Bu protokol iki ana nedenden dolayı önemlidir. Birincisi, bir kullanıcının bir hayvan modelinden izole edilmiş deri hücrelerinin hücre döngüsü durumlarını belirleyebilmelerini sağlar. Ayrıca hücre döngüsünün ayrık evrelerinde protein ekspresyonunu analiz edebilmemizi sağlar.
Hücre çoğalmasını belirleyen önceki yöntemlerle karşılaştırıldığında, yöntemimiz hücre döngüsündeki farklı evrelerin daha kesin belirlenmesine izin verir ve hücre bölünmesinin çeşitli aşamalarında 40'tan fazla farklı belirteçleri analiz edebiliriz. Bu büyük ölçüde uygulama ve yöntemin çok yönlülüğünü artırır. Bu protokol kanser araştırmalarında ve hücre döngüsüne özgü protein ekspresyonu desenlerini belirlemeye ihtiyaç duyulan başka bir hastalık türünde kullanılabilir.
Buna ek olarak, bu protokol diğer hücre tipleri ve diğer model organizmalar değiştirilebilir. İlk kez kullanıcı mümkün olan en kaliteli hücre hazırlanması almaya odaklanmalıdır. Bu taze reaktifler kullanarak deneysel cildin zamanında işlenmesini gerektirir, minimal doku sindirim süresi, ve hücrelerin bütünlüğünü ve miktarını korumak için santrifüj sonrası supernatant dikkatli bertaraf.
Başlamak için, el yazması açıklandığı gibi ücretsiz bir online panel tasarım yazılımı kullanarak metal etiketli antikor paneli tasarlayabilirsiniz. Daha sonra IdU tozunu mililitrebaşına 10 miligramlık 60 santigrat derecede 0,1 normal sodyum hidroksitte eriterek Bir IdU stok çözeltisi hazırlayın. Mikrocentrifuge tüpler içine IdU stok çözüm aliquoting sonra, uzun süreli depolama için eksi 20 derece santigrat onları dondurmak.
Kullanımdan hemen önce, IdU çözeltisinin pH'ını 12 normal hidroklorik asitle 7,5'e ayarlayın ve çözeltinin pH 7.5'te olduğundan emin olmak için bir ataliquot üzerinde bir pH şeridi ile test edin. İki x paraformaldehit sabitleme çözeltisi hazırlamak için, beş mililitre 10 x PBS ve bir mililitre 16%PFA ile 44 mililitre saf moleküler dereceli distile suyu birleştirin. 100 milimoler sisplatin çözeltisi hazırlamak için, 10 mililitre DMSO'da 300,5 miligram sisplatin tozunu çözün.
Deneylerin bir gün içinde kullanılması için 10 milimolar kisplatin çalışma çözeltisi hazırlayın. Fareleri tartın ve gram vücut ağırlığı başına 0,1 miligram IdU'da bir doz belirleyin. Bir intraperitoneal enjeksiyon ile IDU hesaplanan doz uygulayın ve hücreleri hasat önce iki saat bekleyin.
Daha önce kulak tabanında İdU enjekte edilen ötenazili farenin kulağını cerrahi olarak çıkarmak için bir çift cerrahi dereceli makas kullanın. Kulağı kuru 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin. Kesme alanının ortasında veya kenarında bir cep oluşturmak için ince forsepsler kullanarak ön kısmı arka deriden dikkatlice ayırın, sonra iki deri kapağını birbirinden ayırın ve hem ön hem de arka derilerle devam edin.
Bir kulağın ön ve arka derilerini, bir mililitre taze hazırlanmış dispase/kollajenaz solüsyonu ile dolu 12 kuyulu bir kültür plakasının bir kuyuya, derinin derma tarafının solüsyona değmesiyle dikkatlice yerleştirin. Cildi sindirmek için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Sindirilmiş kulak veya yenidoğan derisini epidermisin tarafı kabın yüzeyine dokunarak temiz bir Petri kabına yerleştirin.
Forceps kullanarak, deri düzleştirmek ve yavaşça dairesel bir desen kenarlarına merkezinden çalışarak epidermis kapalı dermis slayt. Forseps ile, kenarlarında epidermis kapmak ve yavaşça Petri çanak yüzeyinden soyma tarafından kaldırın. Epidermisini önceden ısıtılmış hücre ayırma solüsyonuna dikkatlice bir tabakanın bir kuyusu halinde yerleştirin.
37 santigrat derecede beş dakika veya oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka. Hücreleri ayrıştırmak için epidermisin isini çanak altına doğru sürükleyerek epidermisin kavrayışına ve temizlenmesiiçin steril çterler kullanın. %1 FBS içeren bir mililitre DMEM ekleyin ve 40 mikrometrelik bir elekten toplama tüpüne geçirin.
DMEM ek iki mililitre ile iyice durulayın ve hücre süspansiyon ekleyin. Beş dakika boyunca 120 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant aspire. Hücre peletini %1 FBS içeren 1-2 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın ve daha önce olduğu gibi hücreleri tekrar peletlendirin.
Canlı ve ölü hücreleri belirlemek için hücreleri etiketlemek için, 25 mikromolar sisplatin içeren bir mililitre dmem bir ila üç milyon hücre resuspend ve bir dakika kuluçka. Eşit hacimde FBS ile boru lama ile söndürün. Beş dakika boyunca 120 kez g santrifüj sonra, seyreltilmiş çamaşır suyu içeren bir beher içine supernatant decant ve bir kağıt havlu üzerine kalan çözüm drenaj tüpleri ters.
İki mililitre baryum katyonsuz PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın ve daha önce açıklandığı gibi tekrar santrifüj edin. Hücreleri onarmak için, baryum katyoniçermeyen PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Sürekli düşük güç altında hücreleri Girdap ve iki x PFA fiksasyon tampon damla akıllıca bir mililitre ekleyin.
Sallanan bir platforma yerleştirin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant decant. Hücreleri iki mililitre baryum katyonsuz PBS ile yıkayın, aynı koşullar altında tekrar santrifüj edin ve yıkama adımını tekrarlayın.
Son olarak, baryum katyon içermeyen PBS iki mililitre pelet resuspend. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice dekant. Bir x fiksasyon tamponunun bir mililitresinde hücreleri yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın ve santrifüjü tekrarlayın.
Hücreleri yıkamak için, barkod permeabilization tampon bir mililitre ekleyin. Hücre santrifüjü sırasında 500 kez g beş dakika, onlara barkod permeabilizasyon tampon 100 mikrolitre ekleyerek barkod hazırlamak ve hemen karıştırın. Barkod permeabilizasyon tampon800 mikrolitre hücre pelet resuspend.
Hücrelere barkod çözeltisi ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj. Hücreleri iki mililitre hücre boyama tamponu ve santrifüjde tekrar yıkayın.
Sonra, nükleer antijen boyama tampon çalışma solüsyonu bir mililitre bir ila üç milyon hücre askıya, ve 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka. 5 dakika boyunca 500 kez g santrifüj sonra, dikkatle supernatant decant. Nükleer antijen boyama permeabilizasyon tampon ve santrifüj bir mililitre hücreleri yeniden askıya.
Tekrar resuspension ve santrifüj sonra, nazik girdap ile kalıntı hacminde hücre pelet yeniden askıya. Hücre içi antikor kokteyl, mix 50 mikrolitre ekleyin ve 45 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Hücre boyama tampon iki mililitre ekleyin.
Bir önceki adımda olduğu gibi aynı koşullar altında tekrar santrifüj ve supernatant kaldırın. Hücre boyama tampon iki mililitre pelet resuspend, beş dakika için 500 kez g santrifüj, ve resususpend ve santrifüj tekrarlayın. Hücreleri bir mililitre intercalation çözeltisinde yeniden askıya alın ve dört santigrat derecede bir ila üç gün saklayın.
Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, aynı koşullar altında hücre boyama tampon, santrifüj iki mililitre ile pelet yıkayın ve aynı santrifüj ile, iki mililitre su ile iki ek yıkama gerçekleştirin. Seyreltilmiş EQ boncuk çözeltisi ile mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonu hücre pelet resuspend ve sonra kitle sitometre üzerinde örnekleri çalıştırın. Erişkin fare kulağı ve yenidoğan derisinden beklenen hücre verimleri ve canlılık belirlenir.
Yaklaşık verim cildin yüzey alanına bağlıdır. Yenidoğan cilt hücrelerinin daha fazla sayıda gerektiren deneyler için daha iyi bir seçimdir. Barkodlu kitle sitometri verilerinin normalleştirilmesi ve deconvolution sonra bozulmamış, tek ve canlı hücreler için seçmek için temel gating stratejisi gösterilir.
Canlı hücrelerin yüzdesi boyama önce hücrelerin kalitesi veya durumu göstergesi olabilir. Kültürlü karsinom hücreleri ile izole fare kulak hücreleri arasındaki canlılık farklılıkları da gösterilmiştir. Canlı hücreler hematopoetik hücreleri dışlamak için olay uzunluğu na karşı CD45'e kapılı idi.
Soy belirteçlerinin eklenmesi, farklı hücre döngüsü evrelerinde ilgi çeken hücre popülasyonlarının seçilmesine olanak sağlar. Temel hücre döngüsü profili floresan bazlı akış sitometrisinde BrdU ile PI'nin saptanması ile elde edilir. Ancak, kitle sitometrisi ile diğer proliferasyon belirteçlerinin dahil edilmesi, hücre döngüsü fazlarının daha kesin bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Bu yaklaşımı takiben, hücre döngüsü profilleri farklı hücre tipleri veya aynı deneyden CD45 negatif karşı CD45 pozitif hücreler için profiller gibi deneysel koşullar için oluşturulabilir. Başka bir örnekte, G-bir fazında EGFR ve mTOR PI3K sinyal yollarını tanımlayan işaretleyicilerin analizinde, turuncu olarak gösterilen CD45 negatif hücrelerde benzer ifade profilleri ve mavi renkle gösterilen CD45 pozitif hücrelerde benzer ifade profilleri ortaya kondur. Kitle sitometrisi çok fazla yüksek kaliteli hücre gerektirir.
Bir kullanıcı nadir bir hücre popülasyonuyla ilgileniyorsa, daha fazla sayıda hücre gerekebilir. İzole canlı hücreler DNA veya RNA analizi, biyokimyasal çalışmalar için kullanılabilir veya kitle sitometriiçin fiksasyon ve boyama öncesinde doku kültüründe kullanılabilir. Kullanıcı paraformaldehit, hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ile çalışırken gerektiğinde kişisel koruma ekipmanı ve bir güvenlik kabini kullanmalıdır.
