Name: establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).

Not: Saflaştırılmış C-di-GMP raportör plasmidinin klonlama ve başkalaştırma için prosedürler başka 12 tartışılmıştır. C-di-GMP Muhabir P. Tagged GFP 1. Nesil aeruginosa&#39;nın <ol><li> P. tek bir koloni ile lizojeni suyu 5 ml (LB) ortamı aşılamakta aeruginosa 200 rpm&#39;de çalkalanarak bir gece boyunca 37 ° C inkübasyon ve. </li><li> Transferi 2 1 L&#39;lik bir şişe içinde, taze LB ortamında 200 ml, gece boyunca kültürün mi, 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 600 nm (OD 600), şişeden 1 ml numune alma ve (daha önce anlatıldığı gibi 12) bir spektrofotometre kullanılarak incelenmesi ile her 30 dakikada optik yoğunluk izleyin. </li><li> OD 600 0.3 arasında ulaştığında - 0.5, 50 ml konik santrifüj tüpüne kültür 40 ml yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 8000 rpm&#39;de santrifüj hücreleri topak süpernatantı ve r atınbuz soğukluğunda steril, 300 mM sukroz çözeltisi 40 ml hücreleri, e askıya. </li><li> Aşama 1.5&#39;te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi, 20 ml yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri bir kez Pelet. </li><li> Aşama 1.5&#39;te tarif edilen buz gibi soğuk, steril, 300 mM sukroz çözeltisi 400 ul içinde yeniden askıya olarak santrifüj hücreleri son bir kez Pelet. Not: bu noktada hücre yoğunluğu mililitre başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 koloni oluşturan birim (CFU / ml) olması gerekir. </li><li> bunlar elektroporasyon hazır sonra, 30 dakika için, buz üzerinde hücreleri soğutun. </li><li> P. 40 ul 0.2 ug / ul pCdrA :: GFP Cı plazmid 12 çözeltisi 1 ul ekle aeruginosa elektro-kompetan hücreler buz üzerinde önceden soğutulmuş olan bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde yukarıda hazırlanan. süspansiyon karıştırın ve önceden soğutulmuş 2 mm bir elektrot aralığı, elektroporasyon küvetine aktarılır. Not: pCdrA :: GFP </em&gt; C: P. Cı-di-GMP hücre içi seviyesinin bir flüoresan değerini gösterir pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp Gm r r, aeruginosa suşları, gelişmiş ve Rybtke ve ark., 12 ile doğrulandı. </li><li> kağıt mendil ile küvetin dışına nem kaldırmak ve Elektroporatör örnek odası ve küvet. 2.5 kV, 25 | iF ve kapasitans ve 200 Ω direnç bir gerilim ile nabız. </li><li> küvet çıkarın ve LB ortamı içinde 1 ml. Daha sonra, steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hücreleri transferi ve 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 10 ul, 50 ul (100 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda) ampisilin ile desteklenmiş steril LB-agar plakaları üzerine kültürün 100 ul alikotları yayılmış ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Excitati GFP ifade onaylamaktek bir koloni, standart bir GFP kanalı ile bir floresan mikroskobu altında plaka incelenmesi ve çekme ile 485 nm, 520 nm emisyon), 5 mi kilodan aşılanması için aşama 1.1 &#39;de tarif edildiği gibi, gece boyunca inkübe edin. -80 ° C üst boru ve mağaza vida 2 ml 0.5 ml% 50 gliserol ile bir gece boyunca kültür 0.5 ml karıştırın. </li></ol> Aşılama için Starter Kültür 2. Hazırlık <ol><li> İki gün ekran önce, P. plaka aeruginosa&#39;nın den (pCdrA :: GFP Cı plasmid ihtiva eden) -80 LB-agar plakası üzerine Cı stokunun ° yavaşça steril bir aşı kullanılarak plaka üzerinde bakteri yayarak (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) döngü. 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Tarama akşam önce, P. tek bir koloni aşılamak LB ortamında 10 ml plakadan aeruginosa&#39;dan tu (100 ug / ml bir konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş)olabilir ve 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ön-kültür bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Ekranın gün, ayrıca bir OD% 5 LB ile seyreltilerek bir OD daha sonra 1.0 600 ve taze LB ortamı ilk seyreltilmesi ile bir gece boyunca ön kültür bir alt kültür hazırlanması 0.04 (01:25 oranında) 600 . Not: aşılanmış ortam toplam hacmi, test edilecek plakaların sayısına bağlıdır. % 5 LB gerekli konsantrasyona fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile% 100 LB seyreltilmesiyle yapılmıştır. Önemlisi, medya (% 5 LB) pCdrA kurucu aktivasyon :: P. GFP C veriyor aeruginosa. </li><li> bunlar 384 gözlü levhalar içine tevzi edilmeden önce bakteri ortam alışmasına izin oda sıcaklığında 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde en az bir hızda kültür kabı içine steril bir manyetik karıştırıcı çubuğu ilave edin ve karıştırın. </li></ol> Ihtiva eden 384 çukurlu Plakalar 3. aşılama ve inkübasyonKüçük moleküller Not: Kısırlık ve iyi aseptik teknikler aşağıdaki adımlara büyük önem taşımaktadır. <ol><li> pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3&#39;te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 20 ul tobramisin sülfat (25 mg / ml) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyular A23 içine pozitif kontrol kültürünün 40 ul - P23 (Şekil 2). </li><li> negatif kontrol (% 0 inhibisyon) hazırlamak için, Aşama 2.3&#39;te elde alt kültürü, 10 ml (en fazla 12 plakaları için yeterli) 30 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve yavaşça karıştırın. Pipet kuyu A24, negatif kontrol kültürün 40 ul - P24 (Şekil 2). </li><li> P22 (Şekil 2) - küçük moleküller ile damgalanmış plakalarının her biri için, bir kuyu A1 (Kademe 2.3 anlatılan) ile seyreltildi, gece boyunca kültürün 40 ul hacmi inoküle. Not: Bu, bir sıvı tutucu rob kullanılarak elde edilebilirot. Bakteriyel kültürler heterojen özellikleri, dağıtma sırasında sürekli olarak ortam dağıtılan bakteri tutmak için sürekli ve orta ajitasyon sağlamak için önemlidir. Bunu yapmak için, manyetik dağıtım esnasında adım 2.4 acclimatized kültürü karıştırmaya devam edin. </li><li> bir hava-geçirgen, örtücü bir conta ile plakaları Seal ve 37 ° C de 6 saat inkübe edilir. Not: hava geçirgen mühür 384 kuyuların arasında değişmeyen koşulları sağlamak ve plaka boyunca oksijen geçişlerini potansiyel gelişimini engelleyecek önemlidir. </li></ol> 4. Büyüme (OD 600) ve Hücre içi c-di-GMP Seviye Ölçümü (GFP) <ol><li> Yaklaşık 30 dakika spektrofotometrik ölçümden önce, yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C plaka okuyucu önceden ısıtmak. </li><li> Yavaşça okumadan önce hava geçirgen kapak contası çıkarın. oyuk başına 10 yanıp ayarı ile 600 nm&#39;lik bir dalga boyunda optik yoğunluk ölçme ve0,2 saniyelik bir yerleşme zamanı. </li><li> Floresan ölçüm önce de A24 (negatif kontrol) dayalı bir otomatik kazanç ve odak ayarı yapmak ve% 75 (Şekil 2) kazanç hedef değerini ayarlayın. <ol><li> plaka okuyucu kontrol yazılımından, başlangıç ​​ölçümü tıklayın ve &#39;tıklayın&#39; Odak ve Kazanç Ayarı / Plate kimlikleri &#39;&#39; sekmesine gidin. </li><li> penceresinde sağ tarafta &#39;&#39; Odak Ayarı &#39;&#39; ve &#39;&#39; Kanal A &#39;&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;&#39; Kazanç Ayarı &#39;seçip&#39; &#39;iyi seçilmiş&#39; ve &#39;Hedef değeri&#39; &#39;olarak&#39; &#39;75&#39; &#39;yazın. Son olarak, &#39;&#39; Ayarı Başlat &#39;tıklamadan önce plaka düzeni de A24 almak. Ayar yapılır sonra, &#39;&#39; Ölçümü başlatın &#39;üzerine tıklayın. </li><li> kuyu ve bir settli başına 10 yanıp ayarı ile 485/520 nm uyarma / emisyon maxima GFP muhabir floresan ölçmek0.2 saniye ng süresi. </li></ol></li><li> incelenen tüm plakaları verileri toplayın. Not: Veri okumaları otomatik plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından varsayılan olarak kaydedilir. <ol><li> istatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımı içinde &quot;Mars&quot; ikonuna tıklayarak gör okumaları. </li><li> analiz için verilere erişmek için ilgi plaka numarasına &quot;çift tıklayarak&quot; verileri almak. </li></ol></li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> yüksek verimli ekranlar için en sık bildirilen kalite ölçütleri olan sağlam z &#39;analizi kullanılarak tahlil tekdüzelik ve tekrarlanabilirlik değerlendirin. Sağlam z &#39;formülü kullanarak hesaplayın: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> MAD (Medyan Mutlak Sapma) standart sapmasının tahmini olduğunda, p pozitif kontrol (% 100 inhibisyon) ve n negatif kontrol hem OD 600 ve GFP v (% 0 inhibisyon) &#39;diredilen değerler. Not: ya da daha büyük 0.5&#39;e eşit (her ikisi de OD 600 ve GFP ham veri için hesaplanan) sağlam bir Z &#39;değeri bir yöntemi mükemmel tahlil olarak kabul edilir. </li><li> formül kullanılarak büyüme% &#39;sinin hesaplanması: <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> Nerede Xi OD600 Her numunenin tekrarlanan OD 600 değeri iyidir. İnhibisyon% &#39;si OD600&gt; 0, büyüme inhibitörü; % Önleme OD600 &lt;0, büyütme faktörü. </li><li> formül kullanılarak C-di-GMP hücre içi seviyesinin% inhibisyonunu değerlendirmek (keyfi floresan yoğunluğu birimleri değişim hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi) <img alt="denklem 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="denklem 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> Nerede Xi GFP Her numunenin tekrarlanan GFP değeri iyidir. İnhibisyon% &#39;si, GFP&gt; 0, c-di-GMP inhibitörü; %# 160; İnhibisyon GFP &lt;0, c-di-GMP destekleyicisi. </li><li> örnekten hesaplanan medyan (ortanca ± 3 MAD), 3 MAD de isabet tespiti için eşik değeri de veri noktaları normal dağılıma varsayarak, her plaka-çıkışları okuyun. Not: Ancak gerekirse ±% 50 inhibisyon kesme daha tekrarlanabilir ve hassas doz tepki deneyleri için seçilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recover+the+lost+art+of+drug+discovery.">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li><li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling:+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation?.">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?.</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li><li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+the+PilZ+don't+work:+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria.">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li><li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP:+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger.">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li><li> Boyd, C. D., GA, O. '. T. o. o. l. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation:+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems.">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li><li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa.">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li><li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria.">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation.">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development.">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li><li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bakteriyel enfeksiyonların tedavisini geliştirmek amacıyla, moleküler bir düzenleyici seviyede bakteriyel davranışını daha iyi anlaşılması için açıktır. Burada açıklanan prosedür manipüle veya bakteriler c-di-GMP hücresel konsantrasyonları ile müdahale potansiyeline sahip küçük moleküller ortaya çıkarmak istiyorsanız mikrobiyolog, biyokimyacı ve klinisyenler için yararlı olacaktır. Yöntem P. c-di-GMP hücresel seviyelerini izlemek için yeni geliştirilen GFP bioreporter kullanır aeruginosa 12. Bu bioreporter önemlisi kültürlendiğinde% 5 LB PBS kullanılan suşunun büyümesini etkileyen için geçerli ve gösterilmiştir. In vivo olarak, c-di-GMP seviyesini değiştiren küçük molekülleri tanımlamak için bir bütün hücre ekranın kullanılması, özellikle Gram-negatif bakterilere yoluyla bakteriyel zarlardan molekülü penetrasyonu hedef bazlı ilaç keşfi büyük zorluklar üstesinden . Önemli bir şekilde, To tahlil 0.5 bugüne kadar tüm ekranlarda gözlendi sürekli yukarıda sağlam z &#39;değeri olarak çok sağlam görünüyor. Inhibe eden ve / veya P. hücre içi c-di-GMP seviyesini geliştirmek küçük moleküllerin sayısı ortaya çıkaracaktır, bu protokol kullanılarak tarama aeruginosa. Ayrıca, bu deney de bakteri öldürücü ya da OD 600 okuması bir azalma ile sonuçlanan bakteriyostatik bileşiklerin belirlenmesi için bir potansiyele sahiptir. protokol bölümünde ele olmasa da, deney hazırlanması için birkaç önemli hususlar vardır. GFP bioreporter bir plazmid dayanmaktadır akılda tutmak hayati önem taşımaktadır. Reporter plazmid P. çok kararlı olduğu bilinmektedir, ancak aeruginosa, bu nedenle, sürekli yeniden sonra kaplama Cı gliserol stokundan ° &#39;den -80 taze kaplama suşlar kullanma ihtiyacı kaybetti ve floresans ekspresyonunu kontrol kritik olabilir. Ekranın boyunca üniform büyüme koşullarını sağlamak için de çok değerlidirBu koşullarda herhangi bir dalgalanma ekranda knock-etkileri olabilir çünkü. Bu medya ve antibiyotikler toplu premade ve ekranın boyunca kullanılmaktadır emin hale içerir. Bakteri kültürleri düzgün bir şekilde (OD 600 okumaları göre) büyüyen değil, bu doğanın en yüksek verimli ekranlar için ortak bir sorundur. Bu etkileri veya tabak içine homojen olmayan bir bakteri kültürü dağıtım kenar bağlı olabilir. Eski için, inkübasyon sırasında kullanılan bir gaz geçirgen conta hayatidir emin. ikincisi, bir kültür hacmi ile sıvı işleyici boru priming birlikte en az üç kez, borunun kendisi ölü hacmi tavsiye edilmektedir. Dağıtım sırasında en az bir hızda manyetik karıştırıcı tutmak için çok önemlidir. izleme ve deney boyunca tutarlı bir büyüme 384 oyuklu plakaların saklanma çok önemlidir birlikte, önlemek için bir durum un neden olabilir inkübasyon sırasında levhalar istiflenmesinibüyüme modelinde bir çarpıklık giden oksijen gradyanlar istedi. Bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır DMSO aracı negatif ilgi suşunun büyümesini etkileyen olmadığından emin olmak için önemlidir. büyüme ile ilişkili bu sorunların çoğu tarama öncesinde ilgi bakteri suşu ile sahte bir ekran yaparak önlenebilir. Cı-di-GMP inhibisyon sonuçları, hücre yoğunluğundaki değişikliğin düzeltilmesi gerekir rasgele floresan yoğunluğu birimleri değişikliği hesaplanır verilen aynı zamanda veri yorumlama yararları göz. Bu akılda farklı matematiksel formüller Bu deneylerde elde edilen veriler çıkışı da dikkate alınmalıdır değerlendirmek. Örneğin, bir bileşik, bir C-di-GMP inhibitörü olarak görünebilir, ancak gerçekte belirlenen isabet ihtiyatlı yorumunu gerektiren büyüme önleyicisi ya da tam tersi olabilir. Bu gelişim ve performansı sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç sakıncaları ve sınırlamalar vardıryüksek yayılmalı hücre bazlı bir elek. Örneğin, algılama özellikleri ve potansiyel olarak ekranda kullanılan küçük moleküller etkilenebilir florasan bir sonda kullanarak, hücresel Cı-di-GMP seviyeleri dolaylı ölçüm biyo-muhabir işlevleriyle. Teğetsel konusu hücre bazlı deney, hücre içi c-di-GMP seviyelerindeki değişikliklerin arkasındaki mekanizma ile ilgili herhangi bir bilgi veren bir gerçektir. Bu nedenle, deneylerden elde edilen önemli gözlemler bakterilerde hücre içi c-di-GMP dalgalanmaları ölçmek için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir yüksek performanslı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi yaklaşımı kullanarak teyit edilmelidir. Bakteri hücreleri (in vivo) ana bağlamında yetiştirilen Bunun yanı sıra, prosedür, sadece, in vitro büyümüş bakteriler davranışı ile ilgili bilgi sağlar hızla nedeniyle bu ortama faaliyetlerini değiştirin. Ayrıca, GFP bioreporter kullanarak işlem ekranı almaz anlamına gelirbakteri hücrelerinin dikkate fizyolojik durum. Bununla birlikte, iletişim kuralı ekran boyunca ayrı ayrı kuyuların mikroskopik izlenmesi için adapte edilebilir. Hatta bu hususlar ve kısıtlamalarla, bu yüksek verimli bir deney de hücre içi c-di-GMP seviyeleri müdahale edebilen küçük moleküller için sağlam bir ekrandır. pek çok bakteriyel patojenler de dahil olmak üzere bir çok mikrobik tür hücre içi c-di-GMP seviyeleri modülasyonunu karakterize edilmesi için incelenmiştir için, protokol, çeşitli bakteri türlerinin uygulanır ve daha karmaşık olabilir çoklu bakteri modellerinin çalışma genişletilebilir. Deney kolay büyüme koşulları kullanılabilir veya farklı bioreporters kullanarak diğer çıkış almak için adapte edilebilir değiştirerek, diğer bakteri türleri için optimize edilebilir. Farklı inkübasyon süreleri ilgi büyüme aşamasına bağlı olarak uygulanabilir. ölçeklendirme veya through-put artan Ancak, bu importan olduğunu<html> t bakteriler hala plaka hazırlıkları ve okuma-out ölçümler sırasında büyümeye devam edecektir akılda tutulması gereken. Bu nedenle, bu protokol kullanılarak bir seferde 15 plakaların en fazla taranması tavsiye edilmektedir. Ayrıca, birden fazla 384 kuyuları ile plakaları kullanılarak daha fazla optimizasyon gerektiren, düzgün büyümeyi izin vermeyebilir. plakaların sayısını aşağı ölçekleme zaman, el elektronik pipet yerine sıvı taşıma robotu kullanarak aşılamak için daha uygun olabilir. Protokol, anti-biyofilm bileşikler, c-di-GMP sinyalizasyon müdahale göz önüne alındığında, biyofilm dağıtmak küçük moleküller araştırmak için kullanılan olabilir açıktır. protokol aynı zamanda bakteri fizyolojisi çeşitli yönlerini anlamak için redeveloped olabilir. Verilen c-di-GMP sinyal biz onların çalışma mekanizmaları, c-di-GMP sinyalini ihtiyaç olup olmadığını belirlemek için farklı kimyasal uyaranlara belirleyebilir bu protokolü kullanarak bu organizmaların fizyolojileri inceleyerek, çoğu bakteri yaygındır. _content &quot;&gt; Özetle, bu protokol sunulan yaklaşımın sağlamlığı ve çok yönlülük c-di-GMP birçok biyolojik sistemlerde sinyalizasyon kimyasal modülatörlerinin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.

klinik olarak önemli antibiyotiklere karşı bakteriyel direnç hızla gelişmesi şu anda dünya çapında sağlık çalışanlarının karşılaştığı temel sorunlardan biridir. Geleneksel antibiyotikler Bu başarısızlık virülans ve hastalığın ilerlemesi 1 katılan bakteriyel süreçler engelleyebilir kimyasal madde için yeni arayışları sürdü. Kullanan böyle bir düzenleyici sistemin hücre içi di-GMP (c-di-GMP) son zamanlarda umut verici geçerlilik 2-4 ile bir hedef haline gelmiştir halkalı ikinci haberci. Küresel ikinci haberci sinyal molekülü antibiyotik direnci, yapışma, biyofilm oluşumu ve hastalık 2-4 gibi birçok fonksiyonlarını düzenler tespit edilmiştir. Artık, bakteriyel hücrede Cı-di-GMP hücresel düzeyde GTP iki molekül GGDEF etki alanı içeren diguanylate siklazlar (KEGM) wh C-di-GMP sentezlenmesi için kullanılmaktadır, böylece sentez ve indirgenme ile kontrol edilir anlaşılmalıdırereas Cı-di-GMP bozulması EAL veya HD-GYP alan ya sahip fosfodiesterazlar (PDE&#39;ler) tarafından katalize edilir ((3 gözden, 5)). Bu alan ihtiva eden proteinler, sıklıkla Cı-di-GMP devir etkinliklerini çevresel veya hücre ipuçları 3,5 ya doğrudan ya da dolaylı olarak düzenlendiğini düşündürmektedir diğer sinyal alanları içerir. Sonuç olarak, c-di-GMP bakteriyel fenotipe değişikliklere farklı çevresel ipuçlarını algılama bağlamak için fonksiyonları sinyal. Cı-di-GMP çeşitli mekanizmalarla 4 transkripsiyon, post-transkripsiyon ve translasyon sonrası seviyesinde bakterilerde düzenleyici etki gösterir. Birçok bakteriyel hücrelerde c-di-GMP önemli bir etkisi biyofilm hücreli yapılar yüzeylerine bağlanmış veya organize hareketli planktonik hücreler ve sesil hücreler arasındaki geçişlerin kontrolünde, özellikle de bakteriyel &#39;yaşam tarzı&#39; ve belirlenmesinde olan 3,5. Genel olarak, yüksek bir gözenekdüşük hücresel düzeyleri pek çok bakteriyel patojenler 3,5 hareketlilikten ve hastalık oluşturma faktörü sentezi teşvik ederken Cı-di-GMP seviyeleri, biyofilm ve sessility ile ilişkilidir. Böylece, c-di-GMP sinyalizasyon çalışmalarının daha ayrıntılı bilgi bakteriyel patojenler biyofilm oluşumu ve virulans engellenmesi için stratejiler göze olabilir. Bu birçok bakteriyel genomları GGDEF, EAL ve / veya HD-GYP etki (örneğin P. aeruginosa 40 proteinleri vardır) ve çoklu etkileyiciler 6,7 ile çok sayıda proteinleri kodlayan verilen yıldırıcı bir iştir. Ancak, bu bile karmaşıklığı ile, son kanıtlar c-di-GMP sinyalini manipüle stratejiler antibiyotiğe dirençli enfeksiyonlar gelişmekte önlemek veya klasik antibiyotik 2 birlikte uygulanması ile bağışıklık sistemi ya da etkin tedaviye onları duyarlı hale birine geliştirilmiş olabileceğini düşündürmektedir. Buna paralel olarak, bu deneysel yapay bir azalma ortaya konmuşturin vitro -grown P. hücre içi c-di-GMP aeruginosa P. ise, biyofilm oluşumunu azalmış ve antimikrobik yatkınlığın artmasına yol açar farelerin peritonal boşluğuna bulunan silikon implantları aeruginosa yedirilerek biyofilm, benzer bir şekilde 8-11 dağıtılabilir. Burada, potansiyel olarak P. hücresel Cı-di-GMP seviyesini modüle küçük moleküller taranması için yüksek verimli, flüoresan bazlı raportör analizini tarif aeruginosa (Şekil 1). Deneme Bulunan: C-di-GMP sentezleme transkripsiyonel Cı-di-GMP-duyarlı cdrA promoteri 12 bağlı olan, daha önce geliştirilmiş GFP raportör kullanılarak, hücresel seviyelerinin ölçülmesi esasına dayanır. Bu protokol, P. raportör yapısının ekspresyonu için bir metodoloji tarif eder Çevrede aeruginosa ırk, levha bileşik hazırlama, biz olarak 384 oyuklu plakalar, büyüme koşulları içine kültür aşılamaVeri toplama, yönetim ve analiz (Şekil 1) ile ilgili ayrıntılar olarak ll. Genel olarak, bu protokol bakterilerde sinyal c-di-GMP hedefleyen yeni bileşikler tespit potansiyel araştırmacıları yardım ve araştırma kullanılmak üzere P. biyolojisini anlamaya yönelik olacak aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Lysogeny Broth (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth with Agar (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer</td><td>Thermoscientific</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>2 mm gap electroporator cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>BioRad GenePulser XCell electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Leica Fluorescent Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384-well, white-walled, clear-bottom plates</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi reagent dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi tubing</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II 16-channel electronic pipette</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>100 ml sterile disposable reagent reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal air-permeable membranes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MKBQ1886</td><td></td></tr><tr><td>Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa

Geleneksel bakterilerin antibiyotik direncidir yeni keşfedilen düzenleyici yollardaki yeni ilaç hedeflerini tanımlamak için araştırma girişimleri tahrik etmiştir. İkinci haberci olarak hücre içi siklik di-GMP (c-di-GMP) kullanan düzenleyici sistemlerin hedef böyle bir sınıf vardır. c-di-GMP antibiyotik direnci, biyofilm oluşumu ve virulans dahil süreçleri geniş bir yelpazede düzenleyen davranır hemen hemen tüm bakterileri bulunan bir sinyal molekülüdür. c-di-GMP antibiyotiklere dirençli biyofilm gelişimi kontrol yönlerini sinyalizasyon nasıl anlayış nükleotid veya bu sinyal yollarının bozulması hücresel konsantrasyonlarının değişiklik azaltılmış biyofilm oluşumu veya antibiyotiklere biyofilm artan duyarlılık yol açabilir sayede yaklaşımlar önerilmiştir. Yeşil floresan proteini ekspresyonu Cı-di-GMP tepkimeli yükseltici cdrA kontrolü altındadır (GFP), göre, basit bir yüksek verimli bioreporter protokol açıklarPseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) c-di-GMP hücresel seviyelerinin modüle edilmesi için potansiyele sahip küçük moleküller için hızlı bir şekilde taramak için. Bu basit protokol 48 saat içinde yukarı 3.500 bileşiklerin taranması ve çoklu mikroorganizmalar adapte edilmesi yeteneğine sahiptir.

Burada anlatılan yaklaşım verimli ve başarılı bir 48 saatlik süre içinde 3.500 bileşiklerin ortalama ekrana tek bir araştırmacı sağlar. Yüksek verimli bir tarama protokolü bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de, bir akış şeması tasvir edilmiştir. Mevcut madde sağlamak için, 600 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde potansiyel Cı-di-GMP modüle bileşikler için üstünlüğü beş uyumlu bir bileşik kütüphanesi taranmıştır . Bununla birlikte, deneyde kullanılacak olan, bileşik setleri gibi pek çok ticari olarak temin edilebilir, ilaç benzeri ve ilaçsız vardır. Bu takımlar bakteri odaklı bileşikler ya da rastgele havuza bileşikleri olabilir ama her kütüphane polar fonksiyonel gruplar ve birden fazla stereojenik merkezler sahip Burada filtrelenmiş grubu olarak, atanan fizikokimyasal özellikleri ve karakteristikleri esas olur. Bu protokol, bakteri boyunca bileşikler ile levha, bir antibiyotik pozitif kontrol ve bir DMSO araç içine aşılanırKontrol, Şekil 2&#39;de gösterilen düzenine göre yöntem. 3, tek bir kütüphane plaka ile örneklenen ana tarama sonuçlarını tasvir etmektedir. Örnek OD 600 ve GFP ham veriler, sırasıyla Şekil 3A ve 3B&#39;de gösterilmiştir. Yüksek OD 600 / GFP değerlerine düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Isı haritaları düşük OD uzanan bir 3-Renk skalası koşullu biçimlendirme uygulayarak bir tablo yazılımında oluşturulan 600 / GFP Okuması en yüksek OD 600 / GFP okuması kadar. DMSO negatif kontrole göre yüksek değerler, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri bir promosyon uygun ise DMSO negatif kontrole göre düşük OD 600 ve GFP değerleri, büyüme ve Cı-di-GMP seviyeleri inhibisyonuna karşılık . OD 600 ve GFP ar için sağlam z &#39;değerlerie protokolü (5.1) sağlanan formüle göre hesaplanır. onlar 0.5 (sırasıyla 0.694 ve 0.761) hem de yukarıda olduğu için, deney kalitesi sağlam görüldü ve veriler ayrıca analiz edildi. Büyüme (OD 600) ve hücre içi c-di-GMP seviyesinin (GFP)% İnhibisyon Protokolü (5.2, 5.3) temin formüllerle hesaplanır. Temsili veriler sırasıyla Şekil 4A ve 4B gösterilmiştir. yüksek% inhibisyonuna düşük gösteren sıcak (kırmızı) ile renk degrade ısı haritası, soğutmak için (yeşil) renk, iyi değerlerine uygulanmıştır. Birinci eleme göre ayrı ayrı oyuklanndan% inhibisyon (OD600 / GFP) saçılma grafiğidir Şekil 5A&#39;da çizilen sırasıyla OD 600 ve GFP veri 5B. ±% 50 kesme (noktalı çizgiler ile gösterilmiştir) isabet tespiti için seçilir. Bu cut-off dayalı potansiyel hit kırmızı noktalar ile gösterilir. ilgi çekici bir bileşik iki tür d edilebilirtahlilinden iscerned. Şekil 5B&#39;de belirtilen isabetler potansiyel Cı-di-GMP hücre içi düzeylerini düzenleme yeteneğine sahip olan bileşikler, ise Şekil 5A&#39;da tanımlanan isabetler, bakteriyel büyümeyi inhibe eden bileşiklerdir. İki bileşikler bu deney için Örnek isabetler olarak tespit edilmiştir. Bu bileşik A, potansiyel bir büyüme önleyicisi ve bileşik B, potansiyel bir Cı-di-GMP inhibitörü. Bileşik A, Şekil 3&#39;te de F8 tekabül ve 4 büyümesinde% 72.5 inhibisyon vardı. siklik di- GMP seviyeleri beklenen karşılık gelen önlendi. Bileşik B, Şekil 3 de K3 tekabül 4 ve büyüme herhangi bir değişiklik siklik di- GMP seviyeleri% 61 önlemesine sahiptir. Seçin isabet bileşikleri bundan başka, 2 mM ve iki katlı bir seyreltme serisi üstten konsantrasyonu ile 10 noktalı doz-yanıt yöntemi ile test edildi. IC50 değerleri doz-yanıt dayalı hesaplanıreğrileri (Şekil 6A ve B). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> Şekil 1. Genel: P. c-di-GMP Hücresel Seviyeleri modüle Onların Potansiyeli Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur aeruginosa. Bu genel bakış Bu testte kullanılan protokolün adım adım bir temsilini göstermektedir. P. bir bakteri kolonisi aeruginosa LB başlatıcı kültür içinde bir gece boyunca yetiştirilir. Reaktif dağıtıcı kullanılarak, hücreler, seçilen bileşikleri ihtiva eden, 384-gözlü plakalara aşılanır. Plakalar OD 600 ve GFP değerleri ölçülmüştür sonra 6 saat daha kuluçkalanmıştır. Bu okuma-çıkışları, tespit edilebilir c-di-GMP hücresel düzeylerini etkileyen bileşikler kullanılarak. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . Şekil 2. Testi Tarama Küçük Molekül için kullanılır bir 384-Plate Harita kitaplığı (açık mavi) gelen bileşikler kuyular A1 bölünür - P22. DMSO kuyu A24 eklenir% 1 bir son konsantrasyon ihtiva eden P23 ve &quot;Negatif kontrol&quot; (yeşil) - &quot;Pozitif kontrol&quot; (kırmızı) 50 ug / ml tobramisin sülfat kuyu A23 eklenir ug bir son konsantrasyonda oluşan - P24. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> Bir 384-iyi Eleme Plate için Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Representative ham veri OD 600 (A) ve GFP (B) içindir. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD 600 = 0.65 veya GFP = 250.000) soğutmak için (Yeşil: 600 = 0.10 veya GFP = 40,000 OD) yüksek değerlere düşük gösteren renkler, iyi değerlerine uygulanmıştır. DMSO kontrolü göre daha yüksek OD 600 / GFP okumalar var kuyular yeşil olma eğiliminde ise DMSO negatif kontrol alt OD 600 / GFP okumaları akrabası olması kuyular kırmızı olma eğiliminde olacaktır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> 384 plaka için hesaplanan engelleme yüzdesi Şekil 4. Örnek Sonuçlar. Analiz% Önleme verileri, OD 60 her ikisi de temsil edilir0 (A) ve GFP (B) okumaları. Sıcak olan bir renk degrade ısı haritası, (Kırmızı: OD 600 = -150% veya GFP = -20%) (Yeşil: OD 600 =% 100 veya GFP =% 100) soğutmak için renkler, yüksek inhibisyon değerleri düşük gösteren olmuştur kuyu değerlerine başvurdu. Potansiyel büyüme ve hücre içi engelleyen küçük moleküller, c-di-GMP potansiyel büyüme ve hücre içi c-di-GMP düzeylerini desteklemek, küçük moleküller kırmızı olma eğiliminde ise yeşil olma eğiliminde olacaktır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">Tıklayınız daha büyük bir versiyonunu görmek için bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> Her test Küçük Molekül. Her küçük molekülün Elde Edilen% inhibisyonu (OD600 / GFP) Şekil 5. Temsilcisi Dağılım Arsalar bir nokta ve% inhibisyon dağılımı ile temsil edilirOD 600 (A) ve GFP (B) her biri için okumaları gösterilmiştir. A ±% 50 cut-off isabet belirlenmesi için seçilir. Potansiyel hit kırmızı vurgulanır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> Bir doz, Şekil 6. Örnek Sonuçları -., Önceki ekranlarından tanımlanan yanıt Deney iki bileşik (potansiyel büyüme inhibitörü A ve potansiyel Cı-di-GMP inhibitörü B) ayrıca 2 üstten bir konsantrasyon ile 10 noktalı doz-yanıt deneyinde test edilir mM ve iki-kat seyreltme serisi. 158 uM ve 193 uM arasında IC50 değerleri, sırasıyla veri dört parametreli bir lojistik fonksiyonun verim ile elde edildi takılması. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ase bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

establishment-high-throughput-setup-for-screening-small-molecules

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

8.4K Görüntüleme.  University of Dundee.  Bu makalede, başarılı antibakteriyel ilaç keşfi ve bileşik testi için yeni bir güçlü bir araç sağlayarak, Pseudomonas aeruginosa siklik di-GMP hücresel seviyelerini işlemek için potansiyel yeteneği küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranması amacıyla kurulmuştur yüksek verimli deneyi anlatır. 

Video: Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Biyomühendislik

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Yüksek Verimli Ekran Metagenomic Kütüphaneler selülaz Aktivitesi Biomining

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biyoloji

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

4B Sistein Peptidaz Otofaji İnhibitörü için Yüksek Verimli Tarama Analizi

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins is a prerequisite for therapeutic strategies targeting this pathway. Inhibition of the autophagy protease ATG4B has been shown to increase overall survival, suggesting that ATG4B could be a potential drug target for cancer therapy. Our laboratory has developed a selective luciferase-based assay for monitoring ATG4B activity in cells. For this assay, the substrate of ATG4B, LC3B, is tagged at the C-terminus with a secretable luciferase from the marine copepod Gaussia princeps (GLUC). This reporter is linked to the actin cytoskeleton, thus keeping it in the cytoplasm of cells when uncleaved. ATG4B-mediated cleavage results in the release of GLUC by non-conventional secretion, which then can be monitored by harvesting supernatants from cell culture as a correlate of cellular ATG4B activity. This paper presents the adaptation of this luciferase-based assay to automated high-throughput screening. We describe the workflow and optimization for exemplary high-throughput analysis of cellular ATG4B activity.

Yazar Spotlight: Hücrelerde ATG4B 27 Aktivitesini İzlemek için Seçici Luciferaz Tabanlı Bir Test 

Here, we describe a detailed protocol for the use of a luciferase-based reporter assay in a semi-automated, high-throughput screening format.

Otofaji ile İlişkili 4B Sistein Peptidaz İnhibitörleri için Hücre Bazlı İlaç Taraması

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler