We thank Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank Istv&#225;n And&#243; for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp&gt;GFP flies, and Michael O'Connor for ptth and ptth&gt;grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia &amp; Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.

1. Sirkülasyon Hemocyte Konsantrasyon <ol><li> 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak. </li><li> 1X fosfat tamponlu salin (PBS, Tablo 1) ile doldurulmuş bulaşık kuyu kesme larvaları toplamak. </li><li> Her larva için, buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüp içinde PBS 1x 10 ul ve temiz bir diseksiyon pad üzerinde PBS 1x 10 ul yerleştirin. ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde diseksiyon yastık yerleştirin. </li><li> bir doku üzerine yerleştirerek bireysel larva kurutun diseksiyon pad üzerinde bir PBS damla aktarmadan önce silin. </li><li> forseps bir çift kullanarak, yavaşça açık gözyaşı ve dikkatle hemolimf serbest bırakmak için manikür ters çevirin. NOT: kazımak veya bu potansiyel sesil hemocytes 29 serbest olabilir gibi manikür yumruk için özen gösterin. </li><li> bir pipet kullanılarak, kesme pedden hemolimf toplamak. co önlemekBöyle vücut yağ olarak larva enkaz llecting. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp hemolimf ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Not: bazı örnekleri bir kez toplanır ve bir saat kadar buz üzerinde muhafaza edilebilir. </li><li> İsteğe bağlı: boya ve ölü hücreleri hariç eşit parçaya hemolimf örneği ile Tripan mavisi karıştırın. Bu hücreler için toksik olduğundan, tripan mavi ilave 3 dakika içinde hücre sayımı. </li><li> yukarı pipetleme ve aşağı hemositometre odasına 10 ul yüklemeden önce örnek karıştırın. </li><li> otomatik bir hücre sayacı durumunda, hücre boyutu ve dairesellik için uygun parametreleri ayarlanır. Normal, yuvarlak hemocytes 34 tespit etmek için% 80 yuvarlaklığı - Örneğin, 2 um&#39;den az hücre boyutu, 22 um maksimum hücre boyutuna ve 75 bir daireselliğe ayarlayın. farklı parametrelerle denemeler gibi lamellocytes gibi büyük ve iğ biçimli hemocytes tespit etmek. Alternatif olarak, el ile hemocytes saymak için bir hemasitometre kullanın. </li></ol> 2. Circulating Hemocyte İmmunohistokimya <ol><li> 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak. </li><li> 6 veya 12 oyuklu bir plakanın her bir bir lamel yerleştirin. Not: Kare lamelleri (22 mm), 6-yuvalı plakalar ve yuvarlak lamelleri (18 mm çapında) fit 12 oyuklu plakalar içinde uyum sağlar. </li><li> 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın. </li><li> Her lamel merkezinde 5 ul 1x PBS yerleştirin. </li><li> ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde plaka koyun. </li><li> silme bir doku üzerinde bireysel larva kurutun ve daha sonra lamel PBS içinde yerleştirin. </li><li> forseps bir çift kullanarak, yavaşça gözyaşı ve dikkatle manikür ters. larva karkas çıkarmadan önce, eşit hemolimf yaymak için kullanabilirsiniz. NOT: kazımak veya bu potansiyel sesil hemocytes 29 serbest olabilir gibi manikür yumruk için özen gösterin. </li><li> Repealamel başına bir larva hemolimf toplama, tüm larvaları için t. Hemocytes 5 için lamelleri uymak için izin ver -. Oda sıcaklığı oda sıcaklığında 8 dakika fiksasyonu 30 dakika önce aşmayın. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika süre ile, her lamel% 7.5 formaldehid (Tablo 1) 5 ul ekleyerek hemocytes sabitleyin. </li><li> Yıkama 1x PBS ile üç kez lamelleri. plaka İpucu ve her yıkamadan sonra PBS aspire. Bir sonraki adımda permeabilization solüsyonu akmasını önlemek için, lamelleri çevresinden aşırı PBS kaldırmak için aspiratör kullanın. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süre ile, her lamel 100 ul permeabilizasyon çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. </li><li> İpucu ve yavaşça permeabilization çözüm aspire plaka dokunun. </li><li> Sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1), birincil antikor seyreltilir. 12 oyuklu plakalar içinde, en az 500 ul lamelleri primer antikor çözeltisi ekleyin.6-yuvalı plakalar içinde en az 1.5 ml ilave edilir. gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Primer antikor solüsyonu çıkarın ve bir orbital çalkalayıcıda, üç kez 10 dakika boyunca 1 x PBS ile lamelleri yıkayın. </li><li> sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile sekonder antikoru ile seyreltilir. 12 oyuklu plakalar içinde lamelleri en az 500 ul ikincil antikor solüsyonu ekleyin. 6-delikli plakalardaki için en az 1.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve Adım 2.10 üç kez gibi bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca 1 x PBS ile lamelleri yıkayın. </li><li> Yıkama adımları sırasında, temiz bir cam mikroskop dokusu, ıslak mendilleri kullandıktan,% 70 etanol (Tablo 1) ile kayar. Her lamel için, cam slayt 5 ul montaj tampon (Tablo 1) yerleştirin. NOT: İki lamelleri bir slayt sığacak. </li><li> Nihai PBS yıkama aspire. </li><li> dikkatle plakalar ve yeri, inv gelen lamelleri çıkarmak için forseps kullanınMontaj tampon üstüne, erted. Not: Mikroskop slaytları önce görüntüleme 4 ° C&#39;de saklanabilir. Maksimum saklama süresi kullanılan antikorların istikrar bağlıdır. 6 ve 12-kuyucuklu plakalar çalkalanır ve yeniden kullanılabilir. </li></ol> Vivo Kristal Hücre melanization 3. <ol><li> Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, dişiler 2-6 saat sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak. </li><li> başlamadan önce, 60 ° C&#39;de bir ısıtma kaynağı olarak ayarlayın. Not: (25 ° C beklemeye elde edilmiş), 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;lik bir termal döngü cihazı programı en iyi şekilde çalışır, fakat ısı yine her bir larva üzerinde sürekli olarak ve eşit olarak dağıtılan bir su banyosu ya da başka bir ısı kaynağı sürece benzerlik yeterlidir. </li><li> 1x PBS (Tablo 1) ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın. </li><li> Bir kerede bir, bir doku üzerinde bir larva bir PCR tüpün alt kısmında silin ve yer kurutun. Her larva yerleştirinAyrı bir PCR tüpü içinde. (Şekil 3A bakınız.) </li><li> 15 dakika ve / veya yavaşça ısıtmadan önce tüpleri dokunarak - tutarlı sonuçlar için, 10, 4 ° C&#39;de tüpler içinde larvaları soğutma PCR tüpleri altındaki bu larvalar konforu sağlamak için. </li><li> termal döngü cihazı (veya su banyosu) PCR tüpleri yerleştirin. 10 dakika boyunca 60 ° C&#39;de ısıtın. </li><li> Dikkatle taze 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon içine PCR tüpleri larvaları çıkarın. </li><li> Bir doku üzerinde kuru larvaları silin ve bir stereomikroskop altında görüntüleme için düz bir yüzey üzerinde düzenleyin. </li><li> körü körüne birden bireyler tarafından larva görüntüleri skor. </li></ol> 4. Larva Lenf Bezi İmmunohistokimya NOT: Lenf bezi hafifçe sırt tarafında beynin altında bir larva ön ucundan yaklaşık üçte birinin uzunluğu yer almaktadır. (Şekil 3B oka bakın.) Lenf bezi dorsal damar kuşatan ve en kolay ağız hoo bağlı disseke edilirks veya beyne. Wild-tip, Üçüncü dönem lenf bezleri çok küçük yapılardır; Uzunluğu 200 mm - birincil lob yaklaşık 100 vardır. (Şekil 4A bakın.) <ol><li> 6 saat - Bu deney için kabaca aynı gelişim aşamasında larvalarını elde etmek için, kadın 2 sabit bir süre için yumurtalarını bırakmak için izin vererek yumurta toplama kısıtlamak. </li><li> Lenf bezi diseksiyonu <ol><li> Her bir deney koşulu için, 24-çukurlu plakanın bir oyuğuna PBS 1X 1 ml (Tablo 1) ekleyin. </li><li> Her bir tek kullanımlık bir aktarım pipeti kullanarak,% 0.1 PBST (Tablo 1) 1 damla ekleyin. Not: Deterjan, örneğin Tween 20 gibi doku kuyunun dibine çöker sağlayan yüzey gerilimini düşürmek için ilave edilir. </li><li> Buz üzerinde düz plaka koyun. </li><li> 1x PBS ile dolu çanak kuyuları diseksiyon larvaları toplayın. </li><li> ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde temiz bir diseksiyon yastık yerleştirin. smal yerleştirmek için atılan bir transfer pipetlemeyin kullanınl yastığı% 0.01 PBST (Tablo 1) düşer. diseksiyon için bir PBST damla bir larva transferi. </li><li> arka ucundan biri yaklaşık forseps çifti bir çeyrek uzunluk, dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde larva tutun. </li><li> manikür hemen larva tutan forseps ön kapmak için forseps başka bir çift kullanın. ağız kanca maruz kadar hafifçe ön sonuna doğru manikür çekin. NOT: Amaç herhangi bir iç yapılarını bozmadan manikür soymak etmektir. </li><li> manikür bırakın ve iki larva kesmek için her iki forseps kullanabilir. PBST açılan arka ucunu çıkarın. NOT: kütikül ağız kanca tüm yol soymak etmezse, iki larva kesti ve arka ucunu kaldırır. manikür kenarına tutun ve delikten ağız kanca itmek için forseps diğer çifti kullanmak için forseps bir çift kullanın. Bu manikür ters ve ağız kancalar gösterecektir. Bu altern olarak kullanılabiliryanı sıra diseksiyon yöntemi yedik. </li><li> istikrar için kütikül (ya ventral manikür, dorsal manikür kanadı, veya her ikisi) aşağı pin forseps bir çift kullanın. </li><li> maruz ağız kanca kapmak ve onları hafifçe çekin forseps başka bir çift kullanın. Not: Bu iç yapılardan manikür ayıracaktır. İdeal olarak, göz / anten hayali diskler, beyin, halka bezi ve dorsal damar yan lenf bezi ağız kanca takılı kalır. </li><li> Hala ağız kanca tutarken dikkatli böyle tükürük bezleri, yağ vücut ve bağırsak gibi istenmeyen yapıları kaldırmak. NOT: beyin ağız kanca ayrılırsa, lenf bezi hala takılı ve beyin ile tahsil edilebilir. Bu durumda, ventral sinir kablosu yerine ağız kancaları tutun. </li><li> Bir kolu olarak ağız kanca veya ventral sinir kablosunun kullanılması. Buz üzerinde kuyuya lenf bezi içeren disseke kompleksi transferi 30 dakika aşmayıntespitten önce. </li></ol></li><li> Sabitleme ve immünhistokimya <ol><li> stereomikroskop bazında 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> dikkatle Kuyudan PBST kaldırmak için bir P200 pipet kullanın. NOT: Boş, komşu kuyu geçici atık yatırmak için faydalıdır. </li><li> Yavaşça kuyunun aşağı tarafı 200 ul% 3.7 formaldehit (Tablo 1) ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olmak için plakayı girdap. </li><li> 30 dakika için buza geri plaka dönün. Lenf bezleri floresan proteini (ler) ini ifade ederse, photobleaching önlemek için kapalı plaka tutun. </li><li> dikkatlice fiksatif kaldırmak için bir P200 pipet kullanın. </li><li> oyuğuna 200 ul 1 x PBS eklenerek ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka yerleştirerek yıkayın. dikkatlice PBS kaldırmak için bir P200 pipet kullanın. NOT: Tüm deney koşulları d olan için sabit lenf bezleri lenf bezlerinde kadar PBS içinde buz üzerinde bırakılabilirissected ve sabit. </li><li> Yıkama iki kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> Kuyuya 200 ul permeabilizasyon çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka ayarlayın. NOT: 45 dk lenf bezi permeabilization için &quot;altın standart&quot; olduğunu ancak yazarlar sadece 20 dakika sonra başarı var. </li><li> P200 pipet ile çözüm çıkarın. </li><li> Sağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi (Tablo 1), birincil antikor seyreltilir. kuyuya 300 ul birincil antikor çözüm ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olun. gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> birinci antikorları ayıklamak için P200 pipet kullanın. </li><li> oyuğuna 200 ul 1 x PBS eklenerek ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka yerleştirerek yıkayın. dikkatlice PBS kaldırmak için bir P200 pipet kullanın. </li><li> Yıkama iki kez daha adımları tekrarlayın. </li><li> İkinci bir seyreltiksağlayıcının özelliklerine göre antikor çözeltisi ile ntibody. kuyuya 300 ul ikincil antikor çözüm ekleyin ve disseke dokuların tamamen sular altında olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin. </li><li> ikinci antikorları ayıklamak ve Adımlar 4.3.12 ve 4.3.13 de tarif edildiği gibi yıkama P200 pipet kullanın. Nihai yıkamadan sonra PBS çıkarmayın. </li></ol></li><li> bezi montaj Lenf <ol><li> Temiz cam mikroskop% 70 etanol (Tablo 1) ve doku ıslak mendilleri kullandıktan kayar. </li><li> Her bir deney koşulu için, cam slayt tamponu (Tablo 1) montajı bir damla yerleştirin. NOT: İki koşullar bir slayt sığacak. tampon hacmi montaj lenf bezlerinde sayısı monte edilecek bağlıdır. 20 lenf bezleri, 10, 1 | il - - 12, 5 veya daha az, 0.5 ul, yaklaşık 18 2 ul kullanın. </li><li> ışıklı stereomikroskopta kaide üzerinde bir mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Bir defada en fazla iki koşullar için, bir sap olarak ağız kanca veya ventral sinir kablosu kullanarak, forseps ile montaj tamponu iyi lenf bezlerinin hepsi aktarın. </li><li> Uzay işlemi montaj tampon yayılan dairesel veya dikdörtgen şeklinde eşit parçalara dokular. </li><li> parçalara dokuların her biri için, tek tek, dorsal teknenin altında forseps bir maşa slayt ve yavaşça monte tampon çevresine doğru çekilir. NOT: Bu lenf disseke dokuların geri kalanından bezi ve cam üzerine lenf bezi dümdüz çekecektir. </li><li> bir forseps maşa ve bir testere hareketi kullanarak, lenf bezi ve beyin arasındaki dorsal gemi kesti. </li><li> tampon dış kenarında, lenf bezi karşı tarafına parçalara dokuların geri kalan hareket ettirin. NOT: İstenmeyen disseke dokular sonunda lenf bezlerinde etrafında bir çevre oluşturmak ve yüklenebileceğini üzerine bir destek olarak görev yapacaklamel duracaktır h. </li><li> lenf bezlerinde her merkeze yerleştirmek için istenmeyen Diseke dokuların bir saklı kalmak üzere, disseke dokulardan ayrılır kadar tekrarlayın. </li><li> iki parmak arasında bir lamel atın. lamel toz ve parmak izi olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse, bir doku bez kullanın ve% 70 etanol lamel temizlemek için. </li><li> lamel kenarı cam slayt kenarına paralel olmasını sağlamak, dikkatlice montaj tampon üzerinde lamel indirin. Not: Mikroskop slaytları önce görüntüleme 4 ° C&#39;de saklanabilir. Maksimum saklama süresi kullanılan antikorların istikrar bağlıdır. 24 oyuklu plakalar, durulanmış ve yeniden kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 5. Görüntüleme <ol><li> Görüntü hemocytes sabit ve üreticinin kullanma kılavuzuna göre 20X veya daha yüksek büyütmede uygun bir standart floresan veya konfokal mikroskop lenf bezleri monte edilmiş. Bir stand görüntü bütün larvalarıÜreticinin kullanım kılavuzuna göre 2X büyütme ard stereomikroskopta. </li><li> istenirse, Dekonvolüsyonun için yazılım sağlayıcının talimatları izleyin. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> kompozisyon </td><td> Depolama </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td rowspan="5"> 1X PBS </td><td> 200 mg / L potasyum klorür </td><td rowspan="5"> oda sıcaklığı </td><td rowspan="5"></td></tr><tr><td> 200 mg / L potasyum fosfat monobazik </td></tr><tr><td> 8.000 mg / L sodyum klorür </td></tr><tr><td> 1.150 mg / L sodyum fosfat dibazik </td></tr><tr><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> Sabitleme </td><td> % 3.7 ya da% 7.5 formaldehid, PBS içinde 1 x </td><td> oda sıcaklığında karanlıkta </td><td> Formaldehit toksiktir. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Permeabilizasyon çözelti / antikor inceltici</td><td> % 0.4 Triton </td><td rowspan="3"> 4 ° C </td><td rowspan="3"> standart bir formül% 0,4 Triton kullanır, ancak yazarlar başarı ile Tween 20% 0.1 kullanın. sağlayıcıların tavsiye konsantrasyonlara göre primer ve sekonder antikorlar sulandırmak için kullanın. </td></tr><tr><td> % 5 bovin serum albümini, normal keçi serumu veya normal eşek serumu </td></tr><tr><td> 1X PBS </td></tr><tr><td> % 70 etanol </td><td> dH2O% 70 200 derece etanol </td><td> oda sıcaklığı </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> montaj tampon </td><td> % 0.5 N-propil galat </td><td rowspan="4"> Karanlıkta 4 ° C </td><td rowspan="4"> N-propil galat zararlıdır. DAPI bir mutajen olduğunu. </td></tr><tr><td> % 80 gliserol </td></tr><tr><td> İsteğe bağlı: 1 ug / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) </td></tr><tr><td> 1X PBS </td></tr><tr><td> % 0.1 PBST </td><td> 1x PBS içinde% 0.1 Tween 20 </td><td> oda sıcaklığı </td&gt; <td></td></tr><tr><td> % 0.01 PBST </td><td> % 0.1 PBST 01:10 seyreltme </td><td> oda sıcaklığı </td><td></td></tr></tbody></table> Bu Protokolün kullanılan Tablo 1. Çözümler.

<ol>
	<li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).</li><li>Crozatier, M., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+haematopoiesis.">Drosophila haematopoiesis.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+a+model+for+studying+genetic+and+molecular+aspects+of+haematopoiesis+and+associated+leukaemias.">Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias.</a> Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).</li><li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li><li>Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+hematopoietic+hubs+in+Drosophila+adults+generate+hemocytes+and+contribute+to+immune+response.">Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response.</a> Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).</li><li>Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+immune+response+to+parasitization+in+Drosophila+requires+the+EBF+orthologue+collier.">Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier.</a> PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Minakhina, S., Steward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanotic+mutants+in+Drosophila:+pathways+and+phenotypes.">Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes.</a> Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).</li><li>Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+targets+of+Drosophila+JAK/STAT+pathway+signalling+as+effectors+of+haematopoietic+tumour+formation.">Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation.</a> EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).</li><li>Avet-Rochex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+RNA+interference+screen+identifies+gene+networks+controlling+Drosophila+melanogaster+blood+cell+homeostasis.">An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis.</a> BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).</li><li>Rodriguez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+immune+system+and+response+genes,+and+novel+mutations+causing+melanotic+tumor+formation+in+Drosophila+melanogaster.">Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).</li><li>Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+fruit+fly+hemangioblast+and+similarities+between+lymph-gland+hematopoiesis+in+fruit+fly+and+mammal+aorta-gonadal-mesonephros+mesoderm.">Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm.</a> Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).</li><li>Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+Notch+and+MAPK+signaling+specifies+the+blood+progenitor+fate+in+the+Drosophila+mesoderm.">The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm.</a> Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).</li><li>Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Serrate-expressing+signaling+center+controls+Drosophila+hematopoiesis.">A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis.</a> Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).</li><li>Krzemien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+blood+cell+homeostasis+in+Drosophila+larvae+by+the+posterior+signalling+centre.">Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre.</a> Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).</li><li>Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hedgehog-+and+Antennapedia-dependent+niche+maintains+Drosophila+haematopoietic+precursors.">A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors.</a> Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).</li><li>Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EBF+transcription+factor+Collier+directly+promotes+Drosophila+blood+cell+progenitor+maintenance+independently+of+the+niche.">The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).</li><li>Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+wingless+signaling+in+stem-like+hematopoietic+precursor+maintenance+in+Drosophila.">Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).</li><li>Pennetier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+control+of+the+Drosophila+hematopoietic+niche+by+bone+morphogenetic+protein+signaling+reveals+parallels+with+mammals.">Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).</li><li>Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-modulated+Heartless+signaling+in+Drosophila+blood+progenitors+regulates+their+differentiation+via+a+Ras/ETS/FOG+pathway+and+target+of+rapamycin+function.">Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function.</a> Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).</li><li>Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yorkie+and+Scalloped+signaling+regulates+Notch-dependent+lineage+specification+during+Drosophila+hematopoiesis.">Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis.</a> Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).</li><li>Milton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+regulates+hematopoiesis+in+Drosophila+melanogaster.">The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster.</a> Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).</li><li>Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+hematopoiesis:+Markers+and+methods+for+molecular+genetic+analysis.">Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis.</a> Methods. 68 (1), 242-251 (2014).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J Vis Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+the+crystal+cells+in+the+larva+of+Drosophila+mekmogaster.">Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+lymph+gland+as+a+developmental+model+of+hematopoiesis.">The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis.</a> Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).</li><li>Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+Drosophila+larval+hematopoietic+organ,+hemocyte+homeostasis+and+the+dedicated+cellular+immune+response+to+parasitism.">Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism.</a> Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+Larval+Hemocytes+of+Drosophila-Melanogaster.">Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster.</a> Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).</li><li>McBrayer, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prothoracicotropic+hormone+regulates+developmental+timing+and+body+size+in+Drosophila.">Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila.</a> Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).</li><li>Reimels, T. A., Pfleger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rabex-5+restricts+Notch+activity+in+hematopoietic+cells+and+maintains+hematopoietic+homeostasis.">Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis.</a> J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Genetik ya da çevresel değişiklik üzerine, burada açıklanan dört yöntem gibi sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hematopoez sırasında farklı süreçleri analiz etmek ayrı ayrı ya da birlikte kullanılabilir Drosophila hematopoez dinamik bir süreçtir.; hayvan başına hemocytes sayısı 35 artar ve lenf bezinin yapısı ve gen ifadesi gelişimi sırasında 32 değiştirir. Bu analizler gerçekleştirmeden önce, bu nedenle, o zaman sabit bir miktar...

hematolojik hastalıklarda hematopoetik sisteminin geliştirilmesi ve bu arızaya koordinat transkripsiyon faktörlerini ve sinyal yolları düzenleyen karmaşık mekanizmalar yeterince anlaşılamamıştır. Bu transkripsiyon faktörleri ve sinyal yolları, hem de bunların düzenlenmesi, yüksek Drosophila ve memeli hematopoez 1-5 arasında muhafaza edilir. Böylece Drosophila hematopoetik sistem hematopoezisi ve altta yatan hematolojik hastalıkları kontrol moleküler mekanizmaları tanımlamak için mükemmel bir genetik modeli temsil etmektedir. Memelilere benzer şekilde, Drosophila hemopoeziste mekansal ve zamansal farklı aşamalarında hemocytes denilen kan hücreleri, üretir. Geleneksel olarak, Drosophila hematopoez embriyonik mezoderm ve larva lenf bezinde fazlar sınırlı olabileceği düşünüldü. hematopoez da larva sapsız CLU meydana geldiği Son çalışmalar kanıtsters 6-8 karın yetişkin. plazmatositler ve kristal hücreleri: Tüm hematopoetik fazlar olgun hemocytes iki türleri üretmek. Plazmatositler fagositoz, doğal bağışıklık ve yara iyileşmesinde rol makrofaj benzeri hücrelerdir. Kristal hücreleri melanization, böcek bağışıklık tepkilerinin ve yara iyileşmesinde kullanılan bir reaksiyon için gerekli olan ön-fenoloksidazlar içerir. Üçüncü olgun hemocyte türü oluşturabilir Larva hematopoez gibi parazitoit eşek arısı enfeksiyonu 9,10 gibi bazı bağışıklık zorluklara cevaben, bir lamellocyte çağırdı. Lamellocytes saklanması ve Drosophila larvalarının döşenen arısı yumurta nötralize etmek için, plazmatositler ve kristal hücreleri ile bağlantılı olarak, işlev büyük, yapışan hücreler bulunmaktadır. parazitlenme yokluğunda, lamellocytes vahşi tip larvaları bulunmaz. Melanotik kitleler melanized, kapsüllü yabanarısı yumurtalarını benzer; Birçok mutant Drosophila suşları Parazitlenme yokluğunda melanotik kitleleri geliştirmek. Lamello varlığılenfositler ve / veya melanotik kitleler hematopoetik anormalliklerin göstergesi olabilir. Aslında, melanotik toplu fenotipik hematopoez 11-14 katılan genler ve yolları belirlemek için kullanılmıştır. larva hematopoetik sistem en yaygın Bugüne kadar incelenen olduğunu. Bu hemolimf dolaşan hemocytes oluşur, sapsız hemocyte manikür altında desenli kümeleri ve hemocytes lenf bezinde ikamet eden. Lenf bezi dorsal kabına bağlanmış ikili lobların dizisidir. Lenf bezinin her birincil lob üç ana bölgeye ayrılmıştır. en dış bölge kortikal bölge olarak bilinir ve hemocytes olgunlaştırma içerir. iç bölge medüller bölgesi olarak adlandırılan ve sakin hemosit öncülerinin oluşur. Üçüncü bölge, arka sinyal merkezi, kök hücre benzeri niş olarak hareket lenf bezi dibinde küçük bir hücre grubudur. Erken çalışma Notch 15-18 için kritik işlevleri kurulmuş </sup&gt; Kirpi 19,20, JAK-STAT 18 ve Kanatsız 21 etkinlik larva lenf bezi gelişimini düzenler. Daha yeni çalışmalar BMP 22, FGF-Ras 23 ve Hippo 24,25 sinyal de larva lenf bezinde işlev olduğunu göstermiştir. Burada belirtilen dört larva hematopoietik deneyleri 1) birim hacmi başına hücre sayısı olarak tanımlanır sirkülasyon hemocyte konsantrasyonunu ölçme 2) izole edilmesi ve sabitleme 3) in vivo olarak, kristal hücreleri görselleştirme, immünohistokimya için hemocytes sirkülasyon ve 4), sabitleme kesme ve montaj tarif lenf immünohistokimya için rakorlar. Bu deneyler, fonksiyonları ve larva hematopoietik sistem yolaklarını düzenlemeleri değerlendirmek için hematopoietik çıktılan olarak da kullanılabilir. Bu yöntemler, bu alanda daha önce kullanılmış olsa da, bu deneylerin görsel belgeler sadece son 8,26-30 başlamıştır. Burada belirtilen çeşitli yayınlar yardım vardırbenzer yöntemler ve hematopoietik işaretleri 26,31-33 tarif ful kaynaklar. Ayrıca, Trol ve Viking lenf bezi bazal membran kullanışlı göstergeleridir.

<table><tbody><tr><td>PBS tablets</td><td>MP Biomedicals</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>dissecting dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit</td><td>Krayden (distributed through Fisher)</td><td>NC9644388 (Fisher catalog number)</td><td>Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Morrell Instruments (Nikon distributor)</td><td>mna42000, mma36300</td><td>Nikon models SMZ1000 and SMZ645</td></tr><tr><td>tissue wipe</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-DZ</td><td></td></tr><tr><td>p200 pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue stain</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Rocky Mountain Biologicals</td><td>BSA-BSH-01K</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>normal donkey serum</td><td>Sigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>VWR</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl gallate</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>VWR</td><td>EM-4750</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Fisher</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>microscope cover glass, 22 mm square</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>microscope cover glass, 18 mm circular</td><td>Fisher</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>glass microscope slides</td><td>Fisher</td><td>22-034-980</td><td></td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950010037</td><td>Mastercycler EP Gradient S</td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>disposable transfer pipet</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager.Z1</td></tr></tbody></table>

methods to examine the lymph gland and hemocytes in drosophila larvae

Birçok paralellik. Drosophila memeli adaptif bağışıklık karakterize lenfoid soyu eksikliği olsa bile, Drosophila ve memeli hematopoetik sistemler arasında mevcut Drosophila ve memeli hematopoez çeşitli kan hücre soylarından üretmek için mekansal ve zamansal farklı aşamalarında ortaya çıkar. Her iki sistem de genişletmek veya olgun soy yerine hangi kan hücresi atalarıdır rezervuarları korumak. Hematopoetik sistem Drosophila ve memeliler yanıt vermek ve bağışıklık zorluklara uyum sağlar. Önemlisi, nesil, bakım ve hematopoetik sistemin fonksiyonunu kontrol transkripsiyonel düzenleyicileri ve sinyal yolları memelilere sinekler muhafaza edilir. Bu benzerlikler Drosophila genetik model, hematopoetik gelişimi ve hastalığa kullanılmasına izin. Burada ayrıntı deneyleri Drosophila larvaların hematopoetik sistemi incelemek için. İçindeÖzellikle, biz, kan hücre sayıları ve konsantrasyonu ölçmek in vivo belirli bir olgun soy görselleştirmek ve dolaşımdaki ve hematopoetik organ kan hücrelerinde immünhistokimya gerçekleştirmek için yöntemler özetlemektedir. Bu deneyler, gen ifadesi değişikliklerini ve sinyalizasyon, hayatta kalma, yayılması ve farklılaşma gibi hücresel süreçleri ortaya çıkarabilir ve hematopoezisi ilgili çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Drosophila uygun genetik araçlar ile birlikte, bu deneyler, tanımlanmış genetik değişiklikler üzerine hematopoietik sistem değerlendirmek için de kullanılabilir. Özellikle, burada belirtilen olmasa da, bu deneyler, aynı zamanda hematopoietik sistemi üzerinde enfeksiyon veya diyet gibi çevresel değişiklikleri, etkisini incelemek için kullanılabilir.

Hemosit dolaşımsal konsantrasyonu Hemocyte numaraları larva gelişimi 35 boyunca artar. Bu yöntem hemocyte numaraları ve konsantrasyon farklılıkları algılar olduğunu göstermek için, ne olursa olsun biyolojik nedeni, biz gecikmeli ve gecikmesiz larvaların hemocyte konsantrasyonlarını ölçtük. Ptth üreten nöronların (ptth&gt; gaddar) genetik ablasyonu prothoracicotropic hormon (ptth) Zarar larva geli?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae at JoVE.com

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

methods-to-examine-the-lymph-gland-and-hemocytes-in-drosophila-larvae

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

12.8K Görüntüleme.  The Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Drosophila ve memeli hematopoetik sistem hematopoez çalışmak için Drosophila çekici genetik model yapımı, birçok ortak özellikleri paylaşır. Burada İmmünohistokimyada için önemli larva hematopoetik organ diseksiyonu ve montajını göstermektedir. Ayrıca sirkülasyon hemocytes ve sesil kristal hücreleri dahil olmak üzere çeşitli larva hematopoietik bölmeleri tahlil etmek için yöntemler açıklanmaktadır. 

Video: Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Gelişim Biyolojisi

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Nörobilim

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biyoloji

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (meyve sineği)

Larva

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzole Edilmesi

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila