Name: identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

tdTomato-etiketli doğal tip ve motorsuz KIF5B Proteinler 1. Klonlama <ol><li> Tablo 1 &#39;de primerler kullanılarak insan vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinleri için cDNAlar yükseltin, Taq DNA polimerazı (100 uL, 5 birim), dNTP karışımı (her bir deoksinükleotit 2 mM) ve 30 devir için 10 X tamponu. Her döngü denatürasyon, aşama (30 saniye için 95 ° C) bir tavlama etabı (30 saniye için 45 ° C) ve bir uzatma aşamasından oluşuyordu (3 dakika için 72 ° C) meydana gelir. </li><li> fenol / kloroform eşit hacimde Yükseltilmiş DNA ürünü ekstrakte (1: 1). Not: Fenol yanıcı ve yanıklara neden olabilir. Kloroform tehlikelidir. Onlarla doğrudan temastan kaçının ve bir kimyasal davlumbaz altında bunları kullanmak. Seçenek olarak ise, PCR ürünleri, çeşitli kitleri ile saflaştırılabilir. <ol><li> 1 dakika için oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g&#39;de dönerler. yeni bir tüpe, sulu çözeltisini ve kloroform eşit hacimde ile ekstrakte edin. </li><li> dönüş0.5 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 xg&#39;de. yeni bir tüpe sulu çözelti aktarın. </li><li> 3 M Na-asetat onda biri hacmi ve mutlak etanol iki hacim sulu çözelti ile karıştırılır. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g&#39;de dönerler. Sulu çözüm atın. </li><li> % 75 etanol, iki hacim DNA pelet yıkayın. Sulu çözelti atın ve 5 dakika hava vermek için oda sıcaklığında DNA pelet kurutulur. 34 ul su DNA pelletini. </li></ol></li><li> sınırlama 40 ul&#39;lik nihai hacimde amplifiye ürünleri sindirmek SalI (10 birim) ve BamHI (10 birim) ve iki saat süre ile 37 ° C &#39;de kendi 10X tampon maddesi 4 ul enzim. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jeli içinde dijeste ürünleri (100 V&#39;ta% 1.0) giderin. Not: Etidyum bromür güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. Nedenle, W, doğrudan ya da dolaylı olarak temas önlemek için önemlidiri etidyum bromür. </li><li> sütunlarla arıtma için doğru bantları kesip. DNA fragmanını içeren agaroz jeli tartılır. Daha sonra yaklaşık 20 dakika süreyle, 37 ° C de çözücü tampon (0.1 g, 300 ul) içinde çözülür. </li><li> 5 saniye boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj bir sütun ve bir dönüş sonuçlandı çözüm ekleyin. flow-through atın. </li><li> adım 1.5 tekrar 0.5 mi solübilizasyon, tampon ile kolon yıkayın. adım 1.5 tekrarlayarak 0.75 ml yıkama tamponu ile tekrar kolon yıkayın. 2 dk kalan yıkama tamponu kurtulmak için sütun Spin. </li><li> adım 1.5 tekrar 50 ul su ile DNA fragmanını yıkayın. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jel (100 V&#39;ta% 1.0), bir DNA büyüklüğü merdiveni karşı bunu bir kısım çalıştırarak DNA fragmanının konsantrasyonu tahmin. </li><li> Daha önce th ile sindirilmiş ptdTomato C1 vektörü 17 (yaklaşık 100 ng) ile saflaştırılmış ürünleri (yaklaşık 100 ng) ligateE aynı restriksiyon 16 saat oda sıcaklığında T4 DNA ligazı (2.000 ünite), 1 ul 10x ligasyon tamponu kullanılarak 10 ul enzim. Not: vahşi tip ve motorsuz mutant sırasıyla 2 ila 963 963 ve 584 amino asit ihtiva eder. Daha önce, daha büyük bir motorsuz KIF5B mutan işlevini 9 tespit etmek için kullanıldı. Daha küçük bir motorsuz KIF5B mutantı olarak ifade seviyelerini arttırmak amacıyla, bu çalışmalar için kullanılmıştır. </li></ol> 2. İmmünofloresan Mikroskopi <ol><li> Canlı hücre ya da ya da 40X aşağıdaki büyütme ile dolaylı flüoresan görüntüleme için, 1 ml komple ortam içinde 0,2-0.300.000 HeLa hücrelerini tohum her bir gözündeki [Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu ile (DMEM) (FBS)] altı plaka. % 5 CO2 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> 40X üstünde büyütme ile dolaylı immünfloresan çalışmaları, kapak gözlük yıkamak için, mutlak etanol kısaca ve (18 mm x 18 mm 1.5 kalınlık) onları havada kurutunBir biyogüvenlik kabini içinde altı plaka kuyuları, kontaminasyonu önlemek için. <ol><li> 1 tohum ,2-0.300.000 hücre altı gözlü bir plakanın her çukuruna DMEM ortamı tam ml. </li></ol></li><li> Transfeksiyon Kompleksinin Hazırlanması <ol><li> Sonraki gün, bir biyo-güvenlik kabini içinde, bir kargo aday protein için bir ekspresyon plazmidi varlığında ya da yokluğunda tdTomato-etiketli doğal tip veya motorsuz KIF5B için ekspresyon plazmidi, 0.6 ug (toplam) seyreltin (pTagCFP-c-myc 5 ) 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı ile. Not: Vector pTagCFP-c-myc TagCFP-etiketli c-myc ifade eder. </li><li> Başka bir 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı transfeksiyon reaktifi 1.8 ul ekle. Tipik olarak, 12 örnek için yeterli seyreltilmiş transfeksiyon reaktif bir ana karışımı hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> seyreltilmiş 0.1 ml DNA&#39;lar seyreltilmiş 0.1 ml transfeksiyon reaktifı ilave edin. Mitüpleri tersine çevirerek içindekileri x. Bir mikrosantrifüj 5 saniye boyunca tüpler Spin. </li><li> Oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Hücrelerin Yıkama <ol><li> transfeksiyon kompleksi oluşumu için kuluçka süresi boyunca serpilmiş hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkanır. </li><li> Her seribaşı hücrelerin orta değiştirin iyi ile 0.8 ml önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı. 37 ° C&#39;de inkübatör plakaları dönün. </li></ol></li><li> Hücrelerin transfeksiyonu <ol><li> 45 dakika inkübasyondan sonra, plakanın her bir DNA / transfeksiyon reaktifi (adım 2.3 hazırlandı) kompleksi damla damla 0.2 ml ilave ediniz. </li><li> bunlar, 37 ° C&#39;de kuluçka makinesine geri döndürülmüştür önce 5 saniye yavaşça 6 plaka sallayın. </li><li> 6-8 saat sonra, tam bir DMEM ortamıyla yapılan orta yerine. </li></ol></li><li> Canlı hücre Floresans Görüntüleme 18 için <ol><li> İnkübasyon karışımını bir ek 16 saat sonraT 37 ° C, 1 uM nihai konsantrasyona kadar orta DNA interkalasyon leke Hoechst 33342 ekleyin. Not: Hoechst 33342 hücre çekirdekleri lekeleyen bir hücre geçirgen DNA interkalasyon boyadır. </li><li> 40X objektif kullanılarak flüoresan mikroskopi ile floresan proteinleri ekspresyonu için bunları incelemeden önce 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 10 dakika süre ile transfekte edilmiş hücreler inkübe edin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) &#39;dir. Not: Arka nedeniyle tam bir DMEM ortamı otomatik floresan yüksekse, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır. </li></ol></li></ol> Dolaylı İmmünoflöresan Çalışmaları 3. <ol><li> Paraformaldehyde Çözüm hazırlanması <ol><li> paraformaldehit tozu (100 ml PBS başına 4 gr) tartılır ve PBS ekleyin. Not: Paraformaldehyde yanıcı katı ve potansiyel kanser hazar olduğunud. Bu gözleri, solunum sistemini ve deriyi tahriş edicidir. Nedenle, bu paraformaldehit ile temas veya inhalasyon önlemek için önemlidir. </li><li> çözeltisi (150 ul 10 N NaOH / 100 mi) NaOH ekleyin. </li><li> Ara sıra çalkalanarak 2-3 saat boyunca 42 ° C&#39;ye kadar 37 ° C&#39;de çözelti tutun. </li><li> eritilir paraformaldehit toz sonra çözelti (yaklaşık 75 ul / 100 mi), buzlu asetik asit eklenerek 7.0 pH&#39;a ayarlamak. </li></ol></li><li> Hedef proteinler Boyama <ol><li> 37 ° C&#39;de 16 saat daha inkübasyondan sonra, 5 saniye için, altı oyuklu plaka dönen tarafından bir kez PBS ile oda sıcaklığında transfekte hücreler yıkayın. </li><li> oyuk başına taze hazırlanmış,% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml hücreleri saptamak. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> bir kez 5 saniye altı-plaka için dönen PBS ile hücreleri yıkayın. çözüm atın. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (PBS içinde) Triton-X-100, 1 ml kuluçkaya bırakılır. dethücre içi hedeflere antikorların erişmesine izin vermek için hücre zarı permeabilize olacak Triton-X 100 ergent. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez hücreleri yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li><li> 4 saat sallayarak, oda sıcaklığında PBS çözeltisi içinde bir% 10 FBS içinde, (0.1 ug / ml c-myc tavşan antikoru veya p53 fare antikoru) birincil antikor 1 ml kuluçkaya bırakılır. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li><li> 2 saat sallayarak karanlıkta, oda sıcaklığında PBS içinde% 10 FBS içinde, (0.5 ug / ml ve Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan veya anti-fare IgG antikoru) fluoresan boya-konjüge edilmiş ikincil antikor, 1 ml kuluçkalayın. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li></ol></li><li> Nükleer Boyama ve Montaj <ol><l10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında PBS içinde (0.5 ug / ml DAPI) i&gt; DNA araya eklenen boyanın 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol, 1 ml kuluçkaya bırakılır. kapak gözlük kullanılmaktadır zaman 3.4 adıma geçin. Not: DAPI hücre çekirdekleri lekeleyen bir DNA interkalasyon boyadır. </li><li> Her bir mikroskop lamı üzerine monte çözeltisi 10 ul uygulanır. bir mikroskop lamı üzerine montaj çözümü üzerinde her cam kapak monte edin. </li><li> gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> oje ile kapak gözlük kenarları mühür. Gecede oje duman kaldırmak için bir davlumbaz içine karanlıkta yerleştirin. </li></ol></li><li> Floresan Mikroskopi 19 <ol><li> Ertesi gün, 40X objektif kullanılarak floresan mikroskop ile hücrelerin inceleyin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) &#39;dir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

Bu yazıda Serbest Erişim yayın ve üretim Roche tarafından ödenir.

tarif edilen yöntem, mikrotübül boyunca hareket yeteneği olmayan motorsuz KIF5B mutant özelliklerini kullanmaktadır, ama aynı kargo proteinleri ile etkileşim tetramerik proteini doğal tipte KIF5B olan dimerler ve böylece izin yeteneğini muhafaza eder yabani tip KIF5B olarak. Motorsuz KIF5B, bu nedenle, kargoyla agrega mislocalized dominant negatif mutant ve form olarak görev yapmaktadır. Bu yöntem (Şekil 1) 5 kinesin-1 kargo c-MYC tanımlamak için kanıtlanmıştır. Bu makalede, aynı motorsuz KIF5B mutant kinesin-1 bir başka potansiyel yük (Şekil 2) ve p53 tespit etmek için kullanıldı. Bu metodoloji Kinesin-1 ve diğer yüklerin tespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir. Bundan başka, mutant özgüllüğü negatif kontrol proteini, c-fos (Şekil 3) mutant etkisinin olmaması sağlanır. Bu protokolde, vahşi ty tdTomato etiketliPE veya motorsuz KIF5B proteinin diğer bir floresan protein-etiketli bir aday kargo proteini ile birlikte eksprese edilmiştir. Bu durumda, canlı hücre, flüoresans mikroskopisi ve görüntüleme gerçekleştirilir. agrega oluşumu time-lapse görüntüleme ile izlenebilir. Alternatif olarak, tdTomato-etiketli protein tek başına ifade edilir ve fizyolojik düzeyde aday kargo protein spesifik antikorlar kullanılarak indirekt mikroskobik tarafından görüntülenmiştir. Floresan protein tdTomato parlaklığı ve Fotostabilitesi 17 için seçilir. Arka plan tam bir DMEM ortamıyla otomatik floresans dolayı yüksek ise, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır. motorsuz KIF5B mutant stoikiometrik doğal tipte KIF5B olan dimerler oluşturur. Bu nedenle, kendi işlevini inhibe etmek ve agregatlar oluşturması için, vahşi tip muadilleri ile dimerleri meydana getirmek üzere motorsuz KIF5B mutantının yeterli miktarda ifade için çok önemlidir. , İfade optimizasyonu bu sorunu gidermek içinmotorsuz mutantının salgılamanın gereklidir. Bu dimerizasyon domenini ihtiva eden küçük bir motorsuz mutantı kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, uygun bir transfeksiyon reaktifi ve protokol optimizasyonu da gereklidir. DNA / transfeksiyon reaktifi ile HeLa hücre inkübasyon süresi ekzojen proteinleri ve hücre canlılığı ekspresyonu için, HeLa hücrelerinde optimize edilmiştir. İnkübasyon süresi, diğer hücre hatları için optimize edilmesi gerekebilir. 40X 4X arasındaki büyütme için, kapak gözlük gereklidir. Hücreler doğrudan kuyularda incelenebilir. Bu nedenle, bu durumda, iletişim kuralı, ucuz ve uygundur. 40X Yukarıdaki büyütme için, hücreler boyandıktan sonra, yağ daldırma hedefleri kapsamında incelenmek üzere mikroskop slaytlar üzerine monte edilmiştir, kuyularda kapak camları yetiştirilir ve edilmektedir. motorsuz KIF5B protein agregatları gözlenmesi sitoplazma büyüklüğü ile sınırlıdır. Tespit etmek kolaydırBirçok memeli hücrelerinde toplar. Bununla birlikte, sitoplazma hacmi çekirdekleri yaklaşık ve nöritlere küçük olduğunda nöronal hücrelerde agrega gözlemlemek nispeten zordur. Protokol, in vivo maya iki-hibrid ve biyokimyasal açılan deneyleri 13-16 ilave olarak KIF5B ve yükler arasındaki ilişkiyi göstermek için kullanılır. Bütün bu deneyler farklı fiziksel koşullarda ilişkisini belirlemek ve bunların sonuçları birbirini tamamlayabilir. Ayrıca, diğer testlere göre, bu flüoresans deneyi avantajı KIF5B ile yüklerin hücre içi lokalizasyonu düzenlenmesini göstermektedir ki, (1 Şekil 2). Protokol KIF5B ile sınırlı değildir ve başka bir kinesin motorların 3 ve yükler 3 hücre içi ulaşım kullanılan miyozin motorlar 23,24 gibi bazı diğer motorlu proteinlerin yükleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu motor proteinler de oligomerization için kinesin motorlar ve miyozin motorlar için mikrofilamentlerin, ve helezonik-coil kesimleri için mikrotübül boyunca hareket için motorlu etki içerir. Çoğu homodimerler 3,23 oluşturur. Bu durumda, benzer bir strateji şekilde yüklerini belirlemek üzere motorsuz baskın negatif mutantlar oluşturarak bunlara uygulanabilir.

Kinesin-1 kendi kargolar 1,2 ileriye taşınmasını aracılık eden motor proteindir. Bu kinesin hafif zincir 1 (KLC1) ve kinesin ağır zincirler, iki alt-birimden (KHCs) iki alt birimden oluşan bir heterotetramer olup. KIF5B 1, bir KHC, N-terminal, ATP hidroliz ile mikro boyunca hareket için mekanik enerjiye kimyasal enerjiyi dönüştürür bir motor fonksiyonun içerir. Bu C-terminal bölgesidir kargoyla ilişkilendiren KLC1, etkileşimde dimerizasyon alanı içerir. Kinesin-1 gibi veziküller, organeller ve mRNA&#39;ların 3,4 olarak kargoları taşır. Son zamanlarda, KIF5B sitoplazma 5 proteozomal degradasyon nükleer transkripsiyon faktörü, c-myc taşımak için gösterilmiştir. Üç yöntemleri (Kimyasal inhibitör, siRNA / shRNA ve dominant negatif mutantı) kinesin-1 fonksiyonunu inhibe etmek için kullanıldı. Hepsi sitoplazmada c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Son yöntem, c-myc, sadece hakim negat etkilenmiştirMutant, genel (mikrotübül bozulması) gibi hücre içi bileşenleri üzerindeki etkileri ya da protein agregasyonu üzerinde uyguladığı etmediğini ortaya koyarak, ilgili başka bir KIF5A motoru proteininin göre KIF5B bir mutantı ive değil. KIF5B dominant negatif mutantı da transkripsiyon faktörleri ile ilgili genel etkilere neden etmediğini ortaya koyarak, bir transkripsiyon faktörü etkilemedi. Aksine, bu dominant negatif mutant kendi kargolar üzerinde spesifik etkileri baskı oluşturduğunu düşündürmektedir. baskın negatif mutantlarının kullanımı motor proteinlerinin alanında yaygındır. kinesinlerin ve Miyosinler Benzer motorsuz mutantlar daha önce kullanılmıştır. Onlar esas olarak kendi kargolar hücre içi lokalizasyonu veya hücresel fonksiyonları 6-12 mutantların etkilerini göstermek için kullanılmıştır. Daha az vurgu mutantlar ve onlar tarafından etkilenen kargoların arasındaki mekansal ilişki konulmuştur. Bununla birlikte, bazı olaylar olarak, mutasyonlar, CA ile birlikte lokalize olduğu gözlenmiştirrgos 6,10. KIF5B ve ilgili proteinler arasındaki etkileşimin daha önce in vivo olarak maya iki-hibrid tahlili ve ko-immünopresipitasyon ve in vitro olarak açılan deneylerinde 13-16 biyokimyasal açılan deneyleri ile teyit edilmiştir. Bu yazıda, ek bir görsel yöntem kullanarak floresan mikroskopi KIF5B kargo proteinleri tespit etmek açıklanmıştır. yöntem, bir baskın negatif mutant olarak hareket eden bir motorsuz KIF5B mutant kullanır. Bu sitoplazmalarında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. 17 tdTomato floresan protein vahşi tip ve motorsuz KIF5B mutantının etiketleme flüoresans mikroskopisi ile görselleştirme sağlar. etiketli KIF5B proteinleri uygun KIF5B etiketten ayrıldı spektral özelliklere sahip bir farklı floresan proteinine aday protein ile birlikte ifade edilebilir. etiketli proteinler canlı hücrelerde doğrudan gözlenirfloresan mikroskobu altında. Motorsuz KIF5B mutant tarafından aday proteini birikiminin indüksiyon aday protein KIF5B in vivo kargo olduğunu teyit edecektir. Ayrıca, tdTomato-etiketli KIF5B proteinleri endojen kargo proteinleri üzerindeki etkilerini incelemek için hücreler tek başına ifade edilebilir. Daha sonra, immünofloresan mikroskopi, bir floresan boya ile konjüge edilmiş uygun bir ikincil antikor, ardından transfekte edilmiş hücreler, sabit ve endojen bir aday proteinine karşı spesifik bir antikor ile boyanmış olan gerçekleştirilir. Bu durumda, kendi fizyolojik olarak endojen Aday Protein incelenmiştir. Diğer motorlu proteinlerinin benzer motorsuz mutantlar da yüklerin tespit etmek hazırlanabilir.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Eksojen c-MYC çekirdeği (Şekil 1A) ağırlıklı çıktı ise yabani tip KIF5B, sitoplazmada homojen çıktı dile getirdi. Ancak, motorsuz KIF5B mutant sitoplazma (Şekil 1A) içinde agrega kurdu. motorsuz KIF5B agregasyonu c-myc agregasyonunu neden olmuştur. hücrelerin yüzdesi düşük doğal tipte KIF5B ifade eden hücrelerde TagCFP-etiketli c-myc birleştirilmiş ifade edilmesi. Bununla birlikte, motorsuz KIF5B (Şekil 1A), birlikte ifade edildiğinde önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. C-myc mutant KIF5B gözlenen ortak yeri (Şekil 1) KIF5B c-myc ve hücre içi lokalizasyonu düzenler ve c-myc Kinesin-1 &#39;deki bir kargo olduğunu göstermektedir. Konstrukt tek başına ifade edildiği Negatif kontroller Şekil 1A alt panelde yer almaktadır. Sonuçlar floresan emissio anlamlı boşaltma yoluyla olduğunu göstermektedirn. Motorsuz KIF5B da endojen c-myc (Şekil 1B) ve transkripsiyon faktör p53 (Şekil 2) &#39;nin birarada toplanmasını neden olduğunu belirten c-myc ve p53 hem Kinesin-1 yükler ve KIF5B hem endojen proteinlerin hücre içi lokalizasyonu düzenler. Birlikte kinesin-1 inhibitörü, c-myc ve p53 5 hem de bengal lakton (RBL) yüksek molekül ağırlıklı türlerin 20 indükler oluşumunu yükseldiğini sonuçları p53 olasılıkla Kinesin-1 bir kargo olup. C-MYC gibi nükleer transkripsiyon faktörü p53, aynı zamanda proteozomal bozulması 21,22 için sitoplazmaya çekirdekten dışa dikkat çekicidir. Motorsuz KIF5B mutantının sentezleme hücre içi lokalizasyonu, c-fos etkiler ya da bir araya getirmek için (Şekil 3) sebep çünkü KIF5B transkripsiyon faktörlerinin hareket spesifiktir. Yukarıdaki veriler metoksi göstermektedirBu yayında kullanılan d kinesin-1 kargoların yüksek özgüllük tanımlanmasına izin verir. Benzer bir strateji, hem de diğer motorlu proteinlerine uygulanabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Şekil 1: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-myc toplama indükler (A) HeLa hücreleri tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı) ve TagCFP-etiketli c-myc (mavi) ile transfekte edilmiştir.. MYC Cı-çekirdeği esas olarak ortaya TagCFP-etiketli ise tdTomato etiketli WT KIF5B sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada filamentli veya noktalı agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Mutant KIF5B ve c-MYC birlikte (pembe) co-lokalize. CFP-c-myc (%) ve bir toplanmayı gösteren hücreler (%) yüzdeleri gösterilmiştir. Sonuçlar olarak gösterilirSD (N = 3) ortalama ±. tdTomato etiketli KIF5B proteinler veya boş vektör (V) ile birlikte TagCFP-etiketli c-myc ekspresyonu ile Negatif kontroller alt panelde gösterilmektedir. (B) Benzer sonuçlar tdTomato etiketli WT, motorsuz KIF5B proteinleri (kırmızı) olarak ifade edilmiştir, endojen c-myc (yeşil) ile elde edilmiştir. tdTomato etiketli motorsuz KIF5B mutant sitoplazmada agrega oluşturulur ve endojen c-myc agregasyonunu neden olmuştur. agrega Her iki tür sitoplazmasında (turuncu) birlikte lokalize eş. çekirdekler boya Hoechst 33342 ve DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Şekil 2: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi t endojen p53 birikmesini uyarmaktadırendojen p53 (yeşil) çekirdekte esas olarak ortaya ederken HeLa hücrelerinde. sitoplazma, eksojen tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı), sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bunun aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi sitoplazma (sarı) içinde KIF5B eş-lokalizasyonu ve p53 ile sonuçlanan, p53 birikmesini arttırmaktadır. Deney üç kez uygulandı. çekirdek boyası DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Şekil 3:. Motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-Fos agregasyonunu indüklemez vahşi tip tdTomato-etiketli (WT) KIF5B (kırmızı) çıktıesas olarak EGFP-c-fos (yeşil) çekirdekte esas çıktı ise HeLa hücrelerin sitoplazması içinde. Aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B İfade c-Fos toplanmasını teşvik etmedi. Deney dört kez uygulandı. hücrelerin çekirdekleri, boya DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ortak ters primer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> vahşi tip KIF5B ileri primer </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorsuz KIF5B ileri primer </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tablo 1: vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinlerini klonlamak için astar dizilerini sıralamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir. 

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Kimya

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Gelişim Biyolojisi

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Moleküler mekikler Powered by geri dönülebilir olarak montaj Kinesins bağlı

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Mühendislik

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Tek Moleküllerin Motilitesi ve S. cerevisiae Hücrelerinden Saflaştırılmış Çift Yönlü Kinesin-5 Cin8 Kümeleri

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Biyokimya

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Kullanımı Akson Kargo Hareketli Moleküler Motors Kompozisyon karakterize &quot;Kargo Haritalama&quot; Analizi

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Nörobilim

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biyoloji

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Dinamik Mikrotübülleri ve İlişkili Proteinleri Görüntülemek için Eşzamanlı Girişim Yansıması ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...