We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).

הערה: נהלי שיבוט וטרנספורמציה של פלסמיד הכתב המטוהר ג-di-GMP הם דנו במקום אחר 12. הדור 1. של GFP Tagged ג-di-GMP Reporter פ זני aeruginosa <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל של מרק lysogeny (LB) בינוני עם מושבה אחת של פ aeruginosa ו דגירה לילה בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של תרבות הלילה לתוך 200 מ&quot;ל של מדיום LB טרי בבקבוק 1 ליטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) כל 30 דקות על ידי נטילת דגימה 1 מ&quot;ל מהבקבוק ולבחון באמצעות ספקטרופוטומטר (כמתואר 12 בעבר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 מגיע בין 0.3 - 0.5, להציב 40 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בסל&quot;ד 8000 עבור 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant ו rדואר להשעות את התאים ב 40 מ&quot;ל של קר כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים פעם שנייה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 20 מ&quot;ל של תמיסת קרים כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים בפעם אחרונה על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 1.5 מחדש להשעות ב 400 μl של פתרון קר כקרח, סטרילי, 300 מ&quot;מ סוכרוז. הערה: צפיפות התאים בשלב זה צריכה להיות כ 1 x 10 11 מושבה יחידה להרכיב למיליליטר (CFU / ml). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל את התאים על קרח למשך 30 דקות, לאחר מכן הם מוכנים electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של פתרון 12 פלסמיד C 0.2 מיקרוגרם / μl pCdrA :: GFP 40 μl של פ אלקטרו המוסמכת תאים aeruginosa מוכן לעיל בצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל כי כבר מראש מקורר על הקרח. מערבבים את ההשעיה ולהעביר לתוך הפער אלקטרודה מראש צונן, 2 מ&quot;מ, קובט electroporation. הערה: pCdrA :: GFP </em&gt; C: pUCP22Not-P cdrA -RBSII- GFP (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, אשר נותן ההודעה הניאון של רמת תאיים של c-di-GMP ב פ זני aeruginosa, פותחו ומאומתים על ידי Rybtke et al. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחות בחלק החיצוני של קובט עם נייר טישו והמקום קובט לתוך תא מדגם של electroporator. דופק עם מתח של 2.5 kV, קיבול של 25 μF והתנגדות של 200 Ω. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קובט ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום LB. ואז, להעביר את התאים צינור סטרילי 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge ו דגירה של שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 10 μl, 50 μl ו 100 aliquots μl של התרבות לצלחות סטרילי LB-אגר בתוספת אמפיצילין (בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את הביטוי GFP (excitatiעל ב 485 ננומטר, פליטה ב 520 ננומטר) על ידי בחינת הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערוץ GFP סטנדרטי פיק מושבה אחת לחסן 5 מיליליטר LB. דגירה לילה כפי שמתואר בשלב 1.1. מערבבים 0.5 מ&quot;ל של תרבות לילה עם 0.5 מ&quot;ל 50% גליצרול בתוך 2 מ&quot;ל בורג הצינור העליון ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. הכנת תרבות Starter עבור חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ימים לפני המסך, צלחת פ זן aeruginosa (המכיל את pCdrA :: פלסמיד C GFP) מ -80 מעלות המניות C לצלחת LB-אגר (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) על ידי הפצת חיידקים בעדינות על הצלחת באמצעות חיסון סטרילי לוּלָאָה. דגירה את צלחת הלילה ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערב לפני ההקרנה, לחסן מושבה אחת של פ aeruginosa מהצלחת לתוך 10 מ&quot;ל של מדיום LB (בתוספת אמפיצילין בריכוז של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בתוך tuלהיות דגירה לילה-תרבות טרום ב 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של המסך, להכין תת מן מראש תרבות הלילה על ידי דילול זה הראשון עם מדיום LB טרי ל OD 600 של 1.0 ולאחר מכן דילול נוסף עם 5% LB כדי OD 600 של 0.04 (01:25 יחס) . הערה: הנפח הכולל של המדיום המחוסן תלוי במספר הצלחות להיבדק. 5% LB נעשית על ידי דילול 100% LB עם בופר פוספט (PBS) לריכוז הנדרש. חשוב לציין, התקשורת (5% LB) מאפשרת הפעלה מכוננת של pCdrA :: C GFP ב פ aeruginosa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת בר בוחש מגנטי סטרילית לתוך המיכל ומערבבים התרבות במהירות מינימלית על בוחש מגנטי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המאפשר לחיידקים להתאקלם התקשורת לפני שהם לוותר לתוך 384 גם הצלחות. </li></ol> 3. הרכבת חיסון דגירה של צלחות 384-היטב המכילותמולקולות קטנות הערה: עקרות וטכניקות ספטית טובות הן ערכים חשובים מאוד השלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את השליטה חיובי (100% עיכוב), להוסיף 20 סולפט tobramycin μl (25 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עד ​​10 מ&quot;ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הבקרה החיובית לתוך בארות A23 - P23 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הביקורת השלילית (0% עיכוב), להוסיף 30 sulfoxide דימתיל μl (DMSO) עד 10 מ&quot;ל (מתאימה עד 12 צלחות) של תת מוכן בשלב 2.3 ומערבבים בעדינות. פיפטה 40 μl של תרבות הביקורת השלילית לתוך בארות A24 - p24 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אחת הצלחות חותמת עם מולקולות קטנות, לחסן בהיקף של 40 μl של תרבויות לילה מדולל (המתואר בשלב 2.3) לתוך A1 בארות - P22 (איור 2). הערה: זו יכולה להיות מושגת באמצעות מטפל נוזלי לשדודot. בשל המאפיינים הטרוגנית של תרבויות חיידקים, חשוב לשמור על תסיסה מתמדת ומתונה לשמור חיידקים מופצים באופן עקבי בתקשורת תוך מחלק. כדי לעשות זאת, לשמור על ערבוב התרבות התאקלמה משלב 2.4 מגנטי במהלך מהחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחות עם חותם חיפוי אווירי חדיר דגירה במשך 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: החותם חדיר-האוויר הוא קריטי כדי לשמור על תנאים משתנים בכל 384 בארות וכדי לעקוף את פיתוח הפוטנציאל של הדרגתיים חמצן על פני הצלחת. </li></ol> מדידת 4. של צמיחה (OD 600) ו תאי ג-di-GMP רמה (GFP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -30 דקות לפני מדידת spectrophotometric, מראש לחמם את קורא הצלחת ל -37 ° C כדי למנוע התעבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את חותם כיסוי חדיר-האוויר לפני הקריאה. מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטבזמן שיקוע של 0.2 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מדידת קרינה, לעשות רווח אוטומטי וכוונון מוקדי המבוסס על טוב A24 (שליטה שלילית) ולהגדיר את ערך יעד הרווח ב 75% (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך תוכנות שליטה קוראת צלחת, לחץ על מדידת התחלה ולחץ על &#39;&#39; פוקוס התאמת הרווח / פלייט מזהה &#39;&#39; כרטיסייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבחירה &#39;&#39; התאמת מוקד &#39;&#39; ו &#39;&#39; &#39;ערוץ&#39; &#39;בצד ימין על החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;&#39; התאמת רווח &#39;&#39; ו &#39;&#39; נבחר גם &#39;&#39;, ו סוג ב &#39;&#39; 75 &#39;&#39; כ &#39;&#39; ערך יעד &#39;&#39;. לבסוף, לאסוף גם A24 בפריסת הצלחת לפני הלחיצה על &#39;&#39; התחל כוונון &#39;&#39;. לאחר ההתאמה מתבצעת, לחץ על &#39;&#39; התחל מדידה &#39;&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה מן הכתב GFP תמורת מקסימום עירור / פליטה של ​​485/520 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לכל היטב settling זמן של 0.2 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נתונים מכל הלוחות שנבדקו. הערה: קריאות נתונים נשמרות אוטומטית כברירת מחדל על ידי תוכנות שליטה קוראת צלחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות צפו על ידי לחיצה על סמל &quot;מאדים&quot; בתוך תוכנות שליטה כדי לפתוח את חבילת הניתוח הסטטיסטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר נתונים על ידי &quot;לחיצה כפולה&quot; על מספר לוחית עניין לגשת לנתונים לניתוח. </li></ol></li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את אחידות השחזור של assay באמצעות הניתוח &quot;Z החזק, המהווה את מדדי איכות הנפוצות ביותר שדווחו עבור מסכי תפוקה גבוהה. חישוב z החזק &#39;באמצעות הנוסחא: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> איפה MAD (סטיית מוחלט חציון) היא אומדן של סטיית התקן, p היא הבקרה החיובית (100% עיכוב) ו- n היא השליטה השלילית (עיכוב 0%) הוא 600 OD ו נ GFPalues. הערה: assay עם ערך z &#39;חסון (שחושב הן 600 OD נתונים גולמיים GFP) גדול או שווה ל -0.5 נחשבת כסוג של assay מצוין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב% עיכוב הצמיחה באמצעות הנוסחה: <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> איפה Xi OD600 הוא הערך איטרטיבית OD 600 של כל דגימה היטב. % עיכוב OD600&gt; 0, מעכב צמיחה; עיכוב% OD600 &lt;0, מעודד צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את עיכוב% מרמת תאיים של c-di-GMP באמצעות הנוסחא (השינוי ביחידות עוצמת קרינה שרירותית מתוקנים לשינוי צפיפות תאים): <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> איפה Xi GFP הוא הערך GFP איטרטיבית של כל דגימה היטב. % עיכוב GFP&gt; 0, c-di-GMP מעכב; % &amp;# 160; עיכוב GFP &lt;0, האמרגן ג-di-GMP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גדר סף לגילוי להיט 3 MAD מן החציון (חציון ± 3 MAD), מחושב מן המדגם גם לקריאה קטנה של כל צלחת, בהנחה של התפלגות נורמלית של נקודות נתונים. הערה: עם זאת, עיכוב ± 50% חתוך ניתן לבחור עבור מבחני מנה תגובה יותר לשחזור מדויק במידת הצורך. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recover+the+lost+art+of+drug+discovery.">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li><li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling:+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation?.">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?.</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li><li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria.">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li><li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+the+PilZ+don't+work:+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria.">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li><li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+di-GMP:+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger.">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li><li> Boyd, C. D., GA, O. '. T. o. o. l. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation:+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems.">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li><li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa.">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li><li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria.">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li><li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles.">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation.">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li><li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development.">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li><li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

על מנת לשפר את הטיפול של זיהומים חיידקיים, ברור כי הבנה טובה יותר של התנהגות חיידקים ברמה הרגולטורית המולקולרית נדרשה. ההליך המתואר כאן יהיה מועיל עבור מיקרוביולוגים, ביוכימאים וקלינאים שרוצים לחשוף מולקולות קטנות כי יש פוטנציאל להשפיע או להפריע ריכוזי הסלולר של c-di-GMP בחיידקים. השיטה משתמשת bioreporter GFP שפותח לאחרונה לעקוב אחר רמות סלולריות של c-di-GMP ב פ aeruginosa 12. bioreporter זה יאומת והראה חשוב לא להשפיע על הצמיחה של הזן משמש כאשר בתרבית 5% LB ב PBS. שימוש מסך כל תא לזהות מולקולות קטנות שמשנה רמות ג-di-GMP in vivo מתגבר על הקשיים הגדולים של גילוי תרופות מבוסס יעד מבחינת חדירת מולקולות דרך הממברנות חיידקי, במיוחד באמצעות אלה של חיידקים גראם שליליים . חשוב לציין, לאהוא assay מופיע מאוד חזק כערך z &#39;חזק באופן עקבי מעל 0.5 נצפה בכל המסכים עד כה. הקרנת שימוש בפרוטוקול זה יגלה מספר מולקולות קטנות המעכבות ו / או לקדם רמות ג-di-GMP תאיים P. aeruginosa. יתר על כן, assay זה גם יש פוטנציאל לזהות bactericidal או תרכובות בקטריו וכתוצאה מכך לירידה-אאוט לקרוא OD 600. למרות שלא נדונו בסעיף הפרוטוקול, ישנם מספר שיקולים חשובים לעריכת הניסוי. זה חיוני לזכור כי bioreporter GFP מבוסס על פלסמיד. למרות פלסמיד הכתב ידוע להיות יציב מאוד פ aeruginosa, זה יכול ללכת לאיבוד אחרי מחדש ציפוי רציף, ומכאן הצורך להשתמש זנים מצופים טרי מתוך -80 ° מניות גליצרול C, ובדיקת ביטוי קרינה היא קריטית. זה גם מאוד יקר כדי לשמור על תנאי צמיחה אחידים על פני המסךשכן תנודות כל בתנאים האמורים עלולה להיות תוצאות-לוואי על המסך. זה יכלול ביצוע מסוים כי תקשורת ואנטיביוטיקה הן תערובת של עוגיות נצווה בשימוש לאורך הקורס של המסך. תרביות חיידקים לא גדל (מבוסס על OD 600 לקריאת פסקים) באופן אחיד הוא בעיה נפוצה עבור מסכי תפוקה הגבוהה ביותר מסוג זה. זה יכול להיות בגלל קצה אפקטים או מחלק תרבות חיידקים הלא הומוגנית לתוך הצלחות. לקבלת לשעבר, מוודא חותם גז חדיר משמש במהלך הדגירה הוא חיוני. בעוד באפשרות השנייה, תחול צינורות מטפל הנוזליים עם נפח של התרבות לפחות שלוש פעמים את הנפח המת של הצינור עצמו מומלץ. זה חיוני כדי לשמור על בוחש מגנטי במהירות מינימלית במהלך מחלק. תוך מעקב ואחסון של 384 גם הצלחות לצמיחה עקבית במהלך הניסויים הוא בעל חשיבות עליונה, מצב שיש להימנע ממנו הוא הערמה של צלחות במהלך הדגירה כפי שהוא יכול לגרום unרציתי הדרגתי חמצן מוביל להטות את דפוס הצמיחה. כמו כן, חשוב להבטיח כי רכב DMSO משמש כביקורת שלילית אינו משפיע צמיחה שלילית של הזן של עניין. רבים של בעיות אלה הקשורים צמיחה יכולים להימנע על ידי ביצוע מסך מדומה עם זן החיידקים של העניין לפני ההקרנה. פרשנות נתונים גם שיקול לגופו בהתחשב בעובדה תוצאות עיכוב c-di-GMP מחושבים על ידי השינוי ביחידות עוצמת הקרינה שרירותית כי יש לתקן לשינוי צפיפות התאים. עם זאת לזכור נוסחאות מתמטיות שונות על מנת להעריך את התפוקה נתונים מניסויים אלה צריך להיות גם נחשב. לדוגמא, תרכובת יכולה להופיע כמעכב ג-di-GMP אבל בעצם להיות מעכב צמיחה או להיפך, שמצריכה פרשנות זהירה של נפילות. ישנם מספר חסרונות ומגבלות כי יש לקחת בחשבון במהלך הפיתוח והביצוע של זהתפוקה גבוהה מבוסס תאי מסך. לדוגמה, פונקציות-הכתב ביו על אמצעי עקיף של הסלולר רמות ג-di-GMP באמצעות בדיקה ניאון שתכונותיו זיהוי עלול להיות מושפע מולקולות קטנות ששימשו מסך. סוגיה משיקה היא העובדה כי assay מבוסס התאים נותן שום מידע לגבי המנגנון עומד מאחורי שינויים ברמות-di-GMP ג התאי. לכן, תצפיות חשובות מניסויים יש לאשר באמצעות גישת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית בעל ביצועים גבוהים, אשר נחשבת השיטה &quot;-תקן זהב&quot; למדידת תנודות תאיות ג-di-GMP בחיידקים. יתר על כן, ההליך שלנו יכול לספק מידע רק לגבי ההתנהגות של חיידקים הגדלים במבחנה, כמו תאי חיידקיים גדלו בהקשר של המארח (in vivo) מהר לשנות את פעילותם בשל בסביבה זו. יתר על כן, התהליך של שימוש GFP bioreporter אומר המסך אינו לוקחבחשבון את המצב הפיזיולוגי של תאים חיידקיים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם ניטור מיקרוסקופי של בארות בודדות במהלך המסך. אפילו עם שיקולים אלה ומגבלות, assay תפוקה גבוהה זה עדיין מסך חזק מולקולות קטנות של מסוגלות להפריע רמות ג-di-GMP תאיים. מאז מינים של חיידקים רבים, כוללים חיידקים פתוגנים רבים נחקרו על מנת לאפיין את האפנון של רמות ג-di-GMP התאיים, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על מיני חיידקי מגוונת התרחב המחקר של מודלי חיידקי multispecies מורכבים יותר. Assay יכול להיות מותאם בקלות עבור מיני חיידקים אחרים על ידי שינוי תנאי הגידול בשימוש, או יכולים להיות מותאמים לקרוא פלטים אחרים באמצעות bioreporters השונה. פעמי דגירה שונות ניתן ליישם תלוי שלב הצמיחה של עניין. עם זאת, כאשר בגמלון או באמצעות הגדלה-פשוט, היא importan<html> t לזכור כי החיידק עדיין יהיה גדל במהלך הכנות צלחת ומדידות לקריאה החוצה. לכן מומלץ להקרין לכל היותר 15 צלחות בכל פעם, באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, באמצעות צלחות עם יותר מ 384 בארות לא יכול לאפשר צמיחה אחידה, מחייב אופטימיזציה נוספת. כאשר קנה המידה את מספר צלחות, זה עשוי להיות מתאים יותר כדי לחסן באופן ידני באמצעות פיפטה אלקטרונית במקום רובוט טיפול נוזלי. ברור כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור מולקולות קטנות לפזר biofilms, בהתחשב בכך תרכובות אנטי biofilm להפריע איתות ג-di-GMP. הפרוטוקול יכול גם להיות ושפץ להבין היבטים שונים של פיזיולוגיה חיידקי. בהתחשב האיתות כי ג-di-GMP נפוצה ברוב החיידקים, על ידי לימוד physiologies של אורגניזמים אלה באמצעות פרוטוקול זה אנו יכולים לזהות גירויים כימיים שונים כדי לקבוע אם או לא מנגנוני המפעילים שלהם דורשים איתות ג-di-GMP. _content &quot;&gt; לסיכום, את האיתנות צדדיות של הגישה המוצגת בפרוטוקול זה יסייע בזיהוי מאפננים כימיים של c-di-GMP איתות במערכות ביולוגיות רבות.

ההתפתחות המהירה של עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה נגד חשיבות קלינית היא אחת הדאגות הגדולות כיום בפני אנשי מקצוע בתחום בריאות ברחבי העולם. כשל זה של אנטיביוטיקה מסורתית העלה חיפושים חדשים לצורך עניין כימי שיכול להפריע לתהליכי חיידקים מעורבי התקדמות הארסית ומחלות 1. אחת מערכה רגולציה כך מנצלת את השליח שני תאיים מחזורי di-GMP (c-di-GMP) הפכה לאחרונה יעד עם תוקף הבטיח 2-4. זה כבר נקבע כי מולקולת איתות השליח השנייה הגלובלית הזה מסדיר פונקציות רבות כולל עמידות לאנטיביוטיקה, הדבקה, היווצרות ביופילם ומחלות 2-4. הוא הבין עכשיו ברמה התאית של c-di-GMP של תא החיידק נשלטת בסינתזה והשפלה לפיה שתי מולקולות של GTP משמשים לסנתז ג-di-GMP ידי cyclases diguanylate תחום המכיל GGDEF (DGCs) ש&quot;שereas השפלה c-di-GMP מזורזת על ידי phosphodiesterases (PDEs) שיש בין כאדם EAL או תחום HD-גיפ (הנסקרת ב (3, 5)). חלבונים המכילים תחומים אלה בדרך כלל מכילים תחומי איתות אחרים, דבר המצביעים על כך פעילותם מחזור ג-di-GMP מוסדרת במישרין או בעקיפין על ידי רמזים סביבתיים או הסלולר 3,5. כתוצאה מכך, ג-di-GMP איתות פונקציות לקשר את החישה של רמזים סביבתיים מגוונים שינויי פנוטיפ חיידקים. ג-di-GMP מפעילה השפעה הרגולציה שלה בחיידקים ברמה של שעתוק, שלאחר שעתוק-תרגום פוסט ידי מנגנונים שונים 4. השפעה גדולה של c-di-GMP בתאי חיידקים רבים היא בקביעת חיידקים &#39;אורח חיים&#39;, ובמיוחד, בבקרה של מעברים בין תאי planktonic ניע ותאיים נייחים המחוברים משטחים או מאורגנים במבנים הרבים-תאיים של biofilms 3,5. באופן כללי, הסלולר גבוההרמות של C-di-GMP המשויכים היווצרות ביופילם ו sessility, בעוד שרמות הסלולר נמוכות לעודד תנועתיות וסינתזת גורם ארסי חיידקים פתוגנים רב 3,5. לפיכך, ידע מפורט יותר של אופן הפעולה של איתות ג-di-GMP יכל להרשות לעצמם אסטרטגיות עבור עיכוב של היווצרות ביופילם ו ארסי חיידקים פתוגנים. זוהי משימה מרתיעה בהתחשב בכך שרוב הגנום החיידקים לקודד חלבונים רבים עם GGDEF, EAL ו / או תחומי HD-גיפ (למשל פ aeruginosa למעלה מ -40 חלבונים) ומפעילים מרובים 6,7. עם זאת, גם עם המורכבות הזו, הראיות האחרונות עולה כי אסטרטגיות מניפולציה ג-di-GMP איתות ניתן פותחה כדי גם למנוע זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה פיתוח או להפוך אותם רגישים במערכת החיסונית או טיפול יעיל על ידי שיתוף מתן אנטיביוטיקה קלאסי 2. בקנה אחד עם זה, זה כבר בניסוי הראו כי ירידה מלאכותיתc-di-GMP תאיים במבחנה -grown פ aeruginosa מוביל ירד היווצרות ביופילם והגדילה את הרגישות antimicrobials, תוך פ biofilms -developed aeruginosa על שתלי סיליקון, ממוקם חלל הצפק של עכברים, ניתן לפזר באופן דומה 8-11. כאן אנו מתארים assay כתב תפוקה גבוהה, קרינה המבוססת להקרין מולקולות קטנות פוטנציאליים שיכול לווסת את רמות הסלולר ג-di-GMP ב פ aeruginosa (איור 1). Assay הוא מבוסס על מדידת ג-di-GMP רמות הסלולר באמצעות כתב ה- GFP שפותח בעבר שביטויים קשור תעתיק האמרגן ג-di-GMP-תגובת cdrA 12. פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ביטוי לבנות כתב ב פ זן של עניין aeruginosa, הכנת צלחת מתחם, חיסון התרבות לתוך 384 גם צלחות, תנאי גידול, כפי שאנוLL כפי לפרטים בדבר איסוף נתונים, ניהול וניתוח (איור 1). בסך הכל, פרוטוקול זה יסייע לחוקרים פוטנציאל לזהות תרכובות חדשות מיקוד ג-di-GMP איתות חיידקים, לשימוש במחקר מכוון להבנת הביולוגיה של פ aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Lysogeny Broth (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth with Agar (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer</td><td>Thermoscientific</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>2 mm gap electroporator cuvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>BioRad GenePulser XCell electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Leica Fluorescent Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384-well, white-walled, clear-bottom plates</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi reagent dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi tubing</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II 16-channel electronic pipette</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>100 ml sterile disposable reagent reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal air-permeable membranes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MKBQ1886</td><td></td></tr><tr><td>Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13)</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of a high-throughput setup for screening small molecules that modulate c-di-gmp signaling in pseudomonas aeruginosa

עמיד חיידקים לאנטיביוטיקה מסורתית העלה ניסיונות מחקר לזהות מטרות תרופה חדשות במסלולים רגולטוריים שהתגלו לאחרונה. מערכות רגולטוריות לנצל di-GMP המחזורית התאית (c-di-GMP) כשליח שני הן משורה אחד כזה של היעד. ג-di-GMP הוא מולקולת איתות למצוא כמעט כל החיידקים שפועל להסדיר פעילות ענפה של תהליכים כולל עמידות לאנטיביוטיקה, היווצרות ביופילם ו ארסיות. ההבנה כיצד c-di-GMP איתות היבטים שולטים של פיתוח biofilm עמיד לאנטיביוטיקה הציעה גישות לפיה שינוי הריכוזים הסלולר של נוקלאוטיד או שיבוש של מסלולי איתות אלו עשויים להוביל להיווצרות ביופילם מופחתת או רגישות מוגברת של biofilms לאנטיביוטיקה. אנו מתארים פרוטוקול bioreporter תפוקה גבוהה פשוט, המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), שביטויים הוא תחת השליטה של אמרגן תגובת c-di-GMP cdrA, להקרין במהירות עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל לווסת רמות הסלולר ג-di-GMP ב Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). פרוטוקול זה פשוט יכול להקרין כלפי מעלה של 3,500 תרכובות תוך 48 שעות ויש לו את היכולת להיות מותאם מיקרואורגניזמים רבים.

הגישה המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה מסך ממוצע של 3,500 תרכובות בתוך תקופה של 48 שעות. סקירה כללית של פרוטוקול הקרנת התפוקה הגבוהה מודגמת כמו תרשים זרימה באיור 1. לכתבה הנוכחית, אנו הוקרננו כלל-של-חמש ספרייה מורכבת תואמת עבור תרכובות ויסות ג-di-GMP פוטנציאל בריכוז סופי של 600 מיקרומטר . עם זאת, יש הרבה זמינים מסחריים דמויי סמים ו לא תרופתי כמו סטים מתחמים שיכול לשמש ב assay. ערכות אלה יכולות להיות תרכובות ממוקדות חיידקים או תרכובות נקווים אקראיות אבל כל ספרייה הייתה מושתת תכונות ומאפייני physicochemical מוקצה כגון הערכה הוקרנה כאן, אשר היו קבוצות פונקציונליות קוטב ומרכזי stereogenic מרובה. בפרוטוקול זה, חיידקים הם מחוסנים לתוך הצלחת יחד עם תרכובות, פקד חיובי אנטיביוטיקת רכב DMSOמלא, בהתאם לפריסה שמוצגת באיור 2. איור 3 מתארים את התוצאות של ההקרנה הראשית שהודגמה צלחת ספרייה יחידה. נציג OD 600 ונתוני גלם GFP מוצגים באיור 3A ו 3B, בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוכים לערכים הגבוה OD 600 / GFP, יושמו לערכים היטב. המפות החומות נוצרו בתוך תוכנת גיליון אלקטרונית על ידי החלת עיצוב מותנה בהיקף 3-צבע פורש מן OD הנמוך ביותר 600 / GFP לקריאה החוצה עד OD הגבוהה ביותר 600 / GFP לקריאה החוצה. OD 600 ו- GFP הנמוכים ערכים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות עיכוב בגדילת רמות ג-di-GMP בהתאמה, בעוד ערכים גבוהים ביחס הביקורת השלילית DMSO מתאימות קידום בצמיחה ורמות C-di-GMP בהתאמה . הערכים &#39;z החזק 600 OD ו- GFP arדואר מחושב על פי נוסחה שנקבעה בפרוטוקול (5.1). כפי שהם שניהם מעל 0.5 (0.694 ו 0.761 בהתאמה), איכות assay נחשבת חזקה והנתונים נותחו נוסף. עיכוב% של צמיחה (OD 600) ורמת ג-di-GMP התאי (GFP) מחושב על ידי הנוסחות כנקבעות בפרוטוקול (5.2, 5.3). נציג נתונים מוצגים באיור 4 א ו -4 בהתאמה. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום) כדי לקרר (ירוק) צבעי מציין נמוך עיכוב% גבוה, יושמו לערכים היטב. עלילת פיזור של עיכוב% (OD600 / GFP) מבארות פרטניות המבוססות על המסך הראשי היא להתוות איור 5 א ו 5 ב עבור 600 OD ונתוני GFP בהתאמה. ± 50% חתוכים (מסומן עם קווים מקווקווים) נבחר לגילוי להיט. להיטים פוטנציאליים על הסמך חתוך זה מסומן עם נקודות אדומות. שני סוגים של תרכובות של עניין ניתן דiscerned מן assay. נפילות באיור 5A הן תרכובות מעכבות התפתחות חיידקים, בעוד נפילות איור 5 ב הן תרכובות כי פוטנציאל להחזיק את היכולת לווסת את הרמות תאיות של c-di-GMP. שני מתחמים זוהו נפילות נציג עבור assay זה. אלה הם מתחם, B מעכב מתחם צמיחה פוטנציאלי, מעכב פוטנציאל c-di-GMP. תרכובת תואמת F8 גם איורים 3 ו -4 והיו לו עיכוב 72.5% בצמיחה. היה עיכוב מקביל צפוי ברמות מחזוריות di-GMP. מתחם B מתאים K3 גם איורים 3 ו -4 והיה לו עיכוב 61% ברמות מחזוריות di-GMP ללא שינוי בצמיחה. תרכובות להיט בחרו נבדקים נוספים על ידי assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ&quot;מ וסדרות דילול כפול. ערכי 50 IC מחושבים על מנת התגובהעקומות (איור 6 א &#39;וב&#39;). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> סקירה כללית באיור 1.: הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה קטנה מולקולות עבור הפוטנציאל שלהם לווסת רמות ניידות של c-di-GMP ב פ aeruginosa. סקירה זו מציגה צעד-אחר-צעד ייצוג של הפרוטוקול המשמש assay זה. מושבת חיידקים של פ aeruginosa הוא גדל לילה תרבות המתנע LB. באמצעות מתקן מגיב, התאים מחוסנים לתוך 384 גם צלחות המכילות תרכובות שנבחרו. הצלחות מודגרת במשך 6 שעות, שלאחריו ערכי OD 600 ו- GFP נמדדים. באמצעות לקריאת פסקים אלה, תרכובות המשפיעות על הרמות הסלולריות של c-di-GMP ניתן לזהות. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> . איור 2. מפת פלייט 384 גם משמש מולקולה קטנה הקרנת Assay התרכובות מהספרייה (תכלת) הם aliquoted לתוך בארות A1 - P22. &quot;שליטה חיובית&quot; (אדום) המורכב לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / סולפט tobramycin מ&quot;ל מתווסף בארות A23 - P23 ואת &quot;שליטה שלילית&quot; (ירוק) המכיל ריכוז סופי של 1% DMSO מתווסף A24 בארות - p24. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> איור 3. נציג תוצאות עבור אחת 384 גם הקרנת פלייט. Rהנתונים הגולמיים epresentative מיועד OD 600 (א) ו- GFP (B). מפת חום צבע הדרגתי, עם חם (האדום: OD 600 = 0.65 או GFP = 250,000) כדי לקרר (גרין: OD 600 = 0.10 או GFP = 40,000) צבעים המציין נמוך לערכים גבוהים, יושם לערכים היטב. וולס כי יש יחסית קריאות OD 600 / GFP תחתונה הביקורת השלילית DMSO ייטו להיות באדום בעוד בארות שיש קריאות GFP OD 600 / גבוהות ביחס לשליטת DMSO ייטו להיות בירוק. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> איור 4. נציגי תוצאות עבור עיכוב אחוז מחושב עבור צלחת 384 גם. נתוני עיכוב% נתחו מיוצגים הן של OD 600 (א) ו- GFP (B) לקריאה outs. מפת חום צבע הדרגתית, עם חם (אדום: OD 600 = -150% או GFP = -20%) כדי לקרר (גרין: OD 600 = 100% או GFP = 100%) צבעי מציין נמוכים לערכי עיכוב גבוהים, כבר להחיל את הערכים היטב. מולקולות קטנות, אשר באופן פוטנציאלי לעכב צמיחה תאית ג-di-GMP ייטו להיות בירוק ואילו מולקולות קטנות אשר באופן פוטנציאלי לקדם צמיחה ורמות C-di-GMP התאיים ייטו להיות באדום. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> איור 5. מגרשי פיזור נציג עבור עיכוב% (OD600 / GFP) מתקבל נבדקת כל מולקולה הקטנה. כל מולקולה קטנה מיוצגים על ידי נקודה ואת חלוקת עיכוב%עבור כל אחד OD 600 (א) ו- GFP (B) לקריאה פסקי מוצג. ± 50% חתוכים נבחר לזיהוי להיט. להיטים פוטנציאליים מודגשים באדום. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> איור 6. נציגי תוצאות ממינון -. Assay תגובת שתי תרכובות (מעכב צמיחה פוטנציאלי B מעכב ג-di-GMP פוטנציאל) זיהו מן המסכים קודם נבדקות נוספות ב assay 10 נקודות מנה-תגובה עם ריכוז עליון של 2 מ&quot;מ וסדרות דילול כפול. התאמת פונקציה לוגיסטית ארבעה פרמטר לנתונים הניבו ערכי 50 IC של 158 מיקרומטר ו 193 מיקרומטר בהתאמה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Ple</a>ASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

establishment-high-throughput-setup-for-screening-small-molecules

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

8.4K Views.  University of Dundee.  מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת. 

Video: Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Bioengineering

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

ניתוח סינון בתפוקה גבוהה עבור מעכב אוטופגיה 4B ציסטאין פפטידאז

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins is a prerequisite for therapeutic strategies targeting this pathway. Inhibition of the autophagy protease ATG4B has been shown to increase overall survival, suggesting that ATG4B could be a potential drug target for cancer therapy. Our laboratory has developed a selective luciferase-based assay for monitoring ATG4B activity in cells. For this assay, the substrate of ATG4B, LC3B, is tagged at the C-terminus with a secretable luciferase from the marine copepod Gaussia princeps (GLUC). This reporter is linked to the actin cytoskeleton, thus keeping it in the cytoplasm of cells when uncleaved. ATG4B-mediated cleavage results in the release of GLUC by non-conventional secretion, which then can be monitored by harvesting supernatants from cell culture as a correlate of cellular ATG4B activity. This paper presents the adaptation of this luciferase-based assay to automated high-throughput screening. We describe the workflow and optimization for exemplary high-throughput analysis of cellular ATG4B activity.

Author Spotlight: A Selective Based Assay for Monitoring ATG4B 27 activity in cells 

Here, we describe a detailed protocol for the use of a luciferase-based reporter assay in a semi-automated, high-throughput screening format.

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video