisi ve selüloz üretimi değerlendirmek. Not: Selüloz koloni kenarı boyunca puslu bir madde olarak görünür. </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li></ol> 5. zar Tahliller <ol><li> Büyümek ve Ölçmek K. üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri: <ol><li> Üç nüsha olarak, K. tek bir koloni aşılamak xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm&#39;de çalkalanarak 30 ° C&#39;de kültürler inkübe edin. </li><li> santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml, t yıkamao hücreler iki kez ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun. </li><li> Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek. </li></ol></li><li> 24 oyuklu plakaların aşılanması için ana karışımlarını hazırlamak: <ol><li> sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 120 ul ve 500 mM İEHB stokları SH ortamı 60 ml (pH 7) Supplement. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 120 ul SH ortamı (pH 7) arasında bir 60 ml Supplement. Vortex karıştırın. </li><li> dört adet 14 ml&#39;lik miktarlar halinde İEHB içeren bir maddenin her birinden 60 ml bölün. 10 5 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda başlatıcı kültür biyolojik çoğaltır 14 ml alikotlar üç inoküle. selüloz üretimi önlemek için buz üzerinde hücreleri ile tüpler tutun. Not: Geri kalan 14 ml bir örnek steril kontrol kuyuları için kullanılacaktır. </li></ol></li><li> 24 oyuklu plakaların aşılanması: <ol><li> Üç biyolojik çoğaltır satır ve kendi plaka her tedaviyi testSteril kontrollerin bir satır (Şekil 2). </li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Şekil 2:. Zar tahlilinde ve analiz Hazır İEHB-desteklenmiş, pH 7 SH ortamı (60 mi) için kullanılan protokol gösteren bir akış şemasıdır, üç ayrı biyolojik suret aşılamalar ve steril bir kontrol (14 mL) ekstrakte edildi için örnek olarak alındı. Bu kültürler daha sonra bir 24 yuvalı plaka içine altı teknik çoğaltır (2 mi) içine bölüştürülmüştür ve parafın bir film ile kaplanmıştır. 30 ° C&#39;de 7 gün beklettikten sonra, zarlarına hasat edilir ve FT-IR ile ıslak ağırlık, kalınlık, kuru ağırlığı, ve kristal belirlenmesi ile karakterize. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 14 ml ana karışımı kullanarak, EAC içine 2 ml ekleyinsteril 24 oyuklu plaka altı kuyu H. Üç biyolojik çoğaltır ve steril kontrol (Şekil 2) için tamamlayın. Her tedavi için tekrarlayın. </li><li> parafın film kapatma plakaları ve 30 ° C &#39;de 7 gün süre ile, statik inkübe edin. </li></ol><ol start="4"><li> Hasat ve Tedbir pelikül Islak Ağırlığı, Kalınlığı, kuru Ağırlık (Selüloz Verim) ve kristal yapıdaki (Şekil 2): <ol><li> Rakip zar kenarı yükseltmek ve forseps ile bireysel zarlarına kaldırmak için ince tabakanın bir tarafını basınız. kavrama koruyarak, kendi ıslak ağırlıkları belirlemek için tartım önce aşırı orta kaldırmak için 3 sn taze kağıt havlu üzerine koyun. </li><li> yüksek çözünürlüklü bir dijital kamerayı kullanarak taraftan bir cetvel ve fotoğraf bitişik zarlarına hizalayın. </li><li> ImageJ yazılımı kullanma 17, sol omuz, sağ omuz ve her ince tabakanın ortasına pelikül kalınlığını ölçmek. Her biyolojik RepliCat için tüm teknik çoğaltır ortalamae. </li><li> Ayrı ayrı 6-çukurlu bir plaka gözlerine zarlarına transfer. 20 dakika hücreleri lize etmek için, 80 ° C de, 0.1 N NaOH 12 ml zarlarına tedavi edin. </li><li> NaOH çıkarın ve ajitasyon ile 24 saat boyunca ultra saf su ile yıkanarak zarlarına nötralize eder. suya her 6 saat değiştirin. Not: ince zarlar yıkama aşamasının tamamlanması üzerine beyaz olmalıdır. </li><li> Talep silikon tabakaları üzerindeki ince zarlar ve sabit bir ağırlığa kadar 48 saat boyunca 50 ° C&#39;de kurutulur. Kuru kez, bakteriyel selüloz verimi belirlemek için analitik bir ölçekte pelikül ağırlıkları paspaslar kaldırmak ve ölçün. </li><li> 4.000 650 cm aralığında kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) 32 taramaları kullanılarak ve 4 sm bir çözünürlük -1 Fourier dönüşümü kullanılarak ince tabaka kristal analiz -1. A 1437 / A 895 kullanarak, kristallik endeksi, CI (IR) hesaplayın; &quot;kristal bant&quot; ve &quot;amorf band&quot; absorbansı oranı daha önce 18 nitelendirdi. </li></ol&gt; </li><li> , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm&#39;dir. </li><li> Zar Verileri Analiz: <ol><li> zar ıslak ağırlığı ve kuru ağırlığı arasındaki farkı belirleyerek pelikül hidrasyon hesaplayın. </li><li> İstatistiksel analiz için her bir biyolojik çoğaltmak için tek bir değer elde etmek için tüm teknik çoğaltır değerlerinin ortalamasını alın. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA ile tedavi karşılaştır. Farklılıklar p eğer &lt;0.05 anlamlı bulunmaktadır. </li><li> Tedavi edilmeyen kontrollerin yüzdesi olarak veri normalleştirmek ve biyolojik çoğaltır araçları arsa. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guzmán, P., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+triple+response+of+Arabidopsis+to+identify+ethylene-related+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants.</a> Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).</li>
<li>Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+research+on+the+plant+hormone+ethylene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">History of research on the plant hormone ethylene.</a> J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).</li>
<li>Schaller, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+and+the+regulation+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethylene and the regulation of plant development.</a> BMC Biol. 10 (1), (2012).</li>
<li>Hua, J., Sakai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EIN4+and+ERS2+are+members+of+the+putative+ethylene+receptor+gene+family+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).</li>
<li>Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insensitivity+to+ethylene+conferred+by+a+dominant+Mutation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana.</a> Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).</li>
<li>Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tomato+gene+for+the+ethylene-forming+enzyme+by+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).</li>
<li>Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ethylene+removal+with+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Mater%22%5BJournal%5D)">Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains.</a> J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).</li>
<li>Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+chemotaxis+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+other+Pseudomonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Environ%22%5BJournal%5D)">Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species.</a> Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).</li>
<li>Augimeri, R. V., Strap, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytohormone+ethylene+enhances+bacterial+cellulose+production%2C+regulates+CRP%2FFNRKx+transcription+and+causes+differential+gene+expression+within+the+cellulose+synthesis+operon+of+Komagataeibacter+%28Gluconacetobacter%29+xylinus+ATCC+53582%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582.</a> Front. Microbiol. 6, 1459(2015).</li>
<li>Zhang, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+ethylene+gas+and+comparison+of+ethylene+responses+induced+by+ethylene%2C+ACC%2C+and+ethephon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon.</a> Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+preparation+and+its+application+to+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal.+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethylene preparation and its application to physiological experiments.</a> Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).</li>
<li>Warner, H. L., Leopold, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+evolution+from+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).</li>
<li>Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution.</a> Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).</li>
<li>Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+water+vapor+pressure+on+the+thermal+decomposition+of+2-chloroethylphosphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid.</a> Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Schramm, M., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+production+of+cellulose+at+the+air%2Fliquid+interface+of+a+culture+of+Acetobacter+xylinum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum.</a> J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+cellulose-structure+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cellul.+Chem.+Technol%22%5BJournal%5D)">Amorphous cellulose-structure and characterization.</a> Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada tarif edilen yöntemler modeli organizma, K. kullanılarak bakteriyel etilen tepkisinin incelenmesi için CEPA etilenin in situ üretimini anahat xylinus. Etilen bir pH&#39;a CEPA saf etilen gazı veya özel laboratuar ekipmanı ihtiyacını ortadan sahip daha büyük 3.5 10,11 sahip herhangi bir sulu ortam ilave üretilebilir Bu yöntem çok yararlıdır. Bu yöntem, bakterilerin Cepa türetilmiş Etilenin etkilerini incelemek ile sınırlı değildir, aynı zamanda ökaryotik organizmalarda etilen tepkisini incelemek için uyarlanabilir edilebilir. Bileşikler, aynı zamanda in situ CEPA&#39;nın ayrışma üretilmektedir, paralel kontrol deneyleri fosfat ve klorid ile yapılması önemlidir. Başka gerekli kontrol CEPA kendisi soruşturması kapsamında mikrobiyal kültürler üzerinde doğrudan etki gösterir olup olmadığını belirlemektir. Fizyolojik olarak alakasız etilen konsantrasyonu K. üretildi xylinus kültürleri bizpH 5 SH ortamı içinde yetiştirilen ve İEHB etkileri 9 için bir kontrol olarak hizmet nedenle yeniden; Ancak, bu yaklaşım sadece asit toleranslı organizmalar için çalışıyor. sulu bir büyüme ortamında biyolojik çalışmalar için İEHB türetilmiş etilen kullanımı etilen gerçekten de sistem içinde üretilen olduğu doğrulama gerektirir. Burada tarif edilen yöntem A kullanır etilen 1 varlığında karanlıkta yetişen fidan tarafından sergilenen üçlü cevap fenotip patlatır thaliana üçlü cevap tahlil. dört parçaya ayrılır Petri kapları fideler ayrı MS ortamında büyütüldü, ancak ilgili mikrobiyal büyüme ortamına bitişik izin verir. mikrobiyal büyüme ortamına İEKB çözeltisinin uygulanması, etilen üretimini kolaylaştırır ve tepe boşluğu infiltratlar olarak bir etilen eksojen kaynağına bitişik fide ortaya çıkarır. endojen ürünü geliştirir olarak ACC ile MS ortamı tamamlayan bir pozitif kontrol sağlarA. Etilen iyon thaliana ve üçlü cevap fenotip sonraki indüksiyon. Mikrobiyal büyüme ortamı 13,14 CEPA gelen etilen üretimi sırasında Kültür pH önemli bir husustur. Tipik olarak, kültür K. kullanılan SH ortamı xylinus esas İEHB türetilmiş etilen (Augimeri ve kayış, yayınlanmamış veriler) üretimini azaltır, yaklaşık 5 arasında bir pH değerine sahiptir; Bu nedenle, orta pH 7&#39;ye 9&#39;a ayarlandı. Bu büyük ölçüde pH 7 13 de artar ise İEKB arıza oranı, ya da pH 5&#39;in altında son derece yavaş olduğunu gösterdi, diğer çalışmalarla tutarlıdır. sağlamak için elzemdir test organizmasının bir büyüme ortamı, pH 5 K. üzerinde kalmasını xylinus kültürleri etilen 9 çıkışına olanak verilerek, yaklaşık 5.5 minimum pH ulaşmıştır. Etilen saf derişimi, bu kültür c kontrol edilemez olduğunu not etmek önemlidirşartlarından. K. büyümesi, selüloz, ve zar özelliklerini Cepa türetilmiş etilen etkisi xylinus bakteriyel Etilen tepkileri cepa kullanılarak incelenebilir ki göstermek için kullanılmıştır. diğer organizmalar etilen tepkisini incelemek için bu yöntemleri uyarlanması büyüme ortamı değişiyor ve fenotip analizi gibi basit. CEPA kullanımı etilen gazı için uygun bir yerine araştırmacılara sağlar ve bakterilerin daha fazla etilen-aracılı çalışmaları teşvik edebilir.

Olefin (C2 lH 4) havagazı lambaları kullanılan bir laboratuarda yetiştirilir bezelye fide, (hipokotiller) daha kısa olduğu gövde olan bir anormal morfoloji sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir, birinci 1901, bir bitki hormonu olarak tespit edilmiştir, daha kalın ve normal bezelye fide ile karşılaştırıldığında yan bükülmüş; Bir fenotip sonra üçlü cevap 1,2 olarak nitelendirdi. Daha sonraki çalışmalar, etilen gibi büyüme, stres yanıtı, meyve olgunlaşma ve yaşlanma 3. Arabidopsis thaliana, bitki biyolojisi araştırma için bir model organizma olarak çok sayıda gelişimsel süreçleri düzenleyen önemli bir fitohormondur, iyi etilen verdiği yanıtta açısından incelenmiştir olduğunu göstermiştir. Çeşitli etilen tepki mutantlar koyu yetişkin A&#39;da görülen üçlü cevap fenotip istismar ederek izole edilmiştir etilen 1,4,5 mevcudiyetinde thaliana fideleri. bitkilerdeki etilen üretimi için biyosentetik ön-madde 1-a,minocyclopropane karboksilik asit (ACC) 6 ve yaygın olarak üç karşılık fenotipi 1,4,5 neden endojen, etilen üretimini geliştirmek için üçlü cevap deneyi sırasında kullanılır. Etilen yanıtı yaygın bitkilerde çalışılan olmasına rağmen, bakteriler üzerinde eksojen etilen etkisi büyük ölçüde bitkiler ile bakterilerin yakın ilişki rağmen understudied edilir. Bir çalışmada, belirli Pseudomonas suşları karbon ve enerji 7&#39;nin tek kaynağı olarak etilen kullanarak hayatta olduğunu bildirdi. Ancak, yalnızca iki çalışma bakteri etilen yanıt göstermiştir. İlk çalışma göstermiştir ki Pseudomonas aeruginosa, P. suşları fluorescens, P. putida ve P. syringae eriyik agaroz, saf etilen gazı 8 ile dengelenmiş bir kemotaksis tampon maddesi ile karıştırıldı olan bir agaroz tıkayıcı deneyi kullanılarak, etilen bakımından kemotaktik edildi. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir Furth olmuşturSaf etilen gazı kullanılarak er raporları nedeniyle özel ekipman olmadan laboratuvarda gazların sevkinde güçlüğüne muhtemel bakteriyel etilen tepkisini, karakterize etmek. Bakteriyel etilen tepkisinin ikinci rapor etilen 9 xylinus meyve ilişkili bakteri Komagataeibacter (eski Gluconacetobacter) bakteriyel selüloz üretimi ve etkisinde gen ifadesini arttığını gösterdi. Bu durumda, etilen-salan bileşik, 2-chloroethylphosphonic asit (İEKB) saf etilen gazı ve özel ekipman ihtiyaç kalmaz, bakteriyel büyüme ortamında in situ etilen meydana getirmek üzere kullanıldı. - 14, bir baz katalizörlü, birinci dereceden reaksiyon 12 boyunca pH 3.5 10,11 Yukarıdaki: 1 molar oranında İEHB 1 etilen üretir. CEPA bozunması pozitif Etil pH ve sıcaklık 13,14 ve sonuçlar ile ilişkilidiren, klorür ve fosfat. CEPA gaz etilen için uygun bir alternatif etilen bakteriyel yanıtları okuyan ilgilenen araştırmacılar sağlar. Aşağıdaki protokoller genel amacı bakteriyel etilen tepkisini incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktır ve bakteriyel büyüme ortamında CEPA&#39;nın ayrışma etilen üretiminin fizyolojik olarak uygun seviyelerinin doğrulaması içerir, kültür pH analizi CEPA ayrışma sırasında zarar görmemesini sağlamak için bakteri üremesi ve bakteriyel morfoloji ve fenotip üzerindeki etilen etkisi değerlendirilmesi. Biz K. kullanarak bu protokolleri göstermek xylinus, bununla birlikte, bu protokoller uygun büyüme ortamı kullanılarak ve fenotip analizi diğer bakterilerde etilen tepkisini incelemek için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Üçlü cevap testi ile SH ortamında CEPA etilen kurtuluş (pH 7) doğrulanması için bir şematik plaka kurulum Şekil 1A gösterilmiştir - C. Zar protokolünü gösteren bir akış şeması Şekil 2&#39;de Koyu-yetişkin A. gösterilir thaliana fideler ACC mevcudiyetinde ve SH ortamı Cepa ayrışma yoluyla üretilen etilen (pH 7) varlığında üçlü cevap fenotipi (abartılı apikal kancalı daha kısa ve daha kalın hipokotil) sergiler, fakat tedavi edilmemiş koşullarda (Şekil 3A) 9. ACC- ve İEHB türetilmiş etilen tedavi A. hipokotil uzunluğu thaliana tohumları anlamlı idi (p &lt;0.0001) bir fizyolojik ilgili konsantrasyonları da SH ortamı (pH 7) üzerinde CEPA serbest bırakıldı işlenmemiş kontrollerle (Şekil 3B) 9, bu etilen doğrulayan daha kısayon. Muamele edilmemiş ve İEHB tedavi edilen K. pH xylinus kültürleri 5&#39;in üzerinde (Şekil 4) 9 kalmıştır; Bu nedenle, etilen olarak CEPA&#39;nın bozunma bakteriyel bir organik asit üretimi azaltılmaz. CEPA türetilmiş etilen zaman K. bakteriyel selüloz üretimi arttı xylinus Katı SH ortamı üzerinde büyütülmüştür (pH 7) (Şekil 5) 9. İEHB türetilmiş etilen tüm konsantrasyonlar önemli ölçüde ince tabaka kalınlığı (Şekil 6B) ve önemli ölçüde artmış pelikül, kuru ağırlık etkilemedi, pelikül, ıslak ağırlık (Şekil 6A) azalmıştır (selüloz verim; Şekil 6C) 9. Ince tabaka kalınlığı ölçümü için alınan temsili bir verilmedi Şekil 7&#39;de gösterilmiştir. Ince tabaka hidrasyon CEPA türetilmiş etilen (Şekil 8A) 9 her konsantrasyonları ile indirgenmiştir, İEKB türetilen tüm konsantrasyonlar etilen 9 PEL artarkenlicle kristallikte (Şekil 8B). NaCI ve NaH 2 PO 4 etkileri gözlenen fenotipleri CEPA türetilmiş etilen neden olduğunu teyit (veriler gösterilmemiştir) tüm durumlarda önemsizdi. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig3.jpg" /> Şekil 3: CEPA etilen üretmek için SH ortamı (pH 7) üzerinde ayrışır Dijital USB mikroskop fotoğrafları gösteriyor ki koyu yetişkin A.. thaliana fideler üçlü cevap fenotip göstermeyen (daha kısa hipokotil, kalın hipokotil ve apikal kanca abartılı) muamele edilmemiş (A) kontrolü ile karşılaştırıldığında ACC ve İEHB türetilmiş etilen yanında çoğaldığı takdirde. ACC ve İEHB türetilmiş etilen mevcudiyetinde büyütülen fidelerin hipokotil uzunluğu significantl edildimuamele edilmemiş kontrol (B) daha kısa Y. Ölçek çubuğu = 1 mm. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Farklı harflerle Barlar anlamlı farklılık bulundu (p &lt;0.0001) bulunmaktadır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig4.jpg" /> Şekil 4: K. pH xylinus kültürler SH ortamı içinde CEPA&#39;nın ayrışma (pH 7). Kültür pH değeri, bakteriyel büyüme döngüsü boyunca etilen olarak CEPA etkin ayrışma sağlayan, 5 üzerinde kalır için yeterince yüksek olarak kalır. K. pH xylinus kültürleri salgıladıkları olarak izlenmekte ve organik asitler resorbe gerekir. efsane test CEPA konsantrasyonlarını göstermektedir. Y-ekseni başlar NotpH 5. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig5.jpg" /> Şekil 5: CEPA türetilmiş etilen K. tarafından selüloz üretimini artırdı katı ortam üzerinde xylinus. K. ya İEHB (F - H - xylinus (A) muamele edilmemiş ya da edildi SH agar plakaları (pH 7) üzerinde büyütülmüştür asitleştirildi (pH 2.5), ultra-saf su (B), fosfat ve klorür (E, C) ile ön-muamele edilmiş ). Temsili koloniler gösterilir. K. tarafından üretilen ok gösterileri selüloz xylinus, koloni çevresinde puslu madde olarak görülüyor. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakam haAugimeri ve Askı 9&#39;dan değiştirildi s. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig6.jpg" /> Şekil 6: CEPA türetilmiş etilen su tutma kapasitesini azaltır ve K. verim artar ince zarlar toplanır ve analiz edilmeden önce xylinus selüloz ince zarlar. Kültürler, 24 yuvalı plakalar içinde CEPA ile takviye SH suyu (pH 7) statik olarak büyüdü ve 7 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edilmiştir. İEHB türevi, etilen, pelikül, ıslak ağırlık (A), azalmış ince tabaka kalınlığı (B) ve artan pelikül kuru ağırlığa (C) üzerinde herhangi bir etki. Farklı CEPA tedavileri birbirinden anlamlı farklılık yoktu. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). ile barlarFarklı harfler anlamlı farklılık bulundu (p &lt;0.05) bulunmaktadır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig7.jpg" /> Şekil 7: K. Temsilcisi fotoğraf xylinus zarlarına. Ince tabaka kalınlığı ImageJ yazılımı kullanılarak fotoğraflardan ölçülmüştür. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54682/54682fig8.jpg" /> Şekil 8: İEHB türetilmiş etilen hidrasyonunu azaltılmışK. xylinus selüloz zar kristal arttırarak ince zarlar. Kültürler, 24 yuvalı plakalar içinde SH suyu (pH 7) statik olarak büyümüş ve ince zarlar toplanır ve analiz edildi önceki 7 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edilmiştir. Zar hidrasyon peliküle ıslak ve kuru ağırlığı arasındaki fark olarak hesaplandı. Artan zar kristallikte (B), etilen, indirgenmiş pelikül hidrasyon (A) CEPA türetilen. Farklı CEPA tedavileri birbirinden anlamlı farklılık yoktu. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Farklı harflerle bar önemli ölçüde farklı (p &lt;0.05) vardır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54682/54682fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria at JoVE.com

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Görüntüleme.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

Video: Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Protocols for Robust Herbicide Resistance Testing in Different Weed Species

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

Farklı Ot Türlerinin Sağlam Herbisit Direnci Testi için Protokoller

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented ...

Çevre

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Laboratuvarda ölçmek yüzeyler bitki bakterilerin bağlılık

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in the shikimate pathway, which is virtually universal in plants. The inhibition of the enzyme stops the production of three essential amino acids: phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. EPSPS is also present in fungi and prokaryotes, such as archaea and bacteria; thus, the use of GBP may have an impact on the microbiome composition of soils, plants, herbivores, and secondary consumers. This article aims to present general guidelines to assess the effect of GBP on microbiomes from field experiments to bioinformatics analyses and provide a few testable hypotheses. Two field experiments are presented to test the GBP on non-target organisms. First, plant-associated microbes from 10 replicated control and GBP treatment plots simulating no-till cropping are sampled and analyzed. In the second experiment, samples from experimental plots fertilized by either poultry manure containing glyphosate residues or non-treated control manure were obtained. Bioinformatics analysis of EPSPS protein sequences is utilized to determine the potential sensitivity of microbes to glyphosate. The first step in estimating the effect of GBP on microbiomes is to determine their potential sensitivity to the target enzyme (EPSPS). Microbial sequences can be obtained either from public repositories or by means of PCR amplification. However, in the majority of field studies, microbiome composition has been determined based on universal DNA markers such as the 16S rRNA and the internal transcribed spacer (ITS). In these cases, sensitivity to glyphosate can only be estimated through a probabilistic analysis of EPSPS sequences using closely related species. The quantification of the potential sensitivity of organisms to glyphosate, based on the EPSPS enzyme, provides a robust approach for further experiments to study target and non-target resistant mechanisms.

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. In this article, we introduce general guidelines to quantify the effect of GBP on microbiomes, from field experiments to bioinformatics analyses.

Glifosat Bazlı Ürünlerin Mikrobiyomlar Üzerindeki Potansiyel Etkisinin Ölçülmesi

Glyphosate-based products (GBP) are the most common broad-spectrum herbicides worldwide. The target of glyphosate is the enzyme ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>DHNA ile Lactiplantibacillus plantarum'da EET'nin kronoamperometri analizi

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Biyokimya

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Biyoloji

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Farklı Ot Türlerinin Sağlam Herbisit Direnci Testi için Protokoller

Laboratuvarda ölçmek yüzeyler bitki bakterilerin bağlılık

Glifosat Bazlı Ürünlerin Mikrobiyomlar Üzerindeki Potansiyel Etkisinin Ölçülmesi

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Laktik Asit Bakterilerinde Üç Elektrotlu, İki Odacıklı Biyoelektrokimyasal Sistem ile Aracılı Hücre Dışı Elektron Transferinin Karakterize Edilmesi

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder