המכונים הלאומי לבריאות (NIH R15 NS067536-01A1 לDC), הלאומי וולוודיניה אגודה (הפרס לDC), ומקאליסטר המכללה תמכו ביצירה זו. CB קיבל מלגה מהתכנית בקמן חוקרי מקאליסטר המכללה, ממומנת על ידי ארנולד ומייבל בקמן הקרן. BTF וTM נתמכים על ידי JDRF 2-2011-662. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ייסון Schenkel וד&quot;ר יוליאנה לואיס לייעוץ טכני, וכל החברים הנוכחיים ולשעבר המעבדה Chatterjea לעזרה והתמיכה שלהם.

הערה: נקבות עכברים ישנות 8-12 שבוע ND4 השוויצרי וובסטר, כמקובל שוכנו עם גישה חופשית למזון ומים, שמשו למחקרים אלה פרוטוקול הניסוי בשימוש (B13S1) אושר על ידי IACUC של מקאליסטר המכללה.. 1. רגישות ואתגר עם Oxazolone <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא הרדמה על ידי הוספת 3 מיליליטר isoflurane למגבות סופגים ממוקמות מתחת רשת בתחתית צנצנת זכוכית עפעפי 4 L. לנקבות עכברי ND4 משמשים כאן, זמן בחדר הוא 30-60 שניות עד שהנושא הוא הרדים כראוי; לייעל ממשל הרדמה לשימוש בלחצן העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח בחזרה של כל עכבר הרדים ולאגף באמצעות גוזם שיער בעלי חיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 2% של 4 ethoxymethylene-2-פניל-2-oxazolin-5-אחד (שור) לתוך אתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדיםעכברים בהרדמה isoflurane כמתואר ב1.1.1 ולהחיל של 2% שור 100 μl למגולח בחזרה במספר יישומים הסידוריים של כ -20 μl כל אחד. חכה 5-10 שניות בין יישומים הסידוריים לפתרון לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל כדי למנוע שפיכת 2% פתרון השור באזורים אחרים מאשר הגב, ולחכות לפתרון לייבוש בין יישומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימים 5-7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 1% מ( שור) באתנול מוחלט, ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות על צלחת מסתובבת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות אך בתקיפות לשתק את העכבר בעורפו של בסיס הצוואר וזנב עם בטן כלפי מעלה וצוואר מעט מוטה כלפי מטה (בדומה לאחיזה לזריקת intraperitoneal) ולהחיל של 1% שור 100 μl לאגף המגולח במספר יישומים סידוריים ולקחת את הזמן כדי לייבש את העור לאחר מכן כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכברי שליטה, תחול רכב אתנול מוחלט 100 μl לפלאן המגולחk. </li></ol></li></ol> 2. עור הצלע קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות שאיפת פחמן דו חמצני, ובלו האזור הרצוי של עור אגף (~ 25 מ&quot;מ x 25 מ&quot;מ של עור) עם מספריים כירורגיות 10 סנטימטרים בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין נקי, חד כירורגית, לגרד ממנו את עודפי השומן ורקמת חיבור של עור האגף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 חתיכות של עור אגף מן 3 עכברים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר RT HBSS [עם פנול אדום, ללא סידן או מגנזיום, 5 מ&quot;מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 10 מ&quot;מ 4 (2-hydroxyethyl) -1- חומצת piperazineethanesulfonic (HEPES), ו -10% בסרום שור עוברי (FBS)]. </li></ol> כביסה רקמות 3. טרום עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף תקופת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התוכן של הצינור באמצעות מיקרומטר 70מסננת כדי לבטל את החיץ לשטוף ולאסוף את הרקמה. מסננת אחת ניתן לעשות שימוש חוזר בכל ההליך כולו בתוך קבוצת טיפול ביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים, להעביר את עור האגף מן המסננת לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 10 מיליליטר של תקשורת טרי, RT HBSS (המכיל EDTA, HEPES, וFBS כפי שתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג 12.5 סנטימטר של מספריים לנתח ניתוח השקוע לתוך הצינור, ברר בכל פיסת עור אגף כך שפיסת הרקמה הממוצעת היא כ 2.2 מ&quot;מ x 2.2 מ&quot;מ באזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום המכיל שברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה </li></ol> 4. Collagenase עיכול של עור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את התוכן של הצינור דרך מסננת 70 מיקרומטר, לאסוף ולהעביר את חתיכות עור אגף לתוך צינור חדש 50 מיליליטר חרוטי המכיל 10 מיליליטר fresh, תקשורת RT HBSS בתוספת 0.7 מ&quot;ג / מיליליטר collagenase ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור מקום מכיל בינוני עיכול ושברי עור על צלחת מסתובבת למשך 30 דקות בחממה שאינו בגז יבשה נשמרה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכן מערבולת של צינור במרץ במשך 10 שניות בסוף הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכן מסנן של צינור דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש; לשמור על הזרימה דרך מכיל רקמה מתעכל וזורקים את המסננת ולאגף עור פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הזרימה דרך 50 מיליליטר של תקשורת HBSS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 גרם, ולמזוג supernatant. </li></ol> צנטריפוגה שיפוע 5. צפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סרולוגיות, להוסיף 3 מיליליטר 67% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות RT במלח 1X פוספט (PBS) לתוך צינור חרוטי חדש 15 מיליליטר עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר RT 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בHBSS עם פנול אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ֶנטֶלמֶןשכבת ly 5 מיליליטר של 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות המכילה את התאים על גבי 67% מדגם תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות בעזרת פיפטה סרולוגיות. הקפד להגדיר pipettor למהירות האיטית ביותר, ולמקם את פיפטה לאורך הקיר של צינור חרוטי. היזהר שלא ללחוץ, לשבש, או להפוך את השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההאצה נקבע להגדרה הנמוכה ביותר, להתנתק הבלם, ו צנטריפוגות השיפוע ב931 XG במשך 20 דקות ב RT ולוודא כי צנטריפוגות היא מאוזנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את השיפוע מצנטריפוגות, ועדינות להעביר לספסל המעבדה מחזיק הצינור זקוף. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק 5 מיליליטר, להסיר את שכבת התאים בממשק של תקשורת 44% ו 67% שיפוע צפיפות צנטריפוגה והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. אם הממשק הוא לא נראה לעין, פשוט להסיר על 2 מיליליטר של נוזל בגבול 67% -44%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור חרוטי המכיל תאים מinterface עם 2% FBS בPBS קר כקרח 1X, תאי צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG, ולמזוג supernatant. הערה: זו הפעם הראשונה שיכולים להיות מקוררים התאים / שמרה קרה מאז צעדי עיכול הם על 37 מעלות צלזיוס וצעדי תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות הם ב RT. ניתן להשיג דילול 1 Trypan כחול ורוזנים ומידע כדאיות בנקודה זו: ניתן resuspended תאים ב1. </li></ol> 6. חסימה ומכתים לניתוח תזרים cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק FcγRII / קולטנים שלישי בתאים כדי למנוע הכתמת נוגדן שאינו ספציפית. לניסויים שתוארו כאן, לעשות תערובות אדון הנוגדן בPBS עם 2% FBS המכיל 1: 100 דילול של נוגדן unconjugated נגד CD16 / 32 (2.4G2) כדי לאגד ולחסום קולטני FcγRII / III. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים חסומים בתערובות אדון מתאימות של נוגדנים נגד CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b (M1 / 70), CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 ( 30-F11), CD45R(RA3-6B2), CD62L (MEL-14), וLy-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), כמו גם כתם מבריק ויולט 510 חי / מת לזהות תאים מתים. להשתמש בכל הנוגדנים או בדילול מומלץ על ידי יצרנים או בעבר מותאם על ידי חוקרים. לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בכל הנוגדנים בשעת 1: 100 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים וגלולים בμl 50 חיץ מכתים 1X PBS עם 2% FBS. שמור על קרח עד שניתן לרכוש נתוני הקרינה על cytometer זרימה. הערה: חשוב לי פרמטרים פיצוי מראש מותאמים עם רקמת הלימפה ואנטיגן שטח פני תא משותף (כמו CD4 או CD8) לפני הרכישה של נתוני הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיל את מספר התאים לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח, לרכוש נתונים מדגימות כל תאים מוכתמים. </li></ol> 7. ניתוח cytometry זרימת נתונים תוך שימוש בשיטות רגילה כדי להשיג את הצעדים המפורטים להלן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, שער באזור הלימפוציטים של הפיזור קדימה(אזור) על ידי צד פיזור עלילה (אזור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בחר תאים בודדים באמצעות הפיזור קדימה (רוחב) על ידי צד פיזור (רוחב), כדי להימנע מניתוח כפילויות. זה גם יכול להיות מושלם עם גובה פיזור קדימה על ידי עלילת גובה פיזור צד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, שער על שושלת (CD11b, CD11c, וCD45R / B220) -שלילי וCD3 חיובי אירועים, להוציא מקרופאגים, תאים דנדריטים, ותאי B, בהתאמה, ולתחום ניתוחים לתא תא T, אם המטרה היא, כפי שהוא כאן, על מנת להעריך חדירת תאי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, שער על תאי חיים שלא לכלול את הכתם החי / מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, שער על אוכלוסיית התא של עניין (ראה סעיף תוצאות נציג). </li></ol>

<ol>
	<li>Hay, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Global+Burden+of+Skin+Disease+in+2010:+An+Analysis+of+the+Prevalence+and+Impact+of+Skin+Conditions.">The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).</li><li>Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+immune+events+in+the+murine+contact+hypersensitivity+model:+toward+the+understanding+of+allergic+contact+dermatitis.">Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis.</a> J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).</li><li>Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+psoriasis.">Mouse models of psoriasis.</a> J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).</li><li>Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Innate+Immunity.">Mouse Models of Innate Immunity.</a> Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).</li><li>Mackay, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+CD69+Interference+with+Sphingosine-1-Phosphate+Receptor+Function+Regulates+Peripheral+T+Cell+Retention.">Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention.</a> J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).</li><li>Schaerli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+skin-selective+homing+mechanism+for+human+immune+surveillance+T+cells.">A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells.</a> J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).</li><li>Zaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+skin-resident+memory+T+cells+within+an+epidermal+niche.">Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).</li><li>Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+vitiligo+with+focused+epidermal+depigmentation+requires+IFN-&#915;+for+autoreactive+CD8++T+cell+accumulation+in+the+skin.">A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-&#915; for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin.</a> J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Single-Cell+Suspensions+from+Mouse+Spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator.">Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).</li><li>Nagao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+epidermal+Langerhans+cells+and+langerin-expressing+dermal+dendritic+cells+are+unrelated+and+exhibit+distinct+functions.">Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).</li><li>Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+neural+tissue.">Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue.</a> J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).</li><li>Dudeck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+are+key+promoters+of+contact+allergy+that+mediate+the+adjuvant+effects+of+haptens.">Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens.</a> Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).</li><li>Hershko, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cell+Interleukin-2+Production+Contributes+to+Suppression+of+Chronic+Allergic+Dermatitis.">Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis.</a> Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).</li><li>Tabatabaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+human+amniotic+epithelial+cells:+The+effect+of+trypsin.">Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin.</a> Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).</li><li>Gu, D., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+analyses+during+skin+carcinogenesis.">Cell population analyses during skin carcinogenesis.</a> J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).</li><li>Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Murine+Lymph+Node+Stromal+Cells.">Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells.</a> J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).</li><li>Martinov, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+hypersensitivity+to+oxazolone+provokes+vulvar+mechanical+hyperalgesia+in+mice.">Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice.</a> PloS one. 8 (10), e78673 (2013).</li><li>Katsares, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Accurate+Method+for+the+Stem+Cell+Viability+Evaluation:+The+Case+of+the+Thawed+Umbilical+Cord+Blood.">A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood.</a> Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).</li><li>Thomas, M. L., Lefran&#231;ois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+leucocyte-common+antigen+family.">Differential expression of the leucocyte-common antigen family.</a> Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).</li><li>Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ly6G-specific+monoclonal+antibody+to+deplete+neutrophils+in+mice.">Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice.</a> J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).</li></ol>

יש הסופרים לא כספיים או אחרים אינטרסים לחשוף.

אפיון שינויים בכדוריות דם לבנות עור-תושב במודלים של מכרסמים של מחלות עור כגון אטופיק דרמטיטיס או פסוריאזיס הוא חשוב להבנת קשרים בין מכניסטית זרם תא הדלקתי ופתולוגיה מחלה. כאן אנו מתארים טכניקה חסכונית לבודד את כדוריות דם לבנות מרקמת עור עם ציוד בסיסי שנמצא ברוב מעבדות מחקר ביו-רפואיות. טכניקה מהירה יחסית זה תמנע את השימוש במכונות רקמה יקרה ניתוק וצינורות מותאמים אישית וריאגנטים, עוזרת לשמר משאבים תוך מזעור ידיים על זמן על ספסל המעבדה. האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה להסיר את רוב תאי האפיתל ופסולת, והתאים המבודדים יכול לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים ניתוח התזרים cytometric, מיון תא, העברה, תרבית תאים ובמבחני גירוי חוץ גופית. יש אנזימתי לעכל עם Collagenase D אין כל השפעה על שלמות T פני תא סמן, וpreserכדאיות תא Ves. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות לעבד עור מאזורים אחרים מאשר האגף. השלבים הקריטיים ביותר בהליך זה הם 1) הסרת יסודיות כל שומן ורקמת חיבור בעת קצירת העור, 2) טיפול ועיבוד רקמות במהירות כדי למקסם את חדירת תשואת תא תוך מזעור מוות של תאים, 3) בעדינות שכבות הצבע, ו- 4) בזהירות חילוץ הממשק של השיפוע. לפני תחילת ניסוי בקנה מידה גדולה, חשוב לתרגל שכבות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות והסרת ממשק. אפשר לתרגל תאי קציר משיפוע צפיפות רציף על ידי ריסוק טחול עכברי כל דרך מסננת 70 מיקרומטר למאגר מכתים 1X PBS וביצוע שיפוע הצפיפות כפי שתואר לעיל בשלב 5. זה הרבה יותר קל לראות ולחלץ את הממשק בין תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 44% ובתקשורת 67% צנטריפוגה שיפוע צפיפות באמצעות splenocytes, בשל המספר הגדול של תאים חיסוניים הנוכחיים. כאשר עובדים עם מילויים צפיפות, יש להימנע בועות תוך pipetting, וצריכים להיות ממוזערים שיבושי שיפוע. צינור חרוטי המכיל את השיפוע צריך להיות מטופלים בעדינות והחזיק אנכי בכל העת. פתרונות תקשורת צנטריפוגה שיפוע הצפיפות תמיד צריכים להיות ב RT, pipettors סרולוגיות להגדיר למהירות האיטית ביותר האפשרית השחרור, צנטריפוגות שמרה על RT, מוגדרת נמוכה ההאצה עם הבלם התנתק, וזהירות מאוזנת לפני ספינינג. כאשר עובדים עם הכנות עור שתנבנה מספרים קטנים של לויקוציטים הסתננות, תאים לא תמיד נראים לעין בממשק השיפוע. לפיכך, חשוב לעשות 44% תקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות עם HBSS המכיל פנול אדום כך שניתן דמיין את הממשק בקלות גם כאשר שכבה של תאים לא ניתן להבחין. בנוסף, חשוב להיות עדין אבל מהיר כאשר חילוץ, כביסהועיבוד רקמות עור כדי למנוע מוות של תאים לפני העור ממוקם בתקשורת HBSS. אם כדאיות תא או טוהר הוא נמוכות, פעמים עיכול קצר יותר (~ 20 דקות), ריכוזים נמוכים מעט של D collagenase (~ 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר), או לטחון את הרקמה יותר דק עשויות להיות מועילות. בגלל עשוי לתרום על-עיכול ופירוק של רקמה למוות של תאים, חוקרים יצטרכו לייעל את זמן עיכול המינימלי המספק גודל מספיק גדול מדגם תא 17. התהליך צפוי לדרוש כמה סיבובים של אופטימיזציה בידיהם של חוקרים פרטיים כדי לתקן את הטכניקה. רמת פעילות D Collagenase עשויה גם להשתנות בין המון ייצור והתאמות לזמן עיכול תצטרך להתבצע לכל מנה של אנזים בשימוש. במהלך אופטימיזציה, חשוב השעיות התייחסות כתם תא (למשל טחול) מטוהרות עם ובלי האנזימטית לעכל צעד עם כתם מת אמין חי / כמו גם תא חיסון ליןסמני eage (למשל CD45, CD3ɛ, CD11b, CD11c, וכו &#39;) כדי לוודא שאוכלוסיות תאים וסמנים של עניין משטח נשמרים בתהליך עיכול רקמה. במידת האפשר, כדאי לבצע אופטימיזציות על cytometer זרימה שיכולה למדוד קדימה ורוחב צד פיזור או גובה, כמו גם אזור, להוציא אגרגטים תא. לבסוף, יש לבחון השעיות התא תחת מיקרוסקופ האור להערכה חזותית של כדאיות ומורפולוגיה תאית כללית. ניתן לספור את התאים באופן ידני באמצעות 0.4% הדרת צבע Trypan הכחול תחת מיקרוסקופ אור או על cytometer זרימה באמצעות חרוזים ספירה. ללימודים שדורשים כימות מחמיר יותר של סוגי תאים מסוימים ברקמה הניכרת, חוקרים יכולים לשקול או למדוד את עוצמת הקול של שברי רקמה לפני ואחרי עיכול, ולהשתמש במידת העיכול להעריך בצורה מדויקת יותר מספרים של תת תא הנוכחיים ביצור הרקמה מְנוּתָח. מגבלה אחת של זהפרוטוקול הוא שהוא מותאם במיוחד לטיהור של תאי מערכת חיסון. אם מישהו מעוניין בבידוד, טיהור, וניתוח של אוכלוסייה אחרת סלולרית (למשל עור תאי אפיתל), הגדרת שיפוע צפיפות והאנזימטית לעכל פרוטוקול שניהם סביר צריך להיות שונה ומותאם לבודד הטוב ביותר התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה מאפשר בידוד וטיהור של שני תת תא הלימפה ומיאלואידית ולכן יכול להיות מותאם ליישומים החיסוניים ביותר. מגבלה נוספת היא שפרוטוקול זה אינו יכול לשמש להבחנה בין אוכלוסיות תאים שחדרו דרמיס לעומת האפידרמיס של העור. כדי להשיג רמה זו של בידול, פרוטוקול זה היה צריך להיות מותאם נוסף בצעדים נוספים על מנת להפריד בין אנזימי הדרמיס והאפידרמיס לפני או במקום הצעדים המפורטים כאן. כאן, דגימות נאספו מ~ 3 עכברים כדי להקל על ניתוח התזרים cytometric רב פרמטר ולכן קשהלזהות השתנות בין משכפל ביולוגי. עם זאת, בהתאם ליישום במורד הזרם של בחירה, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות להניב ודוגמאות שימוש מנושאים בודדים. לבסוף, הפרוטוקול מובא כאן לצעירים, נקבות עכברי ND4 ייתכן שיהיו הצורך לשנות לעכברים בגילים שונים, מין או זנים בהתאם לצרכים של חוקרים. לסיכום, השילוב הזה של האנזימטית עדין לעכל והפרדת שיפוע רציפה מספקת שיטה פשוטה, יעילה וחסכונית של טיהור תאים חיסוניים מנגעים בעור דלקתיים בעכברים. ניתן להשתמש בו ומותאם באופן רחב על פני מגוון רחב של מודלים של מכרסמים של פתולוגיות עור ככלי נוח להערכת חדירה חיסונית ולבודד אוכלוסייה טהורה, בת-קיימא של לויקוציטים ליישומים במורד הזרם.

בעיות עור הנעים בין דלקת עור ממגע, אקזמה, פסוריאזיס, צלוליטיס, זיהומים פטרייתיים ומורסות לסרטן העור שאינו מלנום נמצאו להיות בין 50 המחלות הנפוצות ביותר בעולם, והסיבה הרביעית המובילה העולמית של מחלות שאינן קטלניות בשנת 2010 1. בהתאם לכך, החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס מחלות עור שונים הוא אזור חיוני ופעיל של מחקר. מודלים של מכרסמים היו להפליא שימושיים בהבנה של מצבי עור דלקתיים כגון אטופיק דרמטיטיס 2, 3 פסוריאזיס, או זיהום Staphylococcus aureus 4. פרוטוקולים זולים, יעילים, ופשוט לעיכול אנזימטי של רקמת עור עכבר יכולים לספק הכנות של תאים שיכולים לשמש למגוון רחב של יישומים במורד הזרם להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עור טוב יותר. הנה, שיטה פשוטה וחסכונית מתוארת להאנזימטית תקציר של עור עכבררקמה ובידוד של לויקוציטים הסתננות עור שיכול לשמש לתרבית תאים, in vivo העברת מאמצת, ניתוח תזרים cytometric ומיון או מחקרי ביטוי גנים. המטרה הכללית של הליך זה היא להכין השעיה תא בודדת של כדוריות דם לבנות-הסתננות עור עם כדאיות תא גבוהות תוך מזעור עלויות הקשורות בדרך ערכות מגיב מותאם אישית וdissociators המכני. שיטות ניתוק רקמת עור קיימות 05-07 מאי לגרום לשלמות סמן כדאיות תא ומשטח נמוכה, או לדרוש ערכות אנזים מותאמות אישית ומכונות דיסוציאציה הרקמה יקרה 8-11. בעוד העיכול של רקמת עור אוזן עכבר הוא נפוץ למדי 12-13, לעכל רקמת עור keratinized מאוד (למשל מהאגף) יכול לגרום להכנות תא מזוהמות בכמויות גדולות של פסולת בלתי תאית. במחקר שנערך לאחרונה, זייד ועמיתים מתעכלים עור אגף עכבר על 90 דקות ב2.5 מ&quot;ג / מיליליטר dispase, folloנישא ב -45 דק &#39;ב 3 מ&quot;ג collagenase / מיליליטר 7. במחקר אחר, חוקרים אלה משמשים incubations מרובה עם עיכול שילוב של 2.5 שעות, כוללים השימוש בטריפסין / EDTA, collagenase III, וdispase 5. השימוש בטריפסין אינו מומלץ לעיכול עור האנזימטית, כטיפול עם טריפסין מיצרנים שונים הוכח להשפיע מדידה השלמות של חלבונים בתא שטח בתאי יונקים 14-15. בנוסף, dispase יכולה להיות השפעה משמעותית על יכולות שגשוג של תאי CD4 וCD8α T ולהשפיע שפע פני השטח של לפחות 20 מולקולות, כולל סמני הפעלת תא T הנפוץ כגון CD62L 16. פרוטוקולים אחרים משתמשים RPMI 1640 במדיום העיכול 6. עם זאת, הנוכחות של Mg 2 + Ca 2 + בRPMI יכולה לגרום לתא נרחב צבירה 17. פרוטוקול אידיאלי לניתוק רקמה צריך לשאוף לכדאיויות תא גבוהות, נמוכותהרמות של צבירת תא, ונזק מינימאלי לתא חלבוני פני השטח. הכנות תא סטרומה הבלוטה לימפה באיכות גבוהה שהושגו עם פרוטוקולים המשתמשים incubations אנזים קצר יותר, 2 + תקשורת חופשית Ca 2 + וMg, ולהימנע מטריפסין וdispase 18. עם זאת, פרוטוקולים מסוג זה לא נקבעו לניתוק של עור עכבר כולו. כאן, פרוטוקול מתואר לנתק, לבודד, ולהעשיר את כדוריות דם לבנות-הסתננות עור מעור אגף עכבר-תיגר אלרגן. בקצרה, עור נכרת הוא-מודגרות מראש במאוזן מלח הפתרון של האנק (HBSS) עם 10% בסרום שור עוברי עבור שעה 1 כדי לרכך את הרקמה לעיכול ולהסיר את כל רקמת עור או שומן עודף מת. זה ואחריו צעד עיכול אנזימטי 30 דקות עם 0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל collagenase ד Collagenase D יש השפעות מינימליות על צפיפות של סמנים פני תא, ואין כל השפעה על התפשטות תאי T במבחנה 16,18, שהופך אותומתאים מאוד ליישומים הכוללים אפיון של חלבוני פני השטח. בעקבות עיכול אנזימטי, צנטריפוגה שיפוע צפיפות רציפה הייתה משמשת להסרת תאי אפיתל ופסולת מהשעית התא הבודד ולהעשיר לתאי hematopoietic. חשוב לציין, בהליך זה ימנע ריאגנטים יקרים מבוסס עמודת תא מגנטי הפרדה וניתוק מכונות רקמה 8-11, וניתן לבצע עם ציוד וחומרים הנמצא במעבדת מחקר ביו-רפואית בסיסית. הנה פרוטוקול זה שימש כדי לבודד לויקוציטים מעור אגף פעמים תיגר שלוש עם oxazolone hapten (השור) בעכברי ND4 השוויצריים רגישים בעבר (המותאם מ 19). תאים נותחו באמצעות cytometry זרימה רב-פרמטרית. טכניקה זו הניבה השעיה תא עם מינימאלית פסולת ו&gt; כדאיות 95% של לימפוציטים המבודד שנותחו על ידי זרימה רבת-פרמטרית cytometry למדוד את החדירה של לימפוציטים מסוג T ונויטרופילים לsk המושפעב.

<table><tbody><tr><td>HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodium salt solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>Keep sterile until day of usage.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25&amp;deg;C)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&amp;nbsp;</td><td>Use the larger trimmer for shaving the flank and back.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td><td>Dissolve in 100% EtOH at 50&amp;deg;C for 15 minutes on a rotating plate.</td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD3&amp;epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD8&amp;alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>Antibody used to stain cells for flow cytometry</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>Viability dye for flow cytometry</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>Cell analyzer (18 parameters)</td></tr><tr><td>Collagenase D from &lt;I&gt;Clostridium histolyticum&lt;/I&gt;</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/ml in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.&amp;nbsp; Store immediately at -20&amp;deg;C for up to six months.</td></tr><tr><td>ND4 Swiss female mice</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College&#039;s IACUC guidelines.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolation of infiltrating leukocytes from mouse skin using enzymatic digest and gradient separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Collagenase D טופל splenocytes מראה רמות דומות של α CD4 ו CD8 על תאי T בהשוואה לקבוצת ביקורת שטופלה בתקשורת ראשית, כל השפעות פוטנציאליות של collagenase D בשפע התדירות ופני שטח של סמני שושלת והפעלה בתת תא T הוערכו באמצעות רקמת הלימפה משנית כביקורת. השעיה של splenocytes התקבלה מעכברי ND4 ורחצה עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS. לאחר מכן, מחצית התאים נתון של 0.7 מ&quot;ג / מיליליטר Collagenase D (כמתואר בסעיף 4 לעיל). התאים הנותרים היו resuspended במדיום HBSS שליטה. בשלב הבא, שני שברי splenocyte עובדו באמצעות שיפוע צנטריפוגה צפיפות כפי שתואר בסעיף 5 לעיל. תאים אז היו מוכתמים בנוגדנים נגדן CD4 וCD8α, ונותחו על cytometer הזרימה. אחת, לחיות, CD45 +, שושלת שאינו T - (B220 - CD11b -CD11c -), CD3ɛ + תאים היו מגודר לניתוח, שלא לכלול תאי B, מקרופאגים, תאים דנדריטיים. חלבוני CD4 וCD8α התגלו באותה מידה על פני השטח של splenocytes שהיה נתון לcollagenase עיכול D ואלה שלא נחשפו לאנזים עם כ -60% מסוג CD4 + CD8α - תאים ו -30% CD4 - CD8α + תאים מזוהים גם עם טיפול ( איור 1 א). לכן, collagenase D לעכל לא השפיע על השכיחות היחסית של CD4 וCD8α. העוצמות שלהן CD4 ויחידות הקרינה ממוצעת גיאומטרי CD8α (gMFI) בתת אלה היו גם להשוות בין שני הטיפולים; ערכי gMFI לCD4 היו 2,271 לבהתאמה טופל אנזים ו2,243 לsplenocytes שליטה, וערכי gMFI לCD8α היו 536 לטופלו אנזים ולsplenocytes 520 שליטה. טיפול אנזימתי גם לא היה השפעה על הצפיפות של הפעלת תא T משטח סמני CD44 או CD62L על תאי CD4 + T (איור 1). ערכי עוצמת הקרינה ממוצעים גיאומטריים לCD44 היו 669 לטופל אנזים ולsplenocytes 654 שליטה; ערכי gMFI לCD62L היו 1,523 לטופל אנזים ו1,517 לsplenocytes שליטה. כעיכול Collagenase D שומר על השלמות של חלבוני פני השטח בתאים מבודדים, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בביטחון לזרימה במורד הזרם cytometry ניתוח. עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בכדאיות סלולרית גבוהה תשואת תא וכדאיות אחוזים מהשעית התא השיגה מעל הוערכו באמצעות הדרת צבע Trypan הכחול 20. פרוטוקול הפרדת עיכול ושיפוע זה הניב כ -250 תאי קיימא חיסוניים למ&quot;מ 2 של רקמת אגף בעכברי תיגר-שור ועל 4 תאים חיסוניים קיימא למ&quot;מ 2 של רקמה בעכברים-תיגר רכב<html> שרגיש בעבר עם שור (טבלה 1). עיכול אנזים וטיהור שיפוע של תוצאות תאי עור אגף בהתאוששות חזקה של תאי מערכת חיסון בשלב הבא, במידה של חדירת חיסון בעור נקבעה על ידי ניתוח השפע של חלבוני פני השטח CD45 על תאים מבודדים מהאגף של שור-תיגר ועכברים שליטה להעריך התאוששות של תאים חיסוניים-הסתננות עור באמצעות השיטות שתוארו כאן. CD45 הוא סמן שושלת פאן-hematopoietic 21. 95% מנמוכים קדימה וצד-פיזור, תאים בודדים (gating לא מוצג) בעכברי תיגר-שור ו -71% של תאים אלה בבקרה-תיגר רכב היו CD45 + תאי חיים (איור 2). גידול של פי 67 ~ בתאי CD45 + חיסוני חדירה זוהה בעור האגף הבא 3 אתגרי שור יומיים באמצעות ההליך המתואר במסמך (טבלת 1). s = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within-page =&gt; שלושה אתגרי שור אגף &quot;1&quot; לגרום לחדירה בולטת של תאי T ונויטרופילים הטכניקה שלנו הניבה אוכלוסיית תאים מעור אגף שיכול לשמש כדי לזהות מגוון של מיאלואידית ותת תא הלימפה כמו-1 + Gr נויטרופילים 22, תאי CD4 T ותאי T CD8α. אנו נצפו ~ פי 6, 7 ~ פי, ו~ עליות 73 פי בנויטרופילים, תאי CD4 T, ותאי T CD8α, בהתאמה, לאחר 3 אתגרים יומיומיים שור (טבלת 1). חישבנו עליות אלה על ידי הכפלת המספר הכולל של תאי קיימא שהושגו (נספר באמצעות הרחקת trypan כחולה) על ידי אחוז של בר תא החיסון ניתנו מחוץ לשער תאי קיימא במהלך ניתוח התזרים cytometric. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים חיסוניים הכולל קיימא, Gr-1 +, מסוג CD4 +, או CD8α + תאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים המקביל לעכברי שליטה ברכב, שנתן לנולקפל עלייה בתת הלימפוציטים. GR-1 + נויטרופילים היוו 42% מCD45 היחיד, חי + B220 - CD11b - CD11c - תאים בעכברים שטופלו-שור ו -10% מאוכלוסייה זו בעכברים שטופלו EtOH (איור 2). בעכברים שטופלו-שור, ~ 52% של תאי CD3 + T מגודרות היו CD8α + ו~ 34% היו מסוג CD4 +, ואילו בפקדי רכב, ~ 9% מתאי T היו CD8α + ו -57% היו מסוג CD4 + (איור 2 ג) . לכן, עם הטכניקה שתוארה כאן, עור אגף אלרגי ולא אלרגי יכול להיות מעובד להניב השעיות תא בודדות מתאימות לאפיון התזרים cytometric ברזולוציה גבוהה של חדירה תת תא חיסון. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תאים תת עור מאגף העכבר </td><td> שור / שור (3) </td><td> השור / EtOH (3) </td><td> מקפלים הרחבה (שור / Ethanol) </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> למ&quot;מ 2 רקמות </td></tr><tr><td> מספר כולל של תאים </td><td> 262.7 </td><td> 5.3 </td><td> 49.3 </td></tr><tr><td> תאי CD45 + חיסוני </td><td> 250.7 </td><td> 3.8 </td><td> 66.7 </td></tr><tr><td> CD4 + CD8 - תאים </td><td> 6.5 </td><td> 0.9 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> CD4 - CD8 + תאים </td><td> 10.6 </td><td> 0.1 </td><td> 72.9 </td></tr><tr><td> נויטרופילים </td><td> 8.6 </td><td> 1.5 </td><td> 5.6 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. תשואות ניידים מעור אלרגי אגף בנקבות עכברי ND4. תאי קיימא מבודדים מעור האגף נספרו באמצעות הרחקת Trypan הכחולה, ומנורמלים לתאים / מ&quot;מ 2 רקמות המבוססות על השטח של העור מבודד ומספר העכברים ונקווה לTISלתבוע הכנה. חישבנו כוללת תשואת תא חיסון המבוסס על זיהוי של CD45 hematopoietic אנטיגן על פני התא, ותשואות משנה הלימפוציטים המבוססים על סמני משטח שושלת ספציפית. לאחר מכן, חילקו את מספר התאים בעכברים שטופלו על ידי שור המספרים לעכברי שליטה ברכב, נותן לנו לקפל עלייה בתת הלימפוציטים. הנתונים שמוצגים לייצג נתונים ונקווה 2-3 עכברים בכל טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig1.jpg" /> איור 1. טיהור מערכת עיכול ואנזימי שיפוע של splenocytes לשמר תת הלימפוציטים וסמני הפעלת תא. Splenocytes שטף עבור שעה 1 עם תקשורת HBSS, הודגרו עם או D collagenase או תקשורת HBSS לבד ומטוהר באמצעות שיפוע צפיפות כדי להסיר שאריות ותאי דם אדומים. תאי T זוהו כחי, CD45 +, שושלת (B220, CD11b, CD11c) &lt;sup&gt; -, וCD3ɛ +. התדר של CD4 ותאי T CD8α לא השתנה לאחר עיכול אנזימטי (). צפיפות שטח של CD44 וCD62L על תאי CD4 + T לא השתנתה בעקבות עיכול אנזימטי (B). הנתונים המוצגים מייצגים אספו נתונים 2-3 עכברים לטיפול מניסוי בודד. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53638/53638fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53638/53638fig2.jpg" /> איור 2. עיכול האנזים וטיהור שיפוע של תאי עור לחשוף חדירה חיסונית מובהקת בשליטה לעומת עור אגף עכבר-תיגר אלרגן. שלושה אתגרי שור האגף לייצר גידול ~ 67 של פי תאים חיסוניים-הסתננות עור בעכברי ND4 השוויצרי רגישים בעבר ( ). שלושה אתגרי שור גם provאישור מאיזה עלייה ~ פי 6 בGr-1 + נויטרופילים (ב &#39;), ו~ 73- ועלייה של 7 פי ~ של תאי CD8α + CD4 + T ו, בהתאמה (C). CD45 חי + תאים חיסוניים הם מגודרת מתאי פיזור יחידים, נמוכים קדימה וצד; נויטרופילים ותאי T מגודר מB220 - CD11b - CD11c - תאים בודדים חיים. ספירה בוצעה באמצעות דילול 1: כחול Trypan 1 הבא הפרדת צפיפות שיפוע. הנתונים שמוצגים מייצג אספו נתונים 2-3 עכברים בכל קבוצת טיפול, ומייצגים שני ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53638/53638fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation at JoVE.com

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

isolation-infiltrating-leukocytes-from-mouse-skin-using-enzymatic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Views.  Macalester College. This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols. 

Video: Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Developmental Biology

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

בידוד תאי אנדותל מנימי לימפה עורית מורין

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

מחבר זרקור: בידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל לימפה עורית מורין

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation