Drosophila görüntü şekil 3 c ve video el yazması için Darren Obbard teşekkür ederim; J. Marie Hardwick, Wade Gibson ve Heather M. kuzu bu el yazması değerli tartışılması için. Bu eser bir efendim Edward Youde Memorial Bursu (H.L.T. tarafından), Dr. Walter Szeto'yu Memorial Bursu (H.L.T.), desteklenen Fulbright hibe yaşam Bilim Araştırma Vakfı Bursu (H.L.T.) ve ncı K22 CA204458 (H.L.T.) 007-2009 (H.L.T.), verin. Ho Tang Lam bir Shurl ve Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı (2014-2017) Kay Curci Vakfı üyesi oldu.

1) CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hazırlanması uçar
<ol><li>CO2sinekli anestezi ve sinek yiyecek ve taze Maya yapıştır ile aynı şişe içinde 7 ila 10 caspase duyarlı Gal4 (DQVD)19 bakire kadın ve 7 10 G-izleme53 Gal4 muhabir genç erkek sinek (veya tersi) aktarmak için bir fırça kullanın. Not: Çapraz Caspase duyarlı (DQVD) Gal4 ve G-izleme Sineklerin Tanrısı CaspaseTracker döl sinekler üretecek. Caspase - duyarlı (DQVA)'19 Gal4 çapraz ve G-izleme sinekler (konuya bakın) negatif kontrol uçar sağlayacaktır. Taze Maya Yapıştır o döl sayısı artar bu yüzden yumurta üretimi, geliştirmek için protein kaynağı olarak hizmet vermektedir. Bakire kadın ve genç erkek sinek onların fenotipleri54göre seçin.</li>
	<li>Sinekler, 18 santigrat derece (oC) sırasında çapraz için 3-7 gün kuluçkaya ve sonra yeni bir çapraz 18 ° C'de ayarlamak için yeni bir şişe için sinekler aktarın Döl eclose uçar kadar 18 ° C'de orijinal şişe kuluçkaya devam'i tıklatın. Not: Üst sinek özgün flakon, döl, aşırı kalabalık önlemek için yeni şişeleri aktarın. Üst sinek döl taze yiyecek ve Maya salçası ilk 2-3 anahtarları oluşturabilir ve sonra verimliliği önemli ölçüde zamanla azalacak. Sinekler yükselterek 18 ° C CaspaseTracker Biyoalgılayıcı non-spesifik sinyal azaltabilir (konuya bakın).</li>
	<li>Seçme döl ile doğru fenotipleri54 aşağıdaki deneyler için uçar. Not: Burada transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme CyO dengeleyici ile dengeli ikinci kromozom bulunur. Her iki transgenes caspase duyarlı Gal4 ve G-izleme olan kıvırcık kanat döl (olmadan CyO) seçin.</li>
</ol>2) uygulama geçici hücre ölüm indüksiyon CaspaseTracker Biyoalgılayıcı uçar
<ol><li>10 eclosed erkek taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile yeni bir şişe için 1 gün için 18 ° C'de yumurta odası üretimi oogenesis tarafından izin vermek için uçar-20 yeni transfer. Not: Dişi erkek sinek ile tutmak yumurta odası üretimini artırmak.</li>
	<li>Soğuk şok Apoptosis geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler sonra-7 ° C için 1 h yerleştirilmiş olması yeni boş şişe aktarın. Not: soğuk şok kişi yaralandı hücreler plazma zarı yırtılması55,56inducing tarafından.</li>
	<li>Apoptozis protein açlık tarafından geçmesi yumurta Chambers'ı ikna etmek için dişi sinekler 18 ° C'de % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe 3 gün boyunca aktarın. Not: Protein açlık (protein olmayan gıda) yumurta chambers apoptosis57,58,59 ve autophagy60,61geçmesi tetikleyebilir. Sinekler sinek gıda Sükroz en iyi durumu tutmak için her gün % 8 sukroz ve %1 agar gıda ile yeni bir şişe geçin.</li>
	<li>Stresli sinekler geri yeni bir şişe taze uçmak gıda ve taze Maya yapıştır ile onları kurtarmak izin vermek için 18 ° c 3 gündür aktarın. Aç ve yumurtalıkların yumurta odalarından açıklanan62elde etmek için açlıktan kurtarılan sinekler incelemek. Not: Kopyalayabilmek Drosophila yumurtalık elde etmek için sinekler CO2, anestezi ve forseps 2 Çift sinek baş kaldırmak için kullanın ve forseps Bankası yumurtalık "Sineklerin Tanrısı" kaldırmak için karın çekmek için kullanın.</li>
</ol>3) fiksasyon ve disseke yumurta odalarının görüntüleme için boyama
<ol><li>0.5 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) çevresinde disseke yumurta chambers ile birlikte 1 mL santrifüj tüpleri için transfer. Yumurta yerleşmek izin verir. Not: Plastik pipet ipuçları %1 sığır serum su veya yumurta odaları ipuçları plastik yüzeyde sopa önlemek için PBS çözünmüş albumin (BSA) ile kat. Karanlıkta photobleaching kırmızı floresan protein (RFP, DsRed olarak da bilinir) önlemek için aşağıdaki yordamları gerçekleştirin ve yeşil flüoresan protein (GFP) yumurta odalarında.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBS kaldırın ve sonra 0.5 mL % 4 paraformaldehyde 20-30 dk için karanlık oda sıcaklığında yumurta chambers düzeltmek için PBS içinde geçerlidir. Not: Bu ve aşağıdaki kuluçka adımları nazik döndürme uygulama.</li>
	<li>Pipetting tarafından paraformaldehyde kaldırın ve sonra yumurta odası 0.5 mL PBST ile yıkanmış (PBS + %0,1 Triton X-100) için 3 kere. Not: Uzun süreli fiksasyon RFP ve GFP sinyalleri azaltmak olabilir.</li>
	<li>PBST ile yumurta salonları, oda sıcaklığında 1-2 h için kuluçkaya veya bir yumurta Chambers'ı permeabilize için nazik döndürme ile 4 ° C'de gece. Not: PBST Ayrıca BSA sigara kaplı plastik yüzey sopa yumurta chambers kaçının.</li>
	<li>Pipetting tarafından PBST kaldırın ve daha sonra mavi nükleer Höchst boya PBST 10 μg/mL 0.5 mL yumurta salonları çekirdeği için leke için oda sıcaklığında 1-2 h için geçerli. NOTE1: Bu non-spesifik sinyal artacak gibi nükleer boya ile uzun süreli kuluçka kaçının. NOT2: Çekirdeği Höchst olmadan leke için alternatif yaklaşımdır 200 eklemek μL anti-beyazlatma DAPI montaj aracıyla (malzemeleri görmek) ve protokol 3.8 açıklandığı gibi cam kapak fişinde dokular Montaj önce gecede63, kuluçkaya. NOTE3: photobleaching önlemek için karanlıkta boyama ve aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.</li>
	<li>Pipetting tarafından nükleer boya kaldırmak ve 0.5 mL için 10-20 dk kuluçka her yıkama adım arasında nazik rotasyon ile ile 3 kere 1 mL santrifüj tüpleri yumurta odasında yıkamayı PBST uygulayın.</li>
	<li>İyi pipet ile tüm PBST kaldırmak ve sonra uygulamak 200 μL anti-beyazlatma montaj ajan (tüp altına yumurta chambers lavabo kadar yumurta odaları 3 h için oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de kuluçkaya için bkz: belgeleri). Not: tam montaj Ajan absorbe doku tüpün dibine lavabo.</li>
	<li>200 μL anti-beyazlatma ile aktarmadan tarafından lekeli yumurta chambers mount Ajan pipetting tarafından görüntüleme için önceden temizlenmiş cam slayt üzerindeki montaj yumurta Odaları bir 20 x 20 mm önceden temizlenmiş cam kapak notu ile kapak ve koyarak cam kaymak kapak fişinde mühür tırnak cilası kapak notu kenarında. NOTE1: Cam slayt ve kapak kayma su ya da % 70ini etanol ile önceden temiz. NOT2: Vazelin cam slayt ve yumurta chambers tarafından overcompression yok önlemek için kapak Not arasında geçerlidir.</li>
	<li>Floresan veya 20 x NA 0,8 kullanarak confocal mikroskop kullanarak yumurta chambers görüntü planı-Apochromat amacı, nükleer boyama için uyarma ışık dalga boyu 405 nm ile (emisyon ~ 461 nm algılama), 561 nm RFP (devam eden veya son caspase aktivite) sinyal () için emisyon ~ 590 nm algılama) ve 488 nm GFP (geçmiş caspase aktivite) sinyal için (emisyon tespit ~ 518nm). Not: Yayımlanmış protokolümüze mikroskobu20,64için bkz.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı bir roman ve son olarak algılanmasını sağlayan benzersiz araç veya devam eden caspase etkinliği ve hücre ölümü ters hücre izleme işlemek ve caspase etkinlik içinde vivoettikten sonra hayatta kalmak. Caspase aktivite geleneksel apoptosis damgasını kabul ederken, apoptotik sigara caspase etkinlik düzenleme nöronal aktivite79, , gibi çeşitli normal hücre fonksiyonları potansiyel rolleri oynar büyüyen çalışmalar ortaya çıkarmak 80, öğrenme ve bellek81,82,83,84, necroptotic hücre ölüm85,86, spermatid kişiselleştirme87bastırılması, 88,89, Hücre proliferasyonu90ve91biçimlenme hücre kader işleme mikroRNA. Apoptozis ve anastasis ek olarak, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistem bu nedenle beyin ve optik loblar, cardia, gut, Malpighi tübüllerin, Trakea, kas ve diğer dokuların mevcut olmayan apoptotik caspase etkinlik algılayabilir Drosophila19,46,64. Bu Biyoalgılayıcı sinyal geçerli veya son anastatic aktivite embriyo geliştirme veya bu dokuların normal homeostazı sırasında temsil edebilir. Sonra geçici hücre ölüm-inducing çevresel stres Canlı hayvanlarda Anastasis çalışmaya kurcalayarak bu normal fizyolojik koşullar altında caspase Biyoalgılayıcı aktivite sergilemek, ama bu caspase geçmesi bağlı olmak hücreleri seçmek için önemlidir geçici hücre ölüm indüksiyon tarafından harekete geçirmek. Onlar genellikle germarium sahne 10 yok caspase faaliyete oogenesis58,59,92sırasında çünkü yumurta chambers bu amaç için idealdir.
Kadın Drosophila geçici çevresel stresleri için açığa, protein açlık ve soğuk şok gibi verimli bir şekilde caspase harekete geçirmek ve yumurta odaları19,57,58hücre ölümü tetikleyebilir, 78. Uzun süreli hücre ölüm indüksiyon Sineklerin kaçınarak iletişim kuralına kritik adımlar içerir. Protein açlık (%1 agar 3 gün için % 8 Sükroz) ve soğuk şok (1-7 oC h) dişi sinekler için en iyi duruma getirilmiş koşulları, yumurta odalarında caspase aktif hücre ölüm işlemleri tetikleyecek ve stresli sinekler için döndükten sonra kurtarmak izin normal durum19. Bir hücre ölüm uyarıcı ile uzun süreli tedavi hücre ölüm sürecinden geçmeleri için daha fazla yumurta chambers tetikleyebilir, ama ölmek üzere olan yumurta odaları tamir edilemeyecek kadar büyük hasara deneyim çünkü iyileşme oranı da, muhtemelen azalır.
Bu iletişim kuralı ek bir kritik adım geçiş, Hayvancılık ve CaspaseTracker gibi 18 oC. daha düşük bir sıcaklıkta uçar Bakımı tarafından CaspaseTracker arka plan sinyal yumurta odalarında azaltmaktır Yumurta odaları çoğunluğu en iyi şekilde yetiştirilen sinekler caspase faaliyet germarium sahne 10 içinde oogenesis58sırasında görüntülenmez, yumurta chambers yaklaşık % 1'i caspase Biyoalgılayıcı etkinliği hücre ölüm indüksiyon19 olmadan sergilemek verebilir . Bu doğuştan gelen hatalar nedeniyle normal aşınma oranı yansıtıyor olabilir veya istemeden oogenesis sırasında standart laboratuvar koşulları tarafından tetiklenebilir. Gal4 daha az aktivite sinekler düşük sıcaklık93görüntüler gibi sinekler 18 oC, yerine oda sıcaklığında yetiştirme CaspaseTracker sistem etkinleştirir endojen sinyali azaltabilir. Alternatif olarak, sinekler gibi 29 oC, daha yüksek bir sıcaklık geçiş CaspaseTracker sisteminin hassasiyeti nedeniyle Gal4 aktivite93ve potansiyel olarak diğer endojen sıcaklık bağımlı enzimatik artırmak için artırabilir faaliyetleri.
Hücre ölüm işlem veya anastasis apoptotik sigara caspase faaliyet gösteren hücrelerden meydana CaspaseTracker pozitif hücreleri ayırt etmek önemlidir. Bunlar hücreler ölüyor o ayırmak-harekete geçirmek Gal4 devam eden caspase aktivite gibi apoptotik hücreler RFP (devam veya son caspase etkinliği için geçici marker) ve sık sık GFP (son caspase etkinliği için kalıcı maker) tedavisinde apoptosis indüksiyon, hızlı, daha sonra geçici (Gal4 etkinliği-bağımlı RFP) ve kalıcı etkinleştirir (Gal4 FLPase-FRT tetiklenen GFP aracılı) gazetecilere G-izleme sistemi. Apoptosis bu hücreler tarafından morfolojik ve biyokimyasal böyle ABD ile nükleer boyalar14,19,58boyama tarafından algılanan nükleer yoğunlaşma ve caspase bölünme tarafından algılanan hallmarks onaylanabilir immunostaining19,94. Zaten anastasis uğramıştır hücreler G-izleme sisteminin FLPase-aracılı rekombinasyon olay nedeniyle kalıcı GFP ifade görüntüler. Onlar devam caspase hareket yok, ne de diğer işaretlerinden apoptosis19gibi bu hücreler yok RFP hızlı. Bu hücreler aynı zamanda normal nükleer Morfoloji görüntüler. Hücreleri genellikle RFP ve GFP ifade görüntülemek ve ayrıca normal nükleer Morfoloji19var devam apoptotik sigara caspase etkinliğine sahip.
Çünkü her ikisi de sadece GFP görüntülemek ve hücre ölümü hiçbir hallmark apoptotik sigara caspase aktivite, bu hücrelerden anastasis deneyimli hücreleri ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, dikkatli kontrol deneyleri dahil19olmalıdır. Örnekler için anastasis yumurta odalarında, eğitim için bu vurguladı olarak kurtarılan sinek ve sinek (negatif kontrol) sigara vurguladı GFP ifadede incelemek için esastır. Anastasis caspase harekete geçirmek sonra oluştuysa kurtarılan sinekler vurgusuz sinekler, daha fazla GFP ifade hücre göstermelidir. CaspaseTracker floresan sinyallerini nonspesifik auto-Floresan, Manikür, pigmentler ve yağ organları19gözlenen olarak ayırt etmek önemlidir. Negatif kontrol Biyoalgılayıcı sinekler yarilabilir sıra (DQVA) Biyoalgılayıcı (DQVD) caspase bölünme sitenin mutasyona ve böylece kontrol Biyoalgılayıcı non-yanıt veren caspase etkinlik19oluşturma tarafından üretilen. Sinyal içinde caspase duyarlı (DQVD) tespit ama sinyal otomatik Floresans yerine caspase etkinliği tarafından tetiklenen ilgi değil negatif kontrol (DQVA) Biyoalgılayıcı sinekli.
Bizim şu anki Drosophila ikili CaspaseTracker Biyoalgılayıcı hücreleri RFP ifade tarafından "yeni" caspase aktivite ile ve hücreleri ile "geçmiş" caspase aktivitesini GFP19ifadeye göre tanımlayabilirsiniz. Tepki süresi RFP ifade caspase etkinliği yanıttaki sürmeyi Gal4 için bir kaç saat alır çünkü RFP "gerçek zamanlı" caspase etkinlik göstergesi olmadığını unutmayın. "Gerçek zamanlı" işlev eklemek için Drosophila CaspaseTracker Biyoalgılayıcı son zamanlarda geliştirilen iCasper Biyoalgılayıcı52ile kombine edilebilir bir "gerçek zamanlı" ve o zaman sadece far-red sinyallerini gösteren "için parlak koyu" in vivo Biyoalgılayıcı caspases tarafından i ciddi.
Apoptozis dışında potansiyel olarak CaspaseTracker olabilir de aktif hücre ölümü sırasında alternatif türleri gibi hücreleri hücre ölüm yolları doğrudan veya dolaylı olarak caspase harekete geçirmek, sonra autophagy gibi içerir onların ders sırasında geçiş yapabilirsiniz açlık95,96, soğuk şok kaynaklı plazma zarı yırtılması19,55,56,78ve staurosporine kaynaklı necroptosis97nekroz, 98. Bizim şimdiki ve önceki çalışmalar CaspaseTracker biyosensörler bu hücre ölüm indüksiyon vitro veya vivo içinde17,18,19 kurtarılan hücreleri etiketleyebilirsiniz gösterdi , 20 , 21. bu hücre ölüm indüksiyon yalnız aynı anda birden çok hücre ölüm yolları aynı hücrelerdeki etkinleştirmek gibi kurtarma bu hücreler ölüyor o anastasis farklı hücre ölümü tersine çevirebilirsiniz bir genel hücre kurtarma fenomen olduğunu göstermektedir Apoptozis, autophagy, nekroz ve necroptosis, dahil olmak üzere ayrı ayrı veya aynı anda işler.
Vivo CaspaseTracker Biyoalgılayıcı henüz bilinmeyen işlevleri, mekanizmaları ve tedavi edici etkileri anastasis ()şekil 4)21kolaylaştıracaktır. Biz fare birincil karaciğer hücreleri ters etanol kaynaklı apoptoz kaydetme sırasında analiz ve ilginçtir, çarpıcı değişimler buldum zamanlı Kurs bütün-genom gen ifade Mikroarray çalışmaları gerçekleştirilen anastasis moleküler imza ortaya çıkarmak için Transkripsiyon genlerin yanlısı survival, Anti-oksidasyon, DNA hasarı yanıt, Histon modifiye, anjiogenez, hücre geçiş ve dönüşüm18,21de dahil olmak üzere birden çok yollar dahil. Bu bulgu doğrulama çalışmamız insan karaciğer kanseri HepG2 hücreleri kurtarma apoptosis18,21ve aynı zamanda yeni bir bağımsız RNA-sıralama çalışma kurtarma apoptosis99HeLa hücreleri tarafından desteklenmektedir. İlginçtir, up-yönetmelik anastatic hücrelerde bulunan bazı yanlısı hayatta kalma faktörlerin da gözlenen kalp yetmezliği tersine, tümör ilerleme ve kanser nüks100,101,102, düşündüren anastasis potansiyel katılımı. Bu mekanik ve tedavi edici çalışmalar sağlayacaktır olarak anastasis fizyolojik, patolojik ve terapötik potansiyelleri çalışmaya, bu anastatic hücrelerini tanımlamak ve kaderlerini küçük hayvanlarda izlemek önemlidir. Bizim Drosophila ve memeli CaspaseTracker biyosensörler anastasis potansiyel katkıları normal gelişim, Homeostazı, doku kurtarma, tümör evrim, kanser nüks ve metastaz test etmek için yararlı araçları olacaktır. Bu çalışmalar bulgu anastasis doğal rolü bilgimizi artırmak ve hücre ölümü ve hayatta kalma anastasis kontrol aracılığıyla arabuluculuk dirençli hastalıklar için devrimci yeni tedavi yaklaşımları tanımlamak için potansiyel sunmaktadır.

Programlanmış hücre ölümü Apoptozis gibi çok hücreli organizmalar1,2,3, yaralı, istenmeyen veya tehlikeli hücrelerde ortadan kaldırarak embriyonik geliştirme ve normal homeostazı önemli bir rol oynar. Hücre ölüm ve yaşam arasında denge kaybı kanser, kalp yetmezliği, otoimmünite ve dejenerasyon4,5,6,7,8gibi ölümcül sonuçlara yol açabilir. Caspases geleneksel olarak "dönüş yok" apoptoz9,10,11, olarak kabul edilmiştir Cellat aktivasyonu hızlı ve büyük hücresel yıkım12tetikler, 13,14,15,16. Bu genel dogma zorlu, kültürlü ölmekte olan Primer hücre ve kanser hücrelerinin değil sadece caspase harekete geçirmek, ama aynı zamanda aşağıdaki önemli hücre sonra plazma zarı blebbing, hücre büzülme de dahil olmak üzere ölüm işaretlerinden kurtarabilirsiniz gösterdi, Mitokondrial parçalanma, mitokondrial sitokrom c yayın sitozol, nükleer ve Kromatin yoğunlaşma, DNA hasarı, nükleer parçalanma, içine hücre yüzey teshir edilmesi Fosfatidilserin (PS) ve apoptotik organları oluşumu 17 , 18 , 19 , 20 , 21. ölen hücreleri hücre ölüm uyaranlara17,18,19,20, kaldırdıktan sonra kurtarabilirsiniz olarak önerdiğimiz bu anastasis bir iç hücre kurtarma olgu olduğunu 21. dönem "Anastasis" (Αναστάσης)18"için Yunanca olarak hayata yükselen" anlamına gelir, icat bu beklenmedik hücre kurtarma fenomeni açıklamak. Anastasis bizim gözlem daha sonra Fosfatidilserin dışa22,23,24, mitokondrial sınırlı da kurtarma hücre ortaya son bağımsız çalışmalar tarafından desteklenen dış membran permeabilization25, karışık soy kinaz benzeri aktivasyon (MLKL) ve hücre büzülme26.
Anastasis düzenleyen mekanizmalar karakterize paradigma kayması fizyolojik, patolojik ve tedavi edici etkileri olacaktır. Anastasis kurtarmak ya da ventrikül sol ventrikül kaldırarak önemli postmitotic hücreleri ve değiştirmek zor olan doku ve muhtemelen kalp yetmezliği tersine çevirme için hesabı korumak için daha önce bilinmeyen cytoprotective mekanizma temsil edebilir aygıtlar (LVADs)27,28, kurtarma sonra aşırı ışık29,30,31geçici pozlama veya onarım nöronların photoreceptor hücrelerinin beyin yaralanması32sonra yardımcı. Öyleyse Anastasis teşvik hücre ve doku kurtarma geliştirmek. Diğer taraftan, anastasis kanser nüks17,18neden terapi, hücre ölüm neden hayatta kalmak için kanser hücreleri tarafından kullanılan bir beklenmeyen kaçış taktik olabilir. Bu nedenle, anastasis kanser hücrelerinin sırasında ölüyor ve kanser tedavisi yanında onların nüks önleme kanser tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi olabilir sonra bastırmak.
Anastasis işlemi sırasında biz bulduk kurtarılan bazı hücreler kalıcı genetik değişiklikler satın aldı ve oncogenic dönüşüm uygulandı, DNA hasar nedeniyle büyük olasılıkla apoptosis18,20sırasında,21 tahakkuk . DNA zarar görmüş hücreleri ölüm sürecinin tersine tumorigenesis bir mekanizma olabilir, özofagus kronik termal yaralanma indüklenen gibi potansiyel olarak doku yaralanması tekrarlanan gözlem altında yatan dokuları, çeşitli kanser riskini artırır çok sıcak içecekler33,34,35, alkolizm36,37nedeniyle karaciğer hasarı, tümör evrim tüketimi ise kanser terapisi38, sonra tarafından 39,40ve anti-kanser tedavisi41,42,43,44 döngüleri arasındaki aralıkları sırasında ortaya çıkan normal dokuların üzerinden yeni kanser gelişimi . TRUE ise, anastasis hedefleme önlemek ya da kanser gelişme ve ilerleme tutuklandı. Biz ölmekte olan germ hücreleri açlıktan kaynaklı anastasis yeniden beslenen Drosophila19geçmesi bulduk.  Germ hücreleri DNA hasarı Anastasis ortaya çıkarsa, hesap çevresel stres uzun süreli gözlem için genetik hastalıklar gelişimini destekler olabilir. Örneğin, kıtlıklar diyabet ve Koroner kalp hastalıkları45gibi transgenerational devralınabilir hastalıkların gelişmesine katkıda bulunmak. Bu nedenle, anlayış anastasis devralınabilir hastalıklar bu potansiyel mekanizması tarafından neden geliştirme önleme stratejileri neden olabilir.
Anastasis keşfi koşum ve yenilikçi tedaviler geliştirmek için doğrudan için sebep ve sonucu anastasis Canlı hayvanlarda eğitim esastır. Ancak, bu teknik olarak tanımlamak ve anastatic hücreleri vivo içindeçünkü hücre ölüm işlemi kurtarılan hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez görünür ve hiçbir biyomarker anastasis izlemek için zordur tespit henüz17,18,21. Biz son zamanlarda yeni bir in vivo caspase Biyoalgılayıcı tanımlamak ve sonra caspase harekete geçirmek19,46, Apoptozis hayatta hücreleri izlemek için "CaspaseTracker"19, Özel Sigara İçilir bu sorunları çözmek için geliştirilen Hallmark apoptosis10,14. SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 ve iCasper52 gibi "gerçek zamanlı" caspase biyosensörler dan ayırt devam caspase aktivite algılayan, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı, ayrıca kalıcı olarak hücreleri bu hızlı caspase etkinliği bile geçici etiket yeteneği sahiptir. Bu nedenle, caspase-aracılı ters hücre sonra ölüm süreci içinde vivoCaspaseTracker Biyoalgılayıcı anastasis uzun vadeli izlenmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES AND REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Antifade mounting medium</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium (with DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Antifade mounting medium with DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont tweezer biology grade, stainless steel</td></tr><tr><td>Hanging Drop Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Glass slides</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA stain</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>Mitochondria stain</td></tr><tr><td>Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Stain for active fragment of caspase-3</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Blocking agent for immunostaining</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Medium for washing and immunostaining</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent for cell permeabilization</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 confocal microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila dissection</td></tr><tr><td>AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&amp;nbsp;</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

detecting anastasis in vivo by caspasetracker biosensor

Anastasis (Yunanca "hayat yükselen" için) sayede hücreler ölüyor genellikle özünde geri dönüşümsüz olarak kabul edilir son aşama hücre ölüm işlemleri tersine çevirebilirsiniz bir yeni keşfedilen hücre kurtarma olgudur. Anastasis teşvik ilke kurtarma yaralı ya da koru içinde cardiomyocytes veya nöronlar, böylece doku kurtarma kolaylaştırmak gibi değiştirmek zor olan hücreler. Diğer taraftan, kanser hücre ölümü emin olun ve nüks olasılığını azaltmak sonra anti-kanser tedavileri, Apoptozis geçiren anastasis kanser hücrelerinde bastırmak. Ancak, bu çalışmalar anastasis Canlı hayvanlarda tabi hücre kaderi izleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Morfolojik normal görünümlerini kurtarma sonra rağmen hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreleri tanımlamak için mücadeledir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz Drosophila ve tanımlamak ve kalıcı olarak anastatic hücreleri içinde vitro veya vivo içindeizlemek memeli CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemleri geliştirdik. Burada, üretimi ve CaspaseTracker çift Biyoalgılayıcı sistemini algılamak ve hücre ölüm bizi canlı tutan geçici maruz kaldıktan sonra anastasis Drosophila melanogaster içinde izlemek için in vivo protokolleri mevcut. Geleneksel biyosensörler ve protokolleri hücreleri aktif olarak geçiren apoptotik hücre ölümü etiketleyebilirsiniz iken, CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sonra caspase etkinleştirme - son aşama apoptosis, damgasını iyileşti hücreleri kalıcı olarak etiketleyebilirsiniz ve aynı anda etkin apoptotik süreçleri tanımlamak. Bu Biyoalgılayıcı da diğer formları doğrudan veya dolaylı olarak caspase etkinliği söz konusu hücre ölümü çalıştı hücre kurtarma izleyebilirsiniz. Bu nedenle, bu iletişim kuralı sürekli bu hücreler ve biyolojik işlevleri, moleküler mekanizmaları, fizyolojik ve patolojik sonuçları ve tedavi edici etkileri gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak onların döl kaderi takip etmemizi sağlar Anastasis. Biz de bu apoptotik sigara caspase aktivite içinde vivogörüntüleyen anastasis geçmesi hücreleri ayırt etmek için uygun kontrollerin tartışıyorlar.

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor at JoVE.com

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

9.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins University School of Medicine. Anastasis teknik olarak hücre ölüm süreci tersine çevirdin mi hücreler morfolojik normal sağlıklı hücrelerden ayırt edilemez olabilir çünkü vivo içinde tespit etmek zordur. Burada tarif biz tespit ve yeni geliştirilen vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı sistemimizi kullanarak canlı hayvanlarda anastasis geçmesi hücreleri izleme için kullanılan protokol.

Video: Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first to be activated in these pathways. This group includes caspase-2, -8, and -9, as well as the inflammatory caspases, caspase-1, -4, and -5. The initiator caspases are all activated by dimerization following recruitment to specific multiprotein complexes called activation platforms. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an imaging-based approach where split fluorescent proteins fused to initiator caspases are used to visualize the recruitment of initiator caspases to their activation platforms and the resulting induced proximity. This fluorescence provides a readout of one of the earliest steps required for initiator caspase activation. Using a number of different microscopy-based approaches, this technique can provide quantitative data on the efficiency of caspase activation on a population level as well as the kinetics of caspase activation and the size and number of caspase activating complexes on a per cell basis.

This protocol describes caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC); an imaging-based method that can be used to visualize induced proximity of initiator caspases, which is the first step in their activation.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Biyokimya

cADDis ile cAMP Analizi: Tek Hücreden Yüksek Verimli Taramaya

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is created from a circularly permuted fluorescent protein linked to the hinge region of Epac2. This creates a single fluorophore biosensor that displays either increased or decreased fluorescence upon binding of cAMP. The biosensor exists in red and green upward versions, as well as green downward versions, and several red and green versions targeted to subcellular locations. To illustrate the effectiveness of the biosensor, the green downward version, which decreases in fluorescence upon cAMP binding, was used. Two protocols using this sensor are demonstrated: one utilizing a 96-well plate reading spectrophotometer&#160;compatible with high-throughput screening and another utilizing single-cell imaging on a fluorescent microscope. On the plate reader, HEK-293 cells cultured in 96-well plates were stimulated with 10 &#181;M forskolin or 10 nM isoproterenol, which induced rapid and large decreases in fluorescence in the green downward version. The biosensor was used to measure cAMP levels in individual human airway smooth muscle (HASM) cells monitored under a fluorescent microscope. The green downward biosensor displayed similar responses to populations of cells when stimulated with forskolin or isoproterenol. This single-cell assay allows visualization of the biosensor location at 20x and 40x magnification. Thus, this cAMP biosensor is sensitive and flexible, allowing real-time measurement of cAMP in both immortalized and primary cells, and with single cells or populations of cells. These attributes make cADDis a valuable tool for studying cAMP signaling dynamics in living cells.

Yazar Spotlight: cADDis Biyosensörü Kullanarak Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Algılamasını Geliştirme

The protocol presented in this study illustrates the effectiveness of the cAMP Difference Detector In Situ in measuring cAMP through two methods. One method utilizes a 96-well plate reading spectrophotometer with HEK-293 cells. The other method demonstrates individual HASM cells under a fluorescent microscope.

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Biyomühendislik

Kanser Teşhisi için CRISPR-Cas Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

Yazar Spotlight: Hastalık Tespiti ve Görüntüleme için Mühendislik Moleküler Araçları

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is the initiation of innate immune programmed cell death (PCD) to eliminate infected or damaged cells and propagate immune responses. However, excess PCD is associated with inflammation and pathology. Therefore, understanding the activation and regulation of PCD is a central aspect of characterizing innate immune responses and identifying new therapeutic targets across the disease spectrum.
This protocol provides methods for characterizing innate immune PCD activation by monitoring caspases, a family of cysteine-dependent proteases that are often associated with diverse PCD pathways, including&#160;apoptosis,&#160;pyroptosis, necroptosis, and PANoptosis. Initial reports characterized caspase-2, caspase-8, caspase-9, and caspase-10 as initiator caspases and caspase-3, caspase-6, and caspase-7 as effector caspases in apoptosis, while later studies found the inflammatory caspases, caspase-1, caspase-4, caspase-5, and caspase-11, drive pyroptosis. It is now known that there is extensive crosstalk between the caspases and other innate immune and&#160;cell death molecules across the previously defined PCD pathways, identifying a key knowledge gap in the mechanistic understanding of innate immunity and PCD and&#160;leading to the characterization of PANoptosis. PANoptosis is a unique innate immune inflammatory PCD pathway regulated by PANoptosome complexes, which integrate components, including caspases,&#160;from other cell death pathways.
Here, methods for assessing the activation of caspases in response to various stimuli are provided. These methods allow for the characterization of PCD pathways both in vitro and in vivo, as activated caspases undergo proteolytic cleavage that can be visualized by western blotting using optimal antibodies and blotting conditions. A protocol and western blotting workflow have been established that allow for the assessment of the activation of multiple caspases from the same cellular population, providing a comprehensive characterization of the PCD processes. This method can be applied across research areas in development, homeostasis, infection, inflammation, and cancer to evaluate PCD pathways throughout cellular processes in health and disease.

This protocol describes a comprehensive method for assessing caspase activation (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9, and caspase-11) in response to both in vitro and in vivo (in mice) models of infection, sterile insults, and cancer to determine the initiation of cell death pathways, such as pyroptosis, apoptosis, necroptosis, and PANoptosis.

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

Anastasis Vivo içinde CaspaseTracker Biyoalgılayıcı tarafından tespit

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Floresan cAMP Fark Dedektörünü Yerinde Kullanarak Canlı Hücrelerde Gerçek Zamanlı cAMP Dinamikleri

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Doğuştan İmmün Hücre Ölümünü Değerlendirmek için Kaspaz Aktivasyonunun Değerlendirilmesi