Bu çalışma NIH hibe R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF) ve R01 DE017088 (SGF) tarafından kısmen desteklenmiştir.

Bütün hayvan prosedürleri Los Angeles Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından (protokol 011000) onaylı ve hayvanların etik tedavisi için Sağlık (NIH) kurallar National Institutes göre gerçekleştirilmiştir. Fareler Harbor-UCLA Araştırma ve Eğitim Enstitüsü kampüsünde bulunan bir AAALAC akredite tesis kafesli bulundu. Laboratuar hayvanları hekimliği konusunda uzmanlaşmış bir tam zamanlı veteriner onların bakımını yönetti. Kafes ve hayvancılık ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri yayın &quot;Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu&quot; kurallarına göre sağlandı. Her girişimi insanca fareler tedavi etmek için yapılmıştır. Farelerin hayatta kalışı, sağlık günde üç kez izlenmiştir. Açıkçası hasta, uyuşuk fare grubundan ayrılmış ve acı en aza indirmek için ötenazi uygulandı. Euthanas Panel tarafından tavsiye edilen fareler doz aşımı pentobarbital (210 mg / kg) ile ötenazi uygulandıAmerikan Veteriner Hekimleri Birliği ia. Dokular, Reaktifler ve Araçların 1. Hazırlık <ol><li> Tüm çalışmalar için 20-22 g ağırlığındaki erkek Balb / c fareleri kullanın. Damar içine 1 x 10 6 maya faz C deney grubu başına üç fare inoküle albicans hücreleri. Belirli zaman noktalarında sonrası enfeksiyon hayvanların ve hasat böbrekleri Kurban. Vidalı kapaklı bir tüp içine her bir böbrek yerleştirin daha sonra RNA ekstraksiyonu 6 -80 ° C &#39;de sıvı azot içinde dondurulması ve bir mağaza ek. Not: Xu ve ark detaylı olarak tarif edildiği gibi hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir 6.. </li><li> -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin çıkarmadan önce aşağıdaki reaktifler ve araçları hazırlayın: <ol><li> Toplam RNA ekstraksiyon kiti açın. 2-merkaptoetanol ekleme (% 1 v / v) RLT tamponu ve (her bir örnek için 2 ml hazırlama) iyice karıştırın. </li><li> Fenol hazırlayın: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 (her bir örnek için 600 ul gerekir). </li><li> Etiket M-tipi homojenizasyon tüpleri (M-tüp) ve buz üzerinde soğuk. </li><li> Etiket 2 mi kap tüpleri vida ve her tüpe yaklaşık 300 ul zirkonyum boncukları ekleyin. </li><li> Ara cihazları mevcuttur: Doku ayıracı, beadbeater, 50 ml tüpler ve 96 gözlü levhalar, fotometre adaptörleri ile masa santrifüj. </li></ol></li></ol> Enfekte Dokular 2. RNA Ekstraksiyon <ol><li> -80 ° C derin dondurucuda böbreklerin içeren tüpleri çıkarın ve buz koymak. Her böbrekte 2-mercaptoethanol ile rlt tampon ml 1.2 ekleyin. M-tipi homojenizasyon tüpleri içine tampon ile böbrek Durusu. </li><li> Önceden yüklenmiş ayarı RNA_02.01 bir doku aynştıncı kullanarak böbrek homojenize. </li><li> Oda sıcaklığında, bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Zirkonyum boncuklar içeren vidalı kapaklı tüpe 600 ul Homojenat aktarın. Buz üzerinde kalan Homojenat kaydedin. </li><li> 600 ul fenol ekleyin: kloroform: izoamil alkol 25: 24: 1 ilaÖnceki aşamada elde edilen borular. </li><li> 4 ° C soğuk odada 3 dakika süreyle beadbeater sıkıca kapaklarını kapatın ve vorteks. </li><li> 4 ° C soğuk oda 5 dakika boyunca 15.000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpler. </li><li> Dikkatle, yeni bir 1.5 ml mikrofüj tüpe sulu faz transferi% 70 etanol içinde eşit hacimde iyice karıştırın, daha sonra (iki kez yük) sıkma kolonu üzerine yüklenir. </li><li> Iki kez 500 ul tampon RPE ardından 700 ul tampon RW ile bir kez spin kolon yıkayın. Kuru toplama tüpüne Santrifüj bir ekstra dakika spin kolon kalan sıvıyı çıkarmak için. 8000 x g&#39;de santrifüj tüm adımları uygulayın. </li><li> 50 ul H2O ile Zehir RNA Bir spektrofotometre kullanılarak OD 260 RNA konsantrasyonu ölçün. </li></ol> 3. Gen İfadesi Dijital Çizgi-kodlama kullanarak profilleme <ol><li> Çözülme raportör karakterkümesi (yeşil kapak tüp) ve buz üzerinde yakalama karakterkümesi (gri kapak tüp). </li><li> Yeniden 130 ul hibridizasyon tamponu ekleyinporter karakterkümesi, mix ve aşağı dönmeye ters çevirin. </li><li> 12, reaksiyon tüplerinin her karışımın 20 ul ekle. </li><li> Her tüpe (5 ul bir hacim içinde) toplam doku RNA 10 ug ekleyin. Pipetleme karıştırın. </li><li> Her tüpe 5 ul yakalama karakterkümesi ekleyin. Hızlı bir dönüş aşağı ardından tüp çevirerek karıştırın. </li><li> Isıtılmış kapak O / N (~ 18 saat) ile birlikte, bir termal döngü 65 ° C &#39;de reaksiyonlar inkübe edin. </li><li> -20 ° C den bir numune kartuşunu çıkarın ve oda sıcaklığına sıcak olsun. </li><li> Bir masaüstü santrifüj 2 dakika boyunca 670 x g&#39;de 4 ° C ve santrifüj, iki reaktif plakaları çıkarın. </li><li> Ekranda adım adım yönergeleri izleyerek hazırlık istasyonu kurmak yüksek hassasiyet seçeneği seçin. </li><li> Termal döngü gelen tepkileri çıkarın ve hemen hazırlık istasyonunda yükleyin. Yüksek hassasiyet programı (3 saat) çalıştırmak için seçin. </li><li> Hazırlık istasyonu programı tamamlandığında, kartuşu çıkarın ve net bir bant ile şerit mühür. Apkatlı kartuşun altına mineral yağ (nesil biri için nCounter sadece nesiller bu adımı gerekmez sonrası), daha sonra dijital analizörü üzerine kartuşu yükleyin. </li><li> Yüksek çözünürlüklü tarama seçeneğini ekrandaki adım adım talimatları takip ederek dijital analizörü ayarlayın. </li><li> Tarama programı (~ 4.5 saat), yüksek çözünürlük (600 alanlar) seçeneği seçin çalıştırın. </li><li> Tarama programı tamamlandığında, sonuçlar indirmek (veya e-posta yoluyla sonuçlar almayı tercih) ve üreticinin yazılımı içine ham veri aktarmak. Yazılım otomatik olarak veri kalitesini kontrol etmek ve verilerin kalitesi normal aralığın dışında kalırsa bayrakları çıkaracağız. Daha sonra bir excel dosyası olarak veri ihracat, (yazılım yönergeleri izleyin opsiyonel) Dahili fonksiyonunu kullanarak teknik ayarlama yapın. </li><li> Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak verileri normalleştirmek: codeset tüm genlerden toplam sayıları; Bir ya da birkaç iç kontrol genleri; geometrik ortalamayüksek ölçüde eksprese edilen genler (tartışmaya bakınız). </li><li> Daha sonra farklı deney grupları arasında ifade düzeylerinin oranını hesaplamak, her genin (deney çoğaltır veya üç kez yapıldı ise) için ortalama ifade değerlerini hesaplayın. </li><li> (isteğe bağlı) analiz ve MultiExperiment Görüntüleyici 10 olarak nSolver yazılım veya bir kümelenme programında yerleşik işlevleri tarafından profilleme sonuçları görselleştirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

Bu protokol nanoString nCounter platformu kullanarak mikropların bulaşmasını kopyalanma profilleme optimize etmek için geliştirilmiştir. Bütün prosedür, ifade verileri doku toplama, en az 48 saat gerektirir. Hands-on defa 12 örnek için yaklaşık 4 saat olduğunu. Bu protokolde Bir anahtar değişken ilk aşamada dokuya eklenen tampon RLT miktarıdır. Çok az bir tampon fenol kloroform ile ekstraksiyon adımından sonra, viskoz jellerin oluşmasına yol açabilir ve RNA geri kazanımı için herhangi bir sulu faz bırakabilir ise çok fazla tampon, Homojenat seyreltilmiş ve RNA konsantrasyonunu düşürmek için yol açacaktır. (Tipik boyutları varsayarak) fare dokuları için tampon RLT arasında deneysel olarak tespit uygun hacimleri: böbrek (1.2 mi), dil (1.0 mi) ve akciğer (2.0 mi). Özellikle bu ipliksi formda yetişen mikrobiyal patojenler için, boncuk yenerek adım tamamen hücresel içeriği serbest bırakmak için açık kalın hücre duvarını kırmaya yardımcı olur. Elüsyon adımında, sırayla nihai RNA artırmak içinkonsantrasyon, ilk turu eluatı sütuna geri eklenir ve ikinci kez Zehir olabilir. Yaklaşık 100 ug toplam doku RNA için tek bir RNeasy spin kolon (~ 2 mg / ml x 50 ul) elde edilebilir. RNA daha fazla miktarda gerekli ise, ikinci bir preparatif kalan doku homojenatı yapılabilir. RNA konsantrasyonu ölçülmüştür kadar sadece durumda, kalan homojenatın atmayın. Enfeksiyon modeline bağlı olarak, inokulum büyüklüğü ve patojen suş, toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi% 0 -2% arasında değişir ve genellikle% 0.05% -0.5 aralığında düşüyor. C arasında toplam doku RNA Örneğin, 10 ug albicans ile enfekte saf C 10 ng eşit ham sayıları yaratabilir böbrek bir in vitro kültüründen albicans RNA (10 ng / 10 ug =% 0.1). Toplam doku RNA patojen RNA yüzdesi geniş bir aralıkta değişir, çünkü bu pathoge miktarını bilmek zor olduğuToplam RNA&#39;nın belirli bir miktarda n RNA. Israf karakterkümesi önlemek için tespit seviyesinin altında patojen RNA ile numuneler üzerinde (250 x 192 genleri reaksiyonları için, reaksiyon başına maliyeti yaklaşık 200 $), bir RNA kalite kontrol adımı, her numune içindeki patojen RNA seviyesini belirlemek için gerçekleştirilebilir. Bu S-RTPCR ya da birkaç temizlik genleri ihtiva eden küçük bir karakterkümesi biri ile yapılabilir. Patojen genler kullanılarak Normalleştirme, farklı örnekleri arasında mukayese edilebilir ifade profillerinin önce kritik bir adımdır. Normalleştirilmesi için üç yaygın olarak kullanılan yöntem vardır. Karakterkümesi tüm genlerden 1. Kullanım toplam sayar. 2. Bir veya birkaç &#39;temizlik&#39; genler. 3. geometrik ortalama (N, N sayının ürünün kök th) yüksek ölçüde sentezlenen genlerin. Büyük bir karakterkümesi (&gt; 100 gen), iyi bir seçim olabilir normalleşmesi için toplam sayıları kullanarak, rastgele seçilen sondalar içeren için çünkü ilgisiz genlerin olabilir inanç çok sayıda toplam sayılarıTam RNA girdi miktarı yansıtmaktadır. Küçük bir karakterkümesi (hifal büyüme genleri birlikte düzenlenir eğiliminde olduğu göz önüne alındığında bu tür hifal büyümesi gibi) belirli bir süreç odaklı sondalar içeren (&lt;100 genler), birini seçerek ya da birkaç temizlik genler için normalleşmesi için kontrol şarttır olarak. TDH3, bir sağlam ifade metabolik gen, birçok deneyler için bir kontrol de hizmet vermiştir. Üçüncü yöntem son derece ifade genlerden eşit katkılarından dolayı bir vurgu ile, yöntem 1 ve 2 bir melez. NCounter platformu genom çapında olmamasına rağmen, bu, tek bir deneyde 800 genlerin için ifade seviyesi ölçümü sağlar. Bu nedenle, analiz etmek en bilgilendirici genlerin seçme profilleme başarısı için kritik öneme sahiptir. Prob seçmek için iki yaklaşım kullanılmaktadır. İlk yaklaşım &quot;temelli bilgi&quot; dir. Yayımlanmış ifade ve işlevsel verilerden Bilgi akımına potansiyel ilgi genleri için ekrana derlenmişBu çevresel tepki genlerinin 6-9 olarak çalışma. Bu yaklaşım, in vivo dolayısıyla veri yorumlama bağlamı sağlayan birçok mevcut veri setleri veri profilleme kolay karşılaştırılmasını sağlar. İkinci yaklaşım &quot;tabanlı keşif&quot; dir. Gibi transkripsiyon faktörlerini, kinaz veya hücre duvarı proteinlerinin belirten tüm genler gibi mikrop genomundaki genleri, kategorisi sondaları seçilmiştir. Bu yaklaşım, in vivo verileri 6 profilleme dayalı yeni virülans faktörleri ve yeni düzenleyici ilişkilerin keşif belirlenmesini sağlar.

Gen ifadesi dinamikleri, bir hücre çevresel değişikliklere nasıl tepki hakkında önemli bilgiler tutar. Bir enfekte mikrop durumunda, gen ekspresyon verileri, patojen enfeksiyon ortama uyum sağlar ve konakçıya zarar ilgili klinik açıdan önemli bakış açıları sağlayacaktır. Son yirmi yılda, in vitro ve in vivo hem de gen ekspresyon çalışmaları veri büyük miktarda üretilen ve enfeksiyon biyoloji 1-3 anlamak için bir temel atılmıştır. Bununla birlikte, mikrodizi, RNAseq dahil olmak üzere mevcut profil teknolojileri, enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyonunun profil için optimal değildir. RNA, enfeksiyon oluşmuş doku örneklerinden izole edilmiş toplam RNA&#39;nın ezici kısmı (genellikle&gt;% 99) oluşturmaktadır barındırır. Konak RNA mikrodizinlerinde yüksek arka katkıda bulunur ve dizi RNAseq okur hakimdir. Enfekte dokudan Patojen hücre izolasyonu, teorik olarak patojen RNA için zenginleştirmek için yardımcı olabilir, ancak ek olarak teşkilal problemleri: enfekte doku büyük miktarlarda gerektirir; prosedür sıkıcı olabilir; ve daha da önemlisi, bu uzun bir süreç boyunca yerel durum ya da RNA&#39;nın bütünlüğü muhafaza etmek zordur. Gerçek enfeksiyonları sırasında patojen gen ifadesi üzerinde daha kapsamlı ve doğru veri elde etmek amacıyla, biz karışık RNA nüfusta azınlık RNA türlerinin güvenilir ve uygun maliyetli kantifizasyonunu bir protokol geliştirmek için yola çıktı. NanoString nCounter 4, 5. Bu platform QRT-PCR ile karşılaştırılabilir bir hassasiyet seviyesine sahip enzimatik amplifikasyonu gerektirmez dijital bar kodlu prob çiftleri kullanılarak gen ekspresyonunun doğrudan multiplekslenmiş ölçümü yapar yeni geliştirilmiş bir platformdur. Teknoloji genom çapında değil, her deneyde kadar 800 farklı genlerin saptanmasını sağlar. Bu nedenle, bu profil için problar olarak bilgilendirme genleri seçmek için çok önemlidir. Burada büyük bir uğultu çalışma profilleme gen ifadesini kullanmakÖrnek olarak invaziv enfeksiyon sırasında patojen, Candida albicans, göstermek için: 1) deneysel prosedürleri (protokol) Teknik ayrıntılar, 2) Bu yöntemin duyarlılığı, tekrarlanabilirlik ve dinamik aralık (temsilcisi sonuçları) ve 3) Önemli Bu protokol (tartışma) dayalı deney tasarlama ve gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken noktalar. Bu protokol, kolayca çeşitli patojenler için adapte edilebilir ve başarılı bir şekilde enfeksiyon modellerinde 6-9 bir dizi tatbik edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

En memeli patojenler için, çalışmalar profilleme gen ifadesi doğru enfekte dokulardan patojen gen transkript ölçmek için teknik zorluklar ile sınırlı kalmıştır. Patojen RNA enfekte doku örneklerinden izole edilen total RNA küçük bir bölümünü oluşturmaktadır. Mikroarray ve RNAseq teknolojileri Hem güvenilir zayıf dile patojen genlerin okur üreten zorluklar var. In vivo çoğalması azalmış olan mutant suşlar patojen daha büyük bir sorun teşkil etmektedir. Burada, çok hızlı son derece hassas ve son derece tekrarlanabilir bir in vivo gen ekspresyon profili protokol açıklar. Biz hematojen yaygın kandidiyazis bir fare modelinde mantar patojen Candida albicans bizim soruşturma sırasında bu protokolü geliştirdi. Bu protokolü kullanarak, dinamik düzenlenmiş C. zaman derslerini belgeledi albicans gen böbrek enfeksiyonu sırasında ifade ve keşfedilen beklenmedik özelliklerigen ekspresyon tepkileri vivo ilaç tedavisi antifungal.

Patojen gen ifadesi in vivo profilleme için bir temel zorluk yeterli patojen RNA okur elde etmektir. Toplam RNA, toplam RNA, büyük miktarda patojen transkript düşük yüzdeli verilen (&gt; 10 ug), her bir reaksiyon için kullanılacak sahiptir. Platform bu açıdan benzersiz bir avantaja sahiptir: bir yakalama probu ve ev sahibi RNA ezici bir miktar gürültü önemli bir seviyeye neden olmaz, böylece özgüllüğünü artırmak için bir rapor prob hem kullanır. İki enfekte doku örnekleri (mavi nokta) ham sayıları oluşturulan her şeyden 10. İfade veri iken Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), bir bulaşmamış doku örneğinden arka plan ham sayımları (kırmızı noktalar), tüm 10 altında olduğu Bu protokolü kullanarak son derece tekrarlanabilir. Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, (Ref uyarlanmıştır. 6), ham sayıları iki biyolojik çoğaltır (mavi noktalar, 48 saat sonrası enfeksiyon böbrek örnekleri) çok goo vardıR-kare değeri d korelasyon, 0.945 eşittir. Platform ayrıca doğal biyolojik ifade seviyelerini kapsayacak şekilde yeterli dinamik aralığı sağlar (Şekil 1, ham sayıları 6 1 10 ila 10 arasında değişmektedir). Bir erken gen ifadesi tepki aşı ile 12 saat arasında anlamlı farklılık RNA düzeyleri genleri içerir: 248 çevre yanıt genleri belirten bir prob seti kullanarak, patojen geni (. Ref uyarlanan Şekil 2&#39;de, 6) ifade iki aşamadan ayırt başardık Enfeksiyondan örnekleri (p &lt;0.05 ve&gt; ifadede 2 kat değişiklik), ve geç gen ifade yanıtı 48 saat sonrası enfeksiyon örneklerinde (P 12 saat zaman noktasında arasında anlamlı farklılık olduğu RNA düzeyleri ile genleri &lt;0.05 içermektedir ve&gt; 2 kat ifadesinde değişiklik). Bu sonuçlar göstermektedir C albicans gen ekspresyonu dinamik invaziv infectio sırasında düzenlenirbir memeli konakçının n. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Şekil Ham enfekte olan ve olmayan böbrek dokulardan sayar 1.. (. Ref 6 uyarlanmıştır) Sonda böbrek örnekleri dağılım olarak sunulmuştur iki enfekte (48 saat sonrası enfeksiyon, mavi veri noktaları) ve bir bulaşmamış (kırmızı veri noktaları) için sayar arsa. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> C Şekil 2. İfade albicans çevre duyarlı genlerin invaziv enfeksiyon sırasında (Ref uyarlanan. 6). ekspresyon düzeylerinde değişiklikler 248 C için fare böbrek işgali sırasında albicans genleri bir ısı m sunulmuşturap biçimi. Biyolojik kopyalardaki ortalama değerleri up-regülasyonu (sarı) için gösterilen ve 12, 24. genlerin (mavi), ve 48 saat sonrası enfeksiyon göreli düzenleme aşağı inokulum seviyeleri (0 saat) anlamına. Renk doygunluğu yukarı katlayın veya aşağı-regülasyon 10 tam doygunluk ile ifade değişimin boyutunu temsil eder. Isı haritası bölümleri temsilcisine kadar erken düzenlenen genlerin (üstte), geç genlerin (orta) ve erken aşağı düzenlenen genlerin (alt) göstermek için genişletilir. Bu porsiyonlar halinde, bireysel örnekler tekrarlanabilir göstermek için ayrı ayrı sunulmuştur. Biz aşı ve 12 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi erken ifade değişiklikleri tanımlar. Biz 12 ve 48 saat örnekler arasında önemli farklılıklar gibi geç ifade değişiklikleri tanımlar. Önemi&gt; 2 kat ve bir p-değeri &lt;0.05 değişiklikler anlamına gelir. Ortalama değerler hesaplandı önce her bir numune için veri, kontrol geni TDH3 RNA düzeylerine normalleştirildi. Bizim atama kriterleri bazı Dynamica izinLly düzenlenen genler erken ve geç ifade sınıfları hem içine düşmek. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform at JoVE.com

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Görüntüleme.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Video: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Kanser Araştırmaları

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Gelişim Biyolojisi

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biyomühendislik

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biyoloji

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA'lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan