Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH DC R15 NS067536-01A1), Ulusal Vulvodini Derneği (DC ödül) ve Macalester College bu işi destekledi. CB Arnold ve Mabel Beckman Vakfı tarafından finanse Macalester College Beckman Scholars Programı, bir burs aldı. BTF ve TM JDRF 2-2011-662 tarafından desteklenmektedir. Biz teknik danışmanlık Dr. Jason Schenkel ve Dr. Juliana Lewis teşekkür ve onların yardım ve destek için Chatterjea laboratuar tüm mevcut ve eski üyeleri.

Not: geleneksel gıda ve suya serbest erişim ile yer 8-12 haftalık dişi ND4 Swiss Webster fareleri, bu çalışmalar için kullanılmıştır (B13S1) deneysel protokol kullanılır; Macalester College IACUC tarafından onaylandı.. Oksazolon ile 1. Hassasiyet ve Mücadelesi <ol><li> Gün 0 <ol><li> 4 L kapaklı cam kavanoz dibinde örgü altına yerleştirilen emici havlu 3 ml izofluran ekleyerek anestezi odasına hazırlayın. Denek uyuşturulduktan kadar burada kullanılan ND4 dişi fareler için, odasında süresi 30-60 sn; fare suşu kullanılan anestezik yönetimini optimize edin. </li><li> Her anestezi farenin sırtını Tıraş ve bir hayvan saç düzeltici kullanarak kanadını. </li></ol></li><li> 1.gün <ol><li> Mutlak etanol içinde 4-etoksimetilen-2-fenil-2-oksazolin-5-on (Ox) içindeki bir% 2 solüsyonu yapmak ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kısaca uyutmak1.1.1 açıklanan ve yaklaşık 20 ul her birkaç seri uygulamalar geri traş% 2 Ox 100 ul uygulamak olarak izofluran anestezi ile fareler. Kuru çözelti seri uygulamalar arasında 5-10 saniye bekle. </li><li> Arka dışındaki bölgelerde% 2 Öküz çözümü dökülmesini önlemek ve uygulamalar arasında kurumasını çözüm beklemek için özen gösterin. </li></ol></li><li> Gün 5-7 <ol><li> Mutlak etanol (Ox) bir% 1 çözeltisi olun ve bir inkübatör içerisinde dönen bir plaka üzerinde 15 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Nazikçe ama sıkı yukarı bakacak şekilde karın boyun ve kuyruk tabanı ense de fare hareketsiz ve boyun hafifçe (intraperitoneal enjeksiyon için bir beklemeye benzer) aşağıya doğru eğik ve birkaç seri uygulamalarda traş kanadını% 1 Ox 100 ul uygulamak Yukarıda tarif edildiği gibi zaman alan daha sonra kuru cilt. </li><li> Kontrol fareleri için, traş turta mutlak etanol araç 100 ul geçerlidirk. </li></ol></li></ol> 2. Kanat Cilt Hasat <ol><li> Karbon dioksit inhalasyonu ile fareler Euthanize, ve dikkatli bir şekilde 10 cm, cerrahi makas ile cenah derinin (~ cilt 25 mm x 25 mm) istenen alanı tüketim. </li><li> Temiz, keskin cerrahi bıçak kullanarak, gögüs cilt aşırı yağ ve bağ dokusu kazınması. </li><li> Kalsiyum ya da magnezyum, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), olmadan fenol kırmızısı 10 mi RT HBSS [ihtiva eden bir 50 mL konik tüp içine 3 fareden cenah cilt 3 parçalarını yerleştirin 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1 piperazinetansülfonik asit (HEPES), ve% 10 cenin sığır serumu (FBS)]. </li></ol> 3. Ön sindirim Doku Yıkama <ol><li> 37 ° C &#39;de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü. </li><li> İnkübasyon süresinin sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin. </li><li> 70 um ve tüp içeriğini süzünsüzgeç yıkama tamponu atmak ve doku toplamak. Tek bir süzgeç, bir biyolojik tedavi grubu içinde tüm işlem boyunca yeniden kullanılabilir. </li><li> Forseps bir çift kullanılarak, (yukarıda tarif edildiği gibi EDTA, HEPES ve FBS ihtiva eden) taze RT HBSS ortam 10 ml içeren, yeni bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine süzgeçten cenah deri aktarın. </li><li> Doku Ortalama bir alanında yaklaşık 2.2 mm x 2.2 mm olacak şekilde bir tüp içine daldırılmış bir cerrahi kesme makası bir 12.5 cm çifti ile, cenah derinin her parça kıyma. </li><li> 37 ° C &#39;de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner levha üzerine deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü. </li><li> İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye vorteksleyin </li></ol> Derinin 4. kollajenaz sindirimi <ol><li> , 70 mikron süzgecinden tüpün içeriğini süzün toplamak ve yeni bir 50 ml konik içeren tüp 10 ml fre içine gögüs deri parçalarını aktarmaksh, RT HBSS ortam 0,7 mg ile takviye / D kolajenaz ml </li><li> 37 ° C &#39;de muhafaza edilen bir kuru, gazı alınmış kuluçka makinesi içinde 30 dakika için bir döner plaka sindirim orta ve deri parçacıklarını ihtiva eden bir yer tüpü. </li><li> İnkübasyonun sonunda, kuvvetli bir şekilde 10 saniye için tüpün vorteks içeriği. </li><li> Yeni 50 ml konik tüp içine 70 mikron süzgecinden tüpün Filtre içeriği; sindirilmiş doku içeren Flow-through tutmak ve süzgeci atmak ve cilt enkaz kanadını. </li><li> 350 g&#39;da 5 dakika için HBSS ortamı, santrifüj 50 ml akış yoluyla yıkayın ve süpernatant süzün. </li></ol> 5. Yoğunluk Gradient Santrifüj <ol><li> Serolojik bir pipet kullanarak, her bir örnek için, yeni bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 3 mi% 67 RT yoğunluk gradyan santrifüj ortamı eklenir. </li><li> Fenol kırmızısı ile HBSS 5 ml RT% 44 yoğunluk gradyan santrifüj medya hücre pelletini. </li><li> Centilmenly tabakası serolojik bir pipet kullanarak 67% yoğunluk gradyan santrifüj ortam numunesi üzerine hücreleri ihtiva eden% 44 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı 5 mi. Yavaş hıza pipet ayarlayın ve konik tüp duvar boyunca pipet yerleştirmek için emin olun. , Sallamak için dikkatli olun bozabilir veya degrade ters çevirin. </li><li> En düşük ayara hızlanma, santrifüj dengeli olduğundan emin olduktan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 931 xg&#39;de degrade frenini boşa ve santrifüj. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, dikkatlice santrifüj degrade kaldırmak ve yavaşça dik tüp tutan laboratuar tezgah ulaşım. Bir 5 ml&#39;lik plastik transfer pipeti kullanarak, yeni bir 15 ml&#39;lik konik tüpe 44 ve% 67,% yoğunluk gradyan santrifüj ortam transfer arayüzünde hücre tabakasını çıkarın. Arabirim görünmüyorsa, sadece% 67 -44% sınırında sıvının yaklaşık 2 ml kaldırın. </li><li> Entegrasyon hücreleri içeren konik tüp doldurun% 2 1X buz soğukluğunda PBS FBS, 350 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri ve süpernatant süzün ile rface. Not: sindirim adım 37 ° C &#39;de ve yoğunluk gradyan santrifüj ortam adım oda sıcaklığında olduğundan bu hücreler soğutulabilir ilk defa / soğuk tutulur. Hücreler 1 içinde yeniden süspanse edilebilir: 1 tripan mavisi seyreltme ve sayısı ve canlılığı bilgileri bu noktada elde edilebilir. </li></ol> 6. Engelleme ve Boyama Akış Sitometrik Analizi <ol><li> Blok FcyRII / non-spesifik antikor lekelenmesini önlemek için hücreleri III reseptörleri. Konjuge olmayan bağlanma CD16 / 32 (2.4G2) karşı antikor ve bir blok FcyRII / III reseptörlerinin 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 ihtiva eden% 2 FBS içeren PBS antikor ana karışımları yapmak. </li><li> CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6,7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (karşı antikorların uygun ana karışımları ile bloke hücreleri inkübe 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14) ve Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), hem de parlak mor 510 ölü / canlı leke ölü hücreleri tanımlamak için. Seyreltme üreticileri tarafından tavsiye edilen veya daha önce araştırmacılar tarafından optimize bütün antikorları kullanın. 100 seyreltme: Burada tarif edilen deneyler için, 1 tüm antikorlar kullanılır. </li><li> % 2 FBS ile 50 ul 1X PBS tampon boyama hücreleri ve tekrar süspansiyon yıkayın. Floresan verileri bir akış sitometresinde elde edilebilir kadar buz üzerinde tutun. Not: dengeleme parametreleri floresans veri edinimi önce lemfoid doku ve (CD4 ya da CD8&#39;e gibi), ortak bir hücre yüzey antijeni ile önceden iyileştirilmiş olması önemlidir. </li><li> , Sitometri analizi alt akış hücre sayısını arttırmak boyanmış hücrelerin tüm numunelerden veri elde etmek için. </li></ol> 7. Aşağıda belirtilen adımları Tamamladılar standart metodlar kullanılarak Sitometrisi Verileri Analiz <ol><li> Ileri dağılım lenfosit bölgeye Birincisi, kapıyan dağılım (bölge) arsa göre (bölge). </li><li> Ardından, çiftleri analiz önlemek için yan dağılım (genişlik) ileri dağılım (genişlik) kullanarak tek hücre seçin. Bu aynı zamanda, yana saçılım yüksekliği noktalaması ile ileri saçılma yüksekliği ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Daha sonra, soyu üzerindeki kapısı (CD11b, CD11c, CD45R ve / B220) artı ve CD3-pozitif olaylar, dışlamak için makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleri, sırasıyla, ve hedef ise, confine, T hücre bölmesine analizleri, Burada olduğu gibi, T hücrelerinin infiltre değerlendirmek. </li><li> Sonraki canlı / ölü leke hariç, canlı hücreler üzerinde kapısı. </li><li> Son olarak, ilgi hücre popülasyonu üzerinde kapısı (temsilcisi sonuçları bölümüne bakınız). </li></ol>

<ol>
	<li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010:+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions.">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li><li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model:+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis.">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li><li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+psoriasis.">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Innate+Immunity.">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention.">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li><li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells.">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li><li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche.">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li><li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-&#915;+for+autoreactive+CD8++T+cell+accumulation+in+the+skin.">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-&#915; for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).</li><li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions.">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue.">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li><li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis.">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li><li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells:+The+effect+of+trypsin.">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis.">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).</li><li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells.">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).</li><li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice.">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673 (2013).</li><li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation:+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood.">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li><li>Thomas, M. L., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family.">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li><li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice.">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek mali ya da diğer çıkarları hiçbir var.

Atopik dermatit veya sedef hastalığı gibi deri hastalıklarının, kemirgen modellerinde deri lökositlerin değişiklikleri karakterize enflamatuar hücre influksu ve hastalık patolojisi arasında mekanik bağlantılar anlamak için önemlidir. Burada en biyomedikal araştırma laboratuvarlarında bulunan temel donanımları ile cilt dokusundan lökosit izole etmek için ekonomik bir tekniği açıklar. Bu nispeten hızlı bir tekniktir laboratuarlarında zamanında eller en aza indirerek kaynaklarını korumak için yardımcı pahalı doku ayrılma makineleri ve özel tüpler ve reaktiflerin kullanımını önler. Yumuşak enzimatik sindirimi ve süreksiz gradyan ayırma epitel hücreleri ve döküntü ve izole edilmiş hücrelerin çoğunluğu akış sitometrik analizi, hücre sınıflandırılması; transferi, hücre kültürü ve in vitro stimülasyon deneyler de dahil olmak üzere alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir çıkarın. Kollajenaz D enzimatik sindirimi T hücresi yüzey işaretleyici bütünlüğü ve preser üzerinde hiçbir etkisi yokturves hücredeki mevcudiyetini göstermektedir. Bu protokol, kolayca kanadını dışındaki bölgelerde cildin işlemek için modifiye edilebilir. Cildi hasat sırasında bu prosedürün en kritik adımlar vardır 1) iyice herhangi yağ ve bağ dokusu çıkarılması, 2) taşıma ve işleme doku hızla dikkatle), hücre ölümünü minimize 3) yavaşça degrade katman ise hücre verimi en üst düzeye çıkarmak sızan ve 4 degrade arayüzü ayıklanan. Büyük çaplı bir deney başlamadan önce, yoğunluk gradyanlı santrifüj ortam katmanlarını ve arayüz kaldırma uygulama için önemlidir. Bir Bu görmek arasında arayüz çıkarmak için çok daha kolaydır 1X PBS lekeleme tampon maddesi içinde 70 mikron süzgecinden bütün bir sıçangil dalak ezme ve adım 5&#39;te tarif edildiği gibi yoğunluk gradyanı gerçekleştirerek süreksiz yoğunluk gradyanı hasat hücreleri uygulama olabilir % 44 yoğunluk gradyan santrifüj medya ve sp kullanarak% 67 yoğunluk gradyan santrifüj medyanedeniyle, bu bağışıklık hücrelerinin çok sayıda lenocytes. Yoğunluk geçişlerini çalışırken, kabarcıklar ise pipetlenmesini kaçınılmalıdır ve degrade aksamalar minimize edilmelidir. Degrade içeren konik tüp hafifçe ele ve her zaman dik tutulmalıdır. Yoğunluk degrade santrifüj medya çözümleri hep oda sıcaklığında olmalıdır dikkatle devre dışı frenli düşük ivme ayarlanmış yavaş mümkün bırakma hızı, oda sıcaklığında muhafaza santrifüj, ayarlanır ve serolojik pipetör iplik önce dengeli. Infiltre lökositler az sayıda elde cilt hazırlıkları ile çalışırken, hücreler her zaman gradyan arayüzünde görünmez. Bu nedenle, bu arayüzü kolayca bir hücre tabakası ayırt edilemez bile görselleştirilebilir böylece HBSS fenol kırmızısı içeren% 44 yoğunluk gradyan santrifüj ortamı yapmak için önemlidir. Ayrıca, nazik ama çıkartırken hızlı yıkama olmak önemlidirCilt HBSS medyada yerleştirilmeden önce ve cilt dokusunu işleme hücre ölümünü önlemek için. Hücre canlılığı ve saflıkta düşük ise, daha kısa (~ 20 dakika), sindirim kez daha ince doku kıyma kolajenaz D (~ 0.5 mg / ml) ya da biraz daha düşük konsantrasyonlarda yararlı olabilir. Aşırı sindirim ve doku bozulması hücre ölümüne katkıda bulunabilir, çünkü araştırmacılar yeterince büyük bir hücre örneklem büyüklüğü 17 sağlayan minimal sindirim süresini optimize etmek gerekir. Süreç muhtemelen tekniği standardize etmek, bireysel araştırmacıların elinde optimizasyonu birkaç tur gerektirecektir. Kollajenaz D aktivite seviyesi de kullanılan enzimin her bir lot için yapılmış gerekecek üretim çok ve sindirim zaman ayarlamalar arasında değişebilir. Optimizasyon esnasında, bağışıklık hücresi lin gibi güvenilir bir ölü / canlı leke ayak sindirimi ile, bir enzimatik olmaksızın daha çok arıtılabilir leke referans hücre süspansiyonları (örneğin dalak) için önemlidireage belirteçleri (örneğin CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, vb) hücre popülasyonları ve ilgi yüzey belirteçleri doku sindirim sürecinde korunur emin olmak için. Eğer mümkünse, o ileri ölçebilir ve yan dağılım genişliği veya yüksekliği yanı sıra bölge, hücre agrega dışlamak bir akış sitometresinde optimizasyonlar gerçekleştirmek için yardımcı olur. Son olarak, hücre süspansiyonları canlılığı görsel değerlendirme ve genel hücresel morfoloji için ışık mikroskobu altında incelenmelidir. Hücreler ışık mikroskobu altında veya sayım boncuklar kullanarak bir akış sitometresinde% 0.4 Tripan Mavi boya dışlanma kullanarak elle sayılabilir. Eksize dokusunda spesifik hücre tiplerinin daha sıkı miktarının gerektiren çalışmalarda, araştırmacılar tartmak ya da daha önce ve sindirim sonra doku parçalarının hacmini ölçmek ve daha doğru doku varlık mevcut hücre alt sayıları tahmin etmek sindirim ölçüde kullanabilir analiz edilmiştir. Bu bir sınırlamaprotokolü özellikle bağışıklık hücrelerinin saflaştırılması için uyarlanmış olmasıdır. Tek izolasyon, saflaştırma ve başka hücresel nüfus (örneğin deri epitel hücreleri) analizinde ilgilenen varsa, yoğunluk gradyan set-up ve enzimatik protokolü muhtemel ihtiyaç hem de modifiye ve en iyi ilgi hücreleri izole etmek için optimize edilmesi olacaktır sindiremez. Bununla birlikte, bu protokol, hem lenfoid ve miyeloid hücre alt izolasyonu ve saflaştırılması için izin verir ve böylece en immünolojik uygulamalara uyarlanabilir. Başka bir sınırlama bu protokol dermis vs cildin epidermis infiltre hücre popülasyonu ayırt etmek kullanılamaz olmasıdır. Farklılaşma bu seviyede gerçekleştirmek için, bu protokol daha enzimatik dermis ayırmak için ek adımlar ile adapte olmak zorunda ve önce veya burada yerine özetlenen adımlar epidermis olacaktır. Burada, örnekler güçleştirir çok parametreli akış sitometrik analizi kolaylaştırmak için ~ 3 fareden birleştirilmişsebiyolojik çoğaltır arasındaki değişkenliği algılar. Bununla birlikte, tercih edilen alt-uygulamaya bağlı olarak, bu protokol, kolayca elde ve kullanım örnekleri, tek deneklerden için modifiye edilebilir. Son olarak, protokol burada genç sunulan ND4 dişi fareler araştırmacıların ihtiyaçlarına göre farklı yaşlarda, cinsiyet veya soyların fareler için modifiye edilmesi gerekebilir. Özet olarak, yumuşak enzimatik bu kombinasyon sindirimi ve süreksiz gradyan ayırma farelerde inflamatuar deri lezyonları immün hücrelerin saflaştırılması bir basit, etkili ve ekonomik bir yöntem sağlar. Kullanılan ve bağışıklık infiltrasyonu değerlendirmek ve aşağı doğru uygulamalar için lökositlerin saf, uygun bir popülasyonu izole etmek üzere uygun bir araç olarak deri patolojilerin kemirgen modellerinde çeşitli bir aralığı boyunca büyük ölçüde adapte edilebilir.

Kontakt dermatit, egzama, sedef hastalığı, selülit, melanom dışı cilt kanserleri için mantar enfeksiyonları ve apseler arasında değişen cilt koşulları dünya çapında 50 en yaygın hastalıklar arasında olduğu tespit edildi ve 2010 yılında 1 ölümcül olmayan hastalıkların dördüncü önde gelen global neden olur. Buna göre, çeşitli cilt patolojilerin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması araştırma gerekli ve etkin bir alandır. Kemirgen modellerinde, atopik dermatit 2, sedef hastalığı 3 ya da Staphylococcus aureus enfeksiyonu 4 gibi enflamatuar cilt hastalıklarının anlaşılması son derece yararlı olmuştur. Fare deri dokusunun enzimatik sindirimi için, ucuz, etkili ve basit bir protokol daha iyi cilt hastalıklarının patofizyolojisi anlamak için alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hücre preparatları sağlayabilir. Burada, basit ve ekonomik bir yöntem, sıçan derisine enzimatik sindirimi için açıklanandoku ve hücre kültürü, in vivo adoptif transfer için kullanılabilecek cilt süzücü lökositlerin izolasyonu, sitometrik analizi ve ayırma ya da gen ifade etüdlerinde akar. Bu prosedürün genel amacı, tipik olarak, özel reajan takımına ve mekanik dissociators ile ilişkili maliyetlerin en aza düşürülmesini yüksek hücre canlılığı cilt nüfuz eden lökositler için tek bir hücre süspansiyonu hazırlamaktır. Mevcut cilt dokusu ayrılma yöntemleri 5-7 düşük hücre canlılığı ve yüzey işaretleyici bütünlüğü neden veya özel enzim kitleri ve pahalı doku ayrılma makineleri 8-11 gerektirebilir. Fare kulak cilt dokusunun sindirim makul 12-13 yaygın yüksek keratinize deri dokusu sindirim ise (örneğin zayıf) hücresel olmayan kalıntı büyük miktarda kirlenmiş hücre hazırlama neden olabilir. Yeni bir çalışmada, Zeyd ve arkadaşları 2.5 mg 90 dakika fare böğür cildi sindirilmiş / ml dispase, Follo3 mg / ml kollajenaz 7 45 dakika ile evli. Başka bir çalışmada, araştırmacılar, bu tripsin / EDTA, kolajenaz III kullanımı da dahil olmak üzere, 2.5 saat bir araya sindirimi ile birden inkubasyon kullanılan ve 5 dispaz. Farklı üreticilerin tripsin ile tedavi ölçülebilir memeli hücreleri 14-15 hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğünü etkilediği gösterilmiştir gibi tripsin kullanımı enzimatik cilt sindirimi için tavsiye edilmez. Buna ek olarak, dispaz, CD4 ve CD8α T hücrelerinin çoğalma yetenekleri üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve örneğin CD62L 16 ortak T lenfosit aktivasyonu da dahil olmak üzere, en az 20 moleküllerinin yüzey bolluk etkiler. Diğer protokoller sindirim ortamında 6 RPMI 1640 kullanır. Bununla birlikte, RPMI Mg + 2 ve Ca + 2 varlığı detaylı yuvar toplanmasını 17 neden olabilir. Doku ayrışma için ideal bir protokol, yüksek hücre canlılığı, düşük hedeflemelidirHücre toplama ve en az zarar seviyesi hücre yüzeyine. Yüksek kaliteli lenf nodu stromal hücre preparatları kısa enzim inkubasyon, Ca 2 + ve Mg 2 + ücretsiz medya kullanımı protokoller ile gerçekleştirilir ve tripsin önlemek ve 18 dispase oylandı. Bununla birlikte, bu tip protokolleri bütün sıçan derisine ayrışması için tesis edilmemiştir. Burada, bir protokol, ayrışır izole ve alerjen-fare meydan yan yüz derisinden deri süzücü lökositlerin zenginleştirmek için tarif edilmektedir. Kısaca, deri kesilir sindirimi için doku yumuşatmak ve herhangi bir fazla ölü deri ya da yağlı doku kaldırmak için 1 saat süre ile,% 10 fetal bovin serumu içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde önceden inkübe edilir. Bu 0.7 mg ile 30 dakika enzimatik sindirim aşaması izlemektedir / ml kollajenaz D kollajenaz D yapma, en az hücre yüzeyi markerlerinin yoğunluğu üzerindeki etkileri ve in vitro 16,18 T hücresi çoğalması üzerinde bir etkisi yokturyüzey proteinleri karakterizasyonu içeren uygulamalar için son derece uygundur. Enzimatik sindirim takiben, aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj tek hücre süspansiyonu epitel hücreleri ve atıklar giderilmiştir ve hematopoietik hücrelerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Önemli olarak, bu prosedür pahalı sütunlara göre manyetik hücre ayrıştırma reaktifler ve doku ayrılma makineleri 8-11 önler ve bir bazik biyomedikal araştırmalar laboratuarında bulunan ekipman ve malzeme ile yapılabilir. Aşağıda, bu protokolü (19 uyarlanmıştır) önceden duyarlılaştırılmış ND4 İsviçre farelerinde hapten oksazolon (Ox) ile yan yüz derisinden meydan üç kez lökositleri izole etmek için kullanılmıştır. Hücreler çok parametrik akış sitometri kullanılarak analiz edildi. Bu teknik, minimum enkaz ve sitometri etkilenen sk fazla miktarda T lenfositleri ve nötrofiller infiltrasyonu ölçmek için çok parametre akış sitometrisi ile analiz edilmiştir izole edilmiş lenfositlerin&gt;% 95 canlılık ile bir hücre süspansiyonu elde edildiiçinde.

<table><tbody><tr><td>HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25&amp;deg;C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&amp;nbsp;</td><td>Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissolve in 100% EtOH at 50&amp;deg;C for 15 minutes on a rotating plate.</td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD8&amp;alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viability dye for flow cytometry</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Cell analyzer (18 parameters)</td></tr><tr><td>Collagenase D from &lt;I&gt;Clostridium histolyticum&lt;/I&gt;</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&amp;nbsp; Store immediately at -20&amp;deg;C for up to six months.</td></tr><tr><td>ND4 Swiss female mice</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#039;s IACUC guidelines.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Kollajenaz D ortam ile muamele edilmiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında splenositler T hücreleri üzerindeki CD4 ve CD8 a benzer seviyelerde göstermektedir tedavi İlk olarak, T hücre alt üzerinde soy ve aktivasyon belirteçlerinin sıklığı ve yüzey bolluk kollajenaz D olası etkileri kontrol olarak ikincil lenfoid doku kullanılarak değerlendirildi. Splenositlerin bir süspansiyon ND4 farelerden elde edilen ve HBSS ortamı ile 1 saat boyunca yıkandı. (Yukarıdaki bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi), sonra, yarım hücre / ml kollajenaz D 0.7 mg tabi tutuldu. Kalan hücreler kontrol HBSS ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi. Daha sonra, her iki splenosit fraksiyonlar yukarıdaki bölüm 5&#39;de tarif edildiği gibi, bir yoğunluk santrifüj gradyanı kullanılarak işlenmiştir. Hücreler daha sonra yüzeyi CD4 ve CD8α karşı antikorlar ile boyanmış ve akış sitometresi üzerinde analiz edilmiştir. Tek, canlı, CD45 +, non-T soyu - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + hücreleri B hücrelerini, makrofajları, dendritik hücreleri hariç, analiz için geçitlendi. Hücreleri ve% 30 CD4 - - CD4 ve CD8α proteinleri eşit D sindirim kollajenaz uğradığını ve bu yaklaşık% 60 CD4 + CD8α ile enzim maruz olmasaydı splenositlerin yüzeyinde tespit edildi CD8α + hücreleri ya tedavi ile tespit ( Şekil 1A). Bu nedenle, kollajenaz D sindirmek CD4 ve CD8α göreceli sıklığını etkilemedi. Bu alt-yüzey CD4 ve CD8α geometrik ortalama floresan üniteleri (gMFI) yoğunlukları da iki tedavi arasında karşılaştırılabilir; CD4 gMFI değerleri kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 2243 için sırasıyla 2271 idi ve CD8α için gMFI değerleri için 536 idi, enzim ile muamele edilmiş ve kontrol splenosit 520. Enzimatik tedavinin T-hücresi aktivasyonunun yüzey yoğunluğunun hiçbir etkisi C belirteçleriCD4 + T hücreleri (Şekil 1B) üzerine D44 ya da CD62L. CD44 için geometrik ortalama floresan yoğunluğu değerleri için 669 idi kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 654; CD62L için gMFI değerleri için, 1523 idi kontrol splenositler enzim ile muamele edilmiş ve 1517. Kollajenaz D sindirim izole hücreler üzerindeki yüzey proteinlerini, bütünlüğünü koruyan gibi, burada açıklanan protokol sitometri analizi alt akış için güvenle kullanılabilir. Enzim sindirim ve yüksek hücresel canlılığı gögüs deri hücreleri sonuçlarının degrade arıtma Yukarıda elde edilen hücre süspansiyonu, hücre verimi ve yüzde canlılığı, tripan mavi boyasıyla tutulmasına 20 kullanılarak değerlendirildi. Bu sindirim ve degrade ayırma protokolü Ox-meydan farelerde cenah dokusunun mm 2 başına yaklaşık 250 canlı bağışıklık hücrelerini ve araç-meydan farelerde doku mm 2 başına yaklaşık 4 canlı bağışıklık hücrelerini vermiştirdaha önce Ox (Tablo 1) ile hassaslaştırılmıştır. Enzim sindirim ve bağışıklık hücrelerinin sağlam kurtarma gögüs deri hücreleri sonuçlarının degrade arıtma Daha sonra, deri immün infiltrasyonu ölçüde Ox-meydan burada tarif edilen yöntemler kullanılarak deri nüfuz eden bağışıklık hücreleri kurtarma değerlendirmek için kontrol farelerinin bacak eteği izole hücreler üzerindeki CD45 yüzey proteini miktarını analiz ile tespit edildi. CD45 bir pan-hematopoetik soy işaretleyici 21&#39;dir. İleri ve düşük yan dağılım, tek hücreler 95% Ox farelerde görülen (gösterilmemiştir yolluk) ve araç-yükleme yapılmış kontrollerde bu hücrelerin% 71 canlı CD45 + hücreleri (Şekil 2) idi. Infiltre CD45 + bağışıklık hücrelerinde A ~ 67 kat bir artış, burada tarif edilen prosedür (Tablo 1) kullanılarak 3 gün Ox zorlukları, aşağıdaki yan yüz derisinde tespit edildi. Üç böğür Öküz zorluklar T hücrelerinin ve nötrofillerin belirgin infiltrasyonu sonucu Bizim teknik, Gr-1 +, nötrofillerin 22, CD4 T hücreleri ve T hücreleri gibi CD8α myeloid ve lenfoid hücre alt çeşitli tespit etmek için kullanılabilir dış yan yüz derisinden bir hücre popülasyonu bulunmuştur. Bu 7-kat ~ 6-kat, ~ gözlendi ve ~ nötrofillerde 73-kat artışlar, CD4 T hücrelerinin ve CD8α T hücreleri, sırasıyla, 3 günlük Ox zorlukları (Tablo 1), aşağıdaki. Biz elde edilen canlı hücrelerin toplam sayısı çarpılarak bu artışlar hesaplanan akım sitometri analizi sırasında canlı hücreler kapıdan verilen bağışıklık hücre fragmanı oranında (Tripan mavisi dışlanma kullanılarak sayılır). Daha sonra bize veren bir araç kontrol fareleri için ilgili sayı ile Ox-ile tedavi edilmiş farelerde canlı toplam immün hücrelerin sayısını, Gr-1 +, CD4 + ya da CD8α + hücreleri ayrılmıştırlenfosit alt artışları katlayın. CD11b - - CD11c - Ox-ile tedavi edilmiş farelerde hücrelerin ve EtOH ile muamele edilmiş farelerde, bu popülasyonda% 10 Gr-1 +, nötrofiller, tek canlı CD45 + B220% 42 oluşturmaktadır (Şekil 2B). Ox ile tedavi edilen farelerde, ~ kapı CD3 + T hücrelerinin% 52 CD8α + ve • edildi% 34 idi CD4 + araç kontrol grubuna, T hücrelerinin% 9 CD8α + ve% 57 iken, CD4 + (Şekil 2C) . Burada anlatılan teknik, ile, bu nedenle, alerjik ve alerjik olmayan dış yan yüz deri immün hücre alt infiltre yüksek çözünürlüklü akış sitometrik karakterizasyonu için uygun tek hücre süspansiyonları vermek üzere işlenebilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Fare dış yan yüz derisinden hücreleri alt takımlarının </td><td> Öküz / Ox (3) </td><td> Ox / EtOH (3) </td><td> Genişletme katlayın (Öküz / E-metanol) </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> aa 2 dokuya </td></tr><tr><td> Hücre sayısı </td><td> 262,7 </td><td> 5.3 </td><td> 49.3 </td></tr><tr><td> CD45 + hücreleri, bağışıklık </td><td> 250,7 </td><td> 3.8 </td><td> 66.7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 - hücreleri </td><td> 6.5 </td><td> 0.9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> CD4 - CD8 + hücreleri, </td><td> 10.6 </td><td> 0.1 </td><td> 72.9 </td></tr><tr><td> Nötrofiller </td><td> 8.6 </td><td> 1.5 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> Tablo ND4 dişi farelerde alerjik cenah deriden 1. Hücre verimleri. Dış yan yüz derisinden izole edilen Canlı hücreler tis başına toplanmış hücrelere izole deri bölgesine ve fare sayısına göre / mm2 doku mavi Tripan çıkışı kullanarak sayıldı ve normalize edildihazırlık dava. Bu seri spesifik yüzey belirteçleri göre hematopoietik hücre yüzeyi üzerinde bir antijen CD45 ve lemfosit alt-küme verimlerinin tespitine dayanan toplam immün hücre verimi hesaplanmıştır. Bunun üzerine, lenfosit subsetlerinde kat artış veren araç kontrol fareleri için numaralarıyla Ox-ile tedavi edilmiş farelerde hücrelerin sayısı ayrılır. Gösterilen veriler, tedavi başına 2-3 fareden elde edilen verileri temsil etmektedir ve iki bağımsız deneyin temsilcisidir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> Splenositlerin Şekil 1. Enzim sindirim ve gradyan saflaştırma lenfosit alt grupları ve hücre aktivasyonu işaretleri korur. Splenositler kolajenaz D veya HBSS ortam, tek başına ve enkaz ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için, bir yoğunluk gradyanı kullanılarak saflaştınldı, ya kuluçkaya HBSS ortamı, 1 saat süre ile yıkandı. T hücreleri (B220, CD11b, CD11c), CD45 +, canlı soy olarak tespit edildi &lt;sup&gt; - ve CD3ɛ +. CD4 ve CD8α T hücrelerinin frekansı enzimatik sindirimi (A) sonra değişmedi. CD4 + T hücreleri üzerinde CD44 ile CD62L yüzey yoğunluğu enzimatik sindirimi (B) Aşağıdaki değişmemiştir. Gösterilen veriler, tek bir deneyden elde tedavi başına 2-3 fareden verileri toplanmış temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> Şekil 2. Enzim sindirim ve deri hücrelerinin degrade arıtma alerjen meydan fare kanat deri vs kontrolünde belirgin bağışıklık infiltrasyon ortaya koyuyor. Üç böğür Öküz zorlukları önceden duyarlı ND4 İsviçreli farelerde deri-infiltre bağışıklık hücreleri (bir ~ 67 kat artış üretmek A). Üç Öküz zorluklar da provGr-1 + nötrofil (B) &#39;de bir p 6-katlık bir artış oked ve ~ 73- ve CD8α + ve CD4 + T hücreleri, sırasıyla, (C)&#39; nin ~ 7-katlık bir artış. Canlı CD45 + bağışıklık hücreleri, tek ileri ve düşük yan dağılım hücrelerinden kapılı; CD11b - - CD11c&#39;nin - B220 den kapılı nötrofiller ve T hücreleri canlı tek hücreler. Degrade yoğunluk ayırma takip eden 1 Tripan mavi seyreltme: Sayımlar 1 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gösterilen veriler, her tedavi grubunda 2-3 fareden verileri toplanmış ve iki bağımsız deneyler temsilcisi olan temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation at JoVE.com

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Görüntüleme.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

Video: Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Gelişim Biyolojisi

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoitler

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Murin Dermal Lenfatik Kılcal Damarlardan Endotel Hücrelerinin İzole Edilmesi

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Yazar Spotlight: Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Manyetik Boncuk Tabanlı İzolasyonu

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Canlı zayıflatılmış intradermal aşılama sonrasında Fare Deri ve akan lenf düğümü gelen Myeloid Hücre İzolasyonu

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu