Name: analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

NOT: Tüm deneysel işlemler UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Kriyoprezervasyon ve Embriyonik Fare Kalpler Fiksasyon. 1.1) embriyonik kalpleri Ek dondurma <ol><li> Optimal Kesme Sıcaklık 3,5 cm petri ve 7 mm&#39;lik cryomolds doldurun (Ekim), orta (Malzeme Tablo). Kimyasal bir kaput, sıvı azot içinde bir 2-difluorobenzil bromür soğutun. </li><li> 10 cm&#39;lik petri kaplannın içinde, 3.5 cm&#39;lik petri kaplarının içine, 10 ml PBS, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 30 ml koyun, ve buz üzerinde her petri kapları yerleştirin. Bir 10 cm&#39;lik çanak ve hamile fare başına birkaç 3,5 cm yemekler hazırlayın. </li><li> Daha önce buz soğukluğunda PBS diseksiyon yapılması, 15 tarif edildiği gibi embriyolar izole edin. </li><li> Kısaca, CO 2 narkoz ve servikal dislokasyon kullanarak hamile kadın euthanize. <ol><li> Karın bir kesi yapmak alo damarları keserek rahim teşrihrahim içi eğrilik ng ve buz soğukluğunda PBS içeren 10 cm&#39;lik bir petri tabağına rahim aktarın. </li><li> Buz soğukluğunda PBS içeren bağımsız bir 3.5 cm Petri için, her bir embriyonun transfer arasında rahim içinde kesilir. 15 anlatıldığı gibi, her embriyo izole edin. </li><li> Ince forseps kullanılarak perikard boşluğu açın aorta, vena kava ve pulmoner venlerin de keserek uzak akciğer ve damar kalp kaldırmak ve OCT içeren 3,5 cm petri içine aktarın. </li><li> Bundan sonra, kalp OCT içeren 7 mm&#39;lik kalıba kalp transferi, birkaç saniye içinde Ekim muvazene edelim. Kalıbın dibine kalbin ön duvarını yönlendirin. </li></ol></li><li> Yavaşça, sıvı nitrojen soğutmalı 2-metilbütan içine kalıp yerleştirin. Kendine iyi bak 2-metilbütan sıvı Ekim veya kalp dokunmak için izin değil. Ekim beyaz katı kadar, sonra kuru buz içeren bir buz kovası için kalıp aktarmak dondurun. Bir sonraki embriyo üzerinde hareket ettirin. </li><li> Wrap cryosectioning için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de folyo ve mağaza cryomolds. </li></ol> 1.2) Alternatif: Paraformaldehit (PFA) sabitleme, soğukta koruyucu ve Ekim embriyonik kalpleri gömme <ol><li> 1x PBS içinde% 4 PFA ile 12-çukurlu bir doku kültür plakasının deliklerine doldurun. </li><li> 1.1.3 açıklandığı gibi embriyonik kalpleri parçalara ayır. Iyi içeren% 4 PFA içine her kalp yerleştirin ve 4 ° CO / N ile sabitleyin. </li><li> Donmaya karşı koruma sağlamak: plastik bir transfer pipeti kullanılarak, PBS içinde 1.5 ml% 15 sukroz ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, her bir kalp hareket ve kalp tüpün dibine batar kadar yavaşça (4 ° C &#39;de O / N birkaç saat ajite ). PBS içinde% 30 sükroz, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ihtiva eden 1.5 ml her kalp transfer ve kalp (O / N birkaç saat) tüpün dibine batar kadar yavaşça tekrar 4 ° C&#39;de çalkalayın. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanarak, Ekim içine Kriyo-korumalı kalp koyun ve muvazene edelimBirkaç dakika fazla sakaroz kaldırmak için, sonra OCT içeren 7 mm kalıp içine kalp aktarın. Kalıbın dibine kalbin ön duvarını yönlendirin. </li><li> Sıvı azot içinde soğutulmuş 2-metilbütan veya kuru buz ya da kalıbı Ekim kalbin dondurun. </li><li> Cryosectioning için hazır olana kadar -80 ° C &#39;de folyo ve mağaza cryomolds sarın. </li></ol> 2. Cryosectioning <ol><li> -17 ° C&#39;ye ayarlayın kriyostat sıcaklığı. </li><li> Talep kriyostat odasına cryomolds ve 15-20 dakika boyunca sıcaklığına gelmesini. </li><li> Cryomold ters çevirin ve kalıp kalp bloğu çıkarmak için hafif baskı uygulayın. Kalıplı doku bloğu üstüne kalbin ön duvarını yönlendirin. </li><li> Aynanın üzerine Ekim büyük bir damla yerleştirin ve aynasının üzerine dondurma Ekim damla üzerine kalp bloğu monte edin. Kalbin ön duvar aynası uzak olacak şekilde yönlendirmeyi tutun. </li><li> Chuck yükleyin ve he monteKriyostat nesne tutucu üzerine sanat bloğu. Bıçağının açısı örnek 3-5 ° &#39;olacak şekilde ayarlayın. </li><li> Pozitif yüklü bir kaplama ile önceden tedavi edilmiştir mikroskop lamı üzerine 10 um bölümler toplamak (Malzeme Tablo). -80 ° C&#39;de saklamadan önce tamamen kurumasını bekleyin. </li></ol> 3. İmmünofloresan <ol><li> Ek Dondurulmuş kesitler için, tamir ve oda sıcaklığında bir çeker ocak içinde, 10 dakika boyunca aseton içinde doku geçirgenliği. </li><li> Hızlı bir şekilde dondurulup PFA sabit bölümler için, Ekim ayrılması için 20 dakika süre ile, PBS% 0.1 Triton X-100 içinde inkübe ve PFA sabit bölümleri geçirgenliği. </li><li> PBS içerisinde seyreltilmiş 1 x bloke edici tampon içinde 45 dakika için Blok. </li><li> Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS% 0.1 Tween 20, 100 (Tartışma) farede üretilen bir birincil antikor kullanıldığında, eşek veya keçi anti-fare IgG (H + L): 1 seyreltilmiş, tek değerli Fab parçası içinde inkübe edilir. </li><li> RT ya da 2 saat süre ile 1x bloke tamponu içinde seyreltilmiş birincil antikor veya antikorlar inkübeO / 4 ° C&#39;de N (özel dilüsyonlarının için Malzemeleri / Ekipman Tablo). </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 1x PBS içinde üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> 1 seyreltilmiş Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor inkübe: 500 ışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 2 saat için bloke edici tampon içinde. </li><li> Işıksız bir ortamda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 x PBS içinde üç kez bölümleri yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı: daha sonra, çekirdek etiket, PBS ile durulayın (ışıktan korunmuş olarak) oda sıcaklığında PBS içinde 2000: Hoechst boya inkübe 1 seyreltilmiştir. </li><li> Sonrası düzeltme oda sıcaklığında 1 dakika boyunca,% 1 PFA bölümleri etiketli. </li><li> Bir lamel ile kaplama daha sonra slayt her ucundaki orta iki damla yerleştirerek ve (çekirdekler zaten etiketli değilse DAPI ile) Dağı, anti-solmaya ortamında slaytlar. Mühür oje ile lamelleri. Mağaza görüntü hazır olana kadar 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş bulunmaktadır. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme ve Görüntü Analizi <ol><li> Uygun lazer dalga boylarında, kamera ve mikroskop konfokal inc açınsahne taşıyıcı ve z motoru luding. Görüntüleme yazılımı programı başlatın. Sırasıyla Hoechst-, Alexa 488- ve Alexa 568-boyanmış kesitler görüntülenmesi için 405, 488 ve 561 lazer dalga boylarını kullanarak. NOT: Bizim donanım ve yazılım özellikleri için Malzeme Tablosu bakın. </li><li> Slayt sahnede kontrol slayt (ters mikroskop için aşağı lamel) monte edin. </li><li> 4X objektif kullanılarak, (Malzeme Tablo) örnek ve ilgi alanını bulmak. Yüksek büyütme görüntüleme yaparken bir harita olarak kullanmak için görüntüyü yakalamak. </li><li> Slayt sahneye az ayarlamalar yaparak, slayt çıkarın. 60x immersiyon yağı hedefi değiştirin, (Malzeme Tablo) objektif yağ küçük bir damla koyun ve slayt sahneye (aşağı lamel) slayt değiştirin. </li><li> Yine örnek bulun. Her kanal için istenen seviyelere lazer gücü, pozlama süresini ve binning ayarlayın. NOT: Biz genellikle lazer 0.8 gücünü, 100 msn kamera pozlama süresini ve 2 binning kullanın (see Malzemeleri Masa) donanım ve yazılım özellikleri için; Optimal ayarları ampirik her bir deney için tespit edilmesi gerekmektedir. <ol><li> Optimal ayarları belirlendikten sonra, deney içinde tüm doku bölümleri için aynı ayarları kullanabilirsiniz. (Bu bilgi analizi için kullanılacak) Her kanal için optimum yoğunluk aralığını dikkat yoğunluk histogramı kullanın. </li></ol></li><li> Sonra z yığının üst ve alt sınırlarını seçin, uygun lazer kanalları seçin: edinim fonksiyonunu kullanarak az yığını oluşturun. Yazılım tarafından sağlanan optik dilim kalınlığı bir buçuk değer az yığın adım boyutunu seçin. Görüntüleri toplamak için &quot;run&quot; tıklayın. </li><li> Fiji 16 veya görüntü analizi için benzer bir program kullanın. Fiji içinde, Özel renk modu seçeneği ve ayrı pencerelerde bölünmüş kanallar z yığın dosyasını açın. Menüsünden açılan Image &quot;Parlaklık / Kontrast Ayarı&quot; aracını açın; Her bir kanal içinde, sve optimum histogram yoğunluğu aralığı 4.5.1 belirledi. Tüm z yığınlarının bu kanal aralıkları uygulayın analiz edilir. </li><li> Image-&gt; Renk açılan menüsünü kullanarak tek bir kompozit görüntü içine tek tek kanalları Birleştirme. </li><li> Tuşlayın-&gt; Stacks-&gt; z proje menüsü kullanılarak kompozit görüntü düzleştirilmiş z yığını oluşturun. Bu görüntü 3D görüntü önemli ölçüde daha parlak olacaktır; kontrol örneği doyma önlemek ve deneysel düzleşmiş z yığını aynı ayarları uygulamak için histogram yoğunluk aralığını ayarlayın. </li><li> 3D görüntü oluşturmak için, önce kullanmak Image-&gt; Stacks-&gt; 3B proje menüsü 17. X ekseni veya dönme y-eksenini birini seçin. Z yığın adım büyüklüğü gibi mikron aynı sayıda olarak dilim aralığı ayarlayın. Istenen toplam rotasyon seçin ve sonra Eklentiler açılan menüden Image J 3D Görüntüleyici açmak 1. dönme açısı artışını ayarlamak. Cilt kompozit 4.8 oluşturulan görüntü, ekran seçin, ve Re set1 ya da 2 faktör örnekleme yapılmasıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ventricles.">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li><li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+junction:+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc.">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li><li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha,+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes.">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li><li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation/compaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+(LVNC).">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture.">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li><li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes.">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li><li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils.">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li><li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costameres,+focal+adhesions,+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology.">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li><li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development.">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li><li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-RAP+expression+during+mouse+heart+development.">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li><li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart.">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li><li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle.">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274 (2010).</li><li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis.">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li><li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+immunohistochemistry:+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades.">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li><li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart.">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li><li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart:+assembly+of+Z-disk,+M-line+and+the+thick+filaments.">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

uygun doku fiksasyon tekniği ve seyreltme ampirik her bir antikor için belirlenmelidir. Elimizde olanlar, ek donma s-α-aktinin, β-katenin, β1-integrin, tropomiosin, Talin ™ (gösterilmemiştir) ve N-kaderin dahil olmak üzere birçok kardiyomiyosit antijenleri, PFA tespit üstündür; aksine, PFA tespit fokal yapışma kinaz için daha iyi sonuçlar elde edilir (gösterilmemiştir). PFA tarafından oluşturulan protein çapraz bağlarının epitopları ve sınır antikor bağlanma maskeleyebilir; antijen geri alma gibi durumlarda gerekli olabilir ve antijen alma yöntemleri başka 20 bulunabilir. PFA konsantrasyon veya Sabitleme uzunluğu ampirik her bir antikor için ve her bir gelişme aşamasında tespit edilen optimal şartlara epitop maskeleme azaltmak için azaltılabilir. Primer antikor kontrol olarak bağışıklık-öncesi serumun bir &quot;birincil antikoru&quot; co içeren yeni bir antikor ya da kardiyak mutantını karakterize ederken, uygun negatif kontrollere kullanılmalıdırntrol. Nakavt farelerin kullanılması ideal bir negatif kontrol ancak erken öldürücülüğü burada okudu gen ürünlerinin çoğu için kullanımını önler. Yeterli hacimlerinin kullanımı tamamen aynı immunofloresan engelleme, antikor deney ve kontrol slaytlar batırmak için, ve çözümlere bölümlerin tek tip pozlama sağlamak için inkübasyon sırasında slaytlar nazik sallanan olarak yıkama çözümleri önemliydi. Bu yaklaşım, bir deney içinde bölümlere ve slaytlar arasında boyanarak teknik değişkenlik minimize. Maliyetli antikor çözeltisi hacmi sınırlar olduğunda, doku bölümleri dışında çözüm akışını sınırlandırmak ve uzun inkubasyon sırasında bir nemlendirilmiş oda içinde slaytlar tutmak için Pap kalem kullanın. Bir monoklonal fare birincil antikor - ve bu nedenle, bir anti-fare ikincil antikoru - kullanılıyor, endojen fare immünoglobülinleri kapsayacak şekilde ikinci bloke edici aşama, spesifik olmayan arka plan sinyali azaltmak için gerekli olan (adım 3.4) olur. Uygun mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri biyolojik doğru bilgi edinme 21 için kritik öneme sahiptir. Her renk için - (16-bit görüntü için 65535 seviyesi 0) yoğunluk histogramı her yoğunluk seviyesinde piksel dağılımını gösterir. Arka plan, parlaklık, kontrast ve Histogram tepe kuşatan bir yoğunluk görüntü aralığını ayarlayarak ayarlanabilir; koşulları arasında geçerli karşılaştırmalar yapmak, kontrol ve deney koşulları arasında aynı ayarları kullanılmalıdır. Bu protokol, yerli embriyonik fare kalbinde kardiyomiyosit olgunlaşmasını ve gelişmesini analiz etmek için güvenilir bir yöntem sağlar. Kardiyomiyosit-spesifik proteinlerin immünofloresan sık sık gelişimi sırasında kardiyomiyositlerde işaretlemek için kullanılır iken, birkaç çalışmada yüksek çözünürlüklü myofibril yapının analizi ve birleştirilmiş diskler ve costameres 12-14,22,23 çıkışına izin tekniklerini kullanır. Bu teknik, v için kullanılabilirYapısal anormallikler mekanizmalarına ışık tutabilir kardiyomiyosit olgunlaşmasında değişikliklerin belirlenmesi bir aracı olarak, gelişimsel kalp kusurlarına neden mutasyonlar ivo değerlendirmesi.

Kardiyomiyositler orta hatta göç ve doğrusal kalp tüpü 1,2 formu sonra gelişimi sırasında, kalp kasılmaları yakında başlayacak. sarkomer kardiyomiyosit içinde temel kasılma birimidir; Bu son derece organize iskelet yapısı sarkomerik α-aktinin (s-α-aktinin) ve M hattına demirlemiş miyozin lifleri (Şekil 1) Z-disk demirlemiş aktin filamentleri içerir. Kardiyomiyosit olgunlaştıkça, sarkomer hücrenin boyunca uzanan Miyofibril oluşturmak için seri araya. Miyofibril birleştirilmiş disk tarafından kardiyomiyosit uçlarına tespit edilir, örneğin s-α-aktinin 3 adherens Z-diski elemanlarının bir alt kümesi ile bir geçiş birleşme içeren hücre-hücre birleşim yapısı, örneğin N-kaderin olarak birleşme proteinleri ve β katenin, boşluk birleşme proteinleri ve dezmozomlar (Şekil 1) 4. Uzunlamasına zarının, aynı zamanda çevresel myofibrils Z-diskler boyuncacostameres yoluyla hücre membranına bağlanabilir; Bu özel fokal yapışmalarda (Şekil 1) 4 myofibril, plazma membranı, ve kardiyomiyosit yapıya ilave bir yapısal destek sağlamak için, hücre dışı matris arasındaki bir çapa sağlar. Erken kalp gelişiminde, kardiyomiyositlerde ventriküler boşluk içine çıkıntı yapan ve nispeten olgun Miyofibril 5 içeren, bağ olarak da bilinen parmak şeklinde çıkıntılar olarak düzenlenmiştir. Kalp geliştirme ilerledikçe, alt-epikardiyal bölgede kardiyomiyositler ventriküler duvarları içermektedir, ancak sarkomer ve myofibril montaj trabeküler miyokardın 5,6 ile karşılaştırıldığında gecikmiş olan kompakt miyokard oluşturmak için çoğalırlar. Sarkomerinde ve myofibril montaj modelleri kültürlü basit ama bir üç boyutlu ortam, kan akışını eksikliği kardiyomiyositlerinde 7-10, ve diğer kardiyak hücre ile temas üzerine immunofloresan çalışmaları büyük ölçüde geliyorin vivo mevcut s. fare embriyonik merkezinde immünoflüoresans kullanarak Yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar teknik olarak zorlu ve birkaç çalışma fare kalp gelişimi sırasında birleştirilmiş diskler ve costameres ortaya çıkmasını incelemiş bulunuyoruz. katenin β adherens kavşak proteini embriyonik gün birleştirilmiş diskler (E) 17.5 11, N-kaderin doğum sonrası gün 0 13 karşı E18.5 12 ile birleştirilmiş diskleri temsil edebilir lineer yapılara lokalize ve costameres tespit edilmiş lokalize görünüyor E18.5 14, ama bu proteinler önceki gelişimsel zaman noktalarında 11-13 de yaygın ve daha sürekli zar dağılımını gösterir. Burada, biz intercala ortaya çıkması da dahil olmak üzere myofibril kardiyomyosit gelişimi ayrıntılı analizi, olanak immün ve kesitli fare embriyonik kalplerin floresan mikroskopi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem tarifted gibi erken E12.5 E16.5 ve de doğmakta olan costameres olarak diskler. Bu protokol, sarkomer oluşumu gibi myofibril kardiyomyosit olgunlaşması üzerindeki mutasyonlar etkilerini tarama için de yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>This size not available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>&quot;Plus&quot; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western Blocking Agent</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td></tr><tr><td>Anti-s-&amp;#945;-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;catenin antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9587s</td><td>Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;1 integrin antibody</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF2405</td><td>Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-tropomyosin antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>CH1</td><td>Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-talin antibody</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 dye</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td><td>Keysight (formerly Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X air objective</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td><td>Nikon&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

Kalp gelişimi sırasında, miyokard özgü yapısal ve işlevsel sarkomer, kasılma myofibrils, interkalasyonlu diskler dahil birimler ve costameres nesil zaman ve mekan içinde birden çok bileşenden koordineli birleşimi gerektirir. Bu bileşenlerin montajında ​​bozulması gelişimsel kalp kusurları yol açar. Immunofluorescent boyama teknikleri myofibril olgunlaşmasını prob kültürlü kardiyomiyositlerde yaygın olarak kullanılan, ancak bu ex vivo yaklaşım myocytes tam endokardiyal ipuçları kültürünü, normal vivo mekanik girdilerin eksikliği ve yokluğu olarak ayırt edecek hangi ölçüde sınırlıdır. Fare kalp geliştirme çalışmaya immunofloresan tekniklerinin uygulanması arzu ama daha teknik açıdan zor ve yöntemler sıklıkla kalp gelişiminin erken dönemlerinde sarkomer görselleştirmek için yeterli hassasiyet ve çözünürlük eksikliği. Burada, biz mu-immunostain co sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntem tarifltiple proteinler veya embriyonik fare kalbinde immunofluorescent boyama ile bir floresan proteini birlikte görselleştirmek ve gelişmekte Miyofibril, interkalasyonlu diskleri ve costameres analiz etmek için bu yöntemi kullanın. Bu yöntem ayrıca gelişimsel kalp kusurlarına yol mutasyonlar neden kardiyomiyosit yapısal değişiklikleri değerlendirmek için uygulanabilir.

Bir çırpıda dondurulmuş ve aseton-sabit kalbinde farklı proteinlerin ortak boyama için 6 gösteri tipik sonuçlarla 2 Şekil. Söz konusu antikorun yeniden üretilebilir etiketli Z diskler, yüksek seçicilik ve en az bir arka plan (Şekiller 2A, 3A, 4A, 5A, 6A ve 6C) ile birleştirilmiş diskler s-α-aktinin Şekil 6 göstermektedir ki, anti-fare IgG (H + L), tek değerli Fab parçası etkili bir şekilde engeller, endojen fare IgG anti-fare ikincil antikorlar ile bağlanma. katenin β adherens birleşme proteinine karşı antikor kardiyomiyositlerde olmayan kardiyomiyosit hücrelerin hem de zara bağlı ve beklendiği gibi s-α-aktinin ile birlikte yeri, E16.5 (Şekil 2C ve D) olduğu varsayılan birleştirilmiş diskler oluştu Yetişkin kalp 18 β katenin boyama desen. βEmbriyonik merkezinde 1 integrini immünofloresan özellikle zordur ve çoğu zaman fokal yapışmalarda 14 tanımlamak için başarısız olur, ancak bu çalışmalarda β1 integrin boyama muhtemelen en oluşturucu oluşmakta olan costameres yansıtan s-α-aktinin etiketli Z diskler gibi eşit periyodikliğe sahip bir sinyal ortaya E16.5 (Şekil 3D). E12.5, s-α-aktinin ve tropomiosin (sarkomer ince filaman proteini) imüno-s-α-aktinin bu hücreler (Şekil 4A ve 5A&#39;da olgun myofibrils tutarlı trabeküler kardiyomiyositlerde normal periyodik bir boyama modeli ortaya koymuştur Şekil 4B tropomiyozin için). Muhtemelen interkalate diskleri temsil E12.5 kalpleri de trabeküler kardiyomiyositler N-kaderin boyama yoğun s-α-aktinin boyama alanlarında (C - - D ve Şekil 6A Şekil 5B) ile colocalize eğiliminde. Içindetrabeküler miyositlerine kontrast, kompakt bölgede s-α-aktinin doğrusal daha noktasal oldu, ve tropomiyozin boyama yaygın ziyade doğrusal oldu (Şekil 4A ve 4B). Böylece, sarkomer montaj trabeküler miyokarda göre kompakt daha sonra ortaya çıkabilir. Ayrıca, kompakt bölgesinde s-α-aktinin ve tropomiyozin ayırıcı desenler ince filament içine dahil edilmesine tropomiyozin myofibril mecliste bir sonraki olay olabilir iken bu s-α-aktinin, puncta ve erken olgunlaşmamış Z-diskler içine düzenler öneririz. Şekil 7, Film 1 ve Film 2 PFA sabit E12.5 embriyonik kalp tipik sonuçları göstermektedir. Bu örneklerde, bir LifeAct-RFPruby transgenik embriyo görüntüleme için kullanıldı; LifeAct-RFPruby transgen 19 filamentli aktin etiketler ama PFC tespit gerektirir. S-α-aktinin ile etiketlenmiş Z diskler çok alanda görselleştirmek için kolay, ancak bir sinyal-gürültü oranı Decré oldu<html> şekild dondurulmuş kalp bölümleri (Şekil 7A) göre ased; bu sinyal epitopların protein çapraz-bağlantılar tarafından maskelenebilir olan PFA sabit doku, s-α-aktinin imüno tipik. Şekil 7B, filamentli aktin&#39;in eş canlandırılmasını göstermektedir miyofibril (ok uçları) içinde S-α-aktinin imüno trabeküler miyositlerde (oklar) bitişik endokardiyal hücreleri içinde ve ipliksi aktin. Üç boyutlu görüntü oluşturma ek ayrıntıları ortaya çıkarmıştır: tek tek kardiyomiyositlerde daha kolay kardiyomiyosit içinde Miyofibril kabaca birbirine paralel edildi ayırt edilmiştir, ancak tek tek kardiyomiyositlerde birbirinden (Şekil 7C ve D, film 1 ve Film 2 arasında değişen açılarda yönlendirilmiş ). endokardiyal hücreler ve kardiyomiyositlere arasındaki yakın yaklaşım iyi de üç boyutlu görünümler takdir edilmiştir. <html> &quot;&gt; <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> M serisi aktin filamentler üst üste miyozin lifleri, çapa yaparken Şekil 1. kardiyomiyosit sarkomer, interkalasyonlu diskler ve costameres. Z-disk, aktin filamentleri çapa. M serisi - - Z-disk ünitesi sarkomer bir Z-disk içerir. Seri olarak birden fazla sarkomer bir myofibril oluşturur. myofibril lateral ucu interkalasyonlu disk denilen özel bir hücre-hücre kavşak yapısına kardiyomiyosit enine sınırında içine ekler. Periferik kaslarında myofibriller kardiyomiyositlere arasındaki ekstraselüler matriks ile fokal yapışıklıklar oluşturan costameres aracılığıyla boyuna kardiyomiyosit plazma zarına bağlanır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> pload / 52.644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. s-α -actinin ve embriyonik gün 16.5 β katenin immünofloresan. Kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve s-α-aktinin karşı (A), fare monoklonal klon EA53 antikoru kullanılarak immünohistokimyasal olarak boyanmış, burada etiketli kardiyomiyosit Z-disk ve birleştirilmiş diskler ve katenin β adherens birleşme proteinine karşı (B) tavşan polycloncal antikor. (C) Birleştirilmiş görüntüleri s-α-aktinin ve β katenin boyama gösterir. (D) Büyütülmüş paneli C ilgi alanı ; yıldızlarla işareti s-α-aktinin ve β katenin eş-lokalizasyonu ile birleştirilmiş diskleri tahmin. Görüntüler panelleri AC sol üst epikardiyal tabaka ile, periferik sol ventrikül duvar veya kompakt myokardda elde edilmiştir. O dışarı Yoğunluk histogram görüntü aralığı 460-1600 (f mümkün 0-65.535) hem s-α-aktinin / 488 nm ve β katenin / 561 nm lazer kanallar için. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Şekil 3. s-α -actinin ve embriyonik gün 16.5 1 integrin immünofloresan β. Kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve s-α-aktinin karşı (A), fare monoklonal antikoru EA53 klonu kullanılarak immunosteyn ve integrin β1 fokal yapışma proteinine karşı (B), keçi poliklonal antikor. (C) birleştirilmiş ve görüntüler kardiyomiyosit olarak β1 integrini ve non-kardiyomiyosit hücreleri göstermektedir. Not hem yaygın vekardiyomiyositler integrin β1 sinyali noktalı (D) Z-diskler s-α-aktinin-boyama yakındaki benzer dönemsellik panel C. Not punktat, periyodik β1 integrin boyama (oklar) ilgi alanı Büyütülmüş.; Bu yapıların costameres temsil edebilir. Çıkan sol ventrikül kompakt miyokard elde edilmiştir. Β1 integrin / 561 nm lazer kanal için s-α-aktinin / 488 nm lazer kanal ve 460-600 için (mümkünse 0-65.535 dışarı) Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 460-1200. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Şekil 4. s- α -actinin ve embriyonik gün 12.5 at tropomiyozin immünoflüoresans: myofibril organizasyonunda<html> trabeküler ve kompakt miyokard. yavru embriyolardan Kalpler eksize edildi, dondurulmuş, cryosectioned, aseton ile fikse edilmiş ve myofibril ince filaman karşı s-α-aktinin ve (B) fare monoklonal antikora karşı (A), fare monoklonal klon EA53 antikoru kullanılarak immunosteyn oturmaktadır Protein tropomiyozin (Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası CH1). Trabeküler (oklar) ve kompakt miyokard (ok başları) gösterilir. Sıkı tabakanın (A) puncta aynı zamanda lineer boyama dahil boyanma bir dizi kıyasla trabeküler miyokardiyumda normal periyodik doğrusal s-α-aktinin boyama, dikkat edin. Ayrıca kompakt miyokardiyumda trabeküler miyokardiyumda düzenli dönemsellik ama daha yaygın boyama ile doğrusal tropomiyozin boyama unutmayın. Tropomiyozin kanalı için s-α-aktinin kanalı ve 460-1,000 için (mümkünse 0-65.535 dışarı) Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 460-1,400. Ölçek çubuğu 10 mikron.&quot;Https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Şekil 5. s-α -actinin ve embriyonik gün 12.5 N-kadherin immünofloresan:. Trabeküler kardiyomiyositlerde Miyofibril ve araya diskler kalp çıkarıldı, ek dondurulmuş, cryosectioned, (A), fare monoklonal klon EA53 Aseton kullanılarak sabitlenmiş, ve immunosteyn s-α-aktinin ve fokal yapışma proteini, N-kaderin karşı (B), tavşan poliklonal antikora karşı antikor. 0.2 mikron optik dilim az yığını olarak toplandı ve z yığınları görüntüler oluşturmak için düzleştirilmiş edildi. (C) Birleştirilmiş basık yığınları trabeküler kardiyomiyositlere içinde N-kaderin ve s-α-aktinin boyama hem göstermek well Panel C ilgi Hoechst boyası ile etiketlenmiş çekirdekleri (D) Büyütülmüş alanı olarak.; yıldız s-α-aktinin ve N-kaderin ortak lokalizasyonu ile birleştirilmiş diskleri işaretleyin. S-α-aktinin / 488 nm ve N-kaderin / 561 nm lazer kanalları hem Hoechst / 405 nm lazer kanal için (mümkünse 0-65.535 dışarı) ve 470-2,000 Yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 470-1,200. Ölçek çubuğu 10 mikron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Şekil 6. Anti-fare IgG (H + L), tek değerli Fab parçası etkili bir şekilde bloke endojen fare anti-fare ikincil antikorlar ile bağlanma IgG. Embriyonik kalp çıkarıldı E12.5, ek aseton sabitlenmiş, cryosectioned ve immunosteyn, donduruldu. <strong&gt; (AC) Bölümler, N-kaderin karşı s-α-aktinin ve tavşan poliklonal primer antikora karşı fare monoklonal klonu EA53 birincil antikor maruz, anti-fare IgG, tek değerli Fab fragmanı ve ardından 1 x bloke edici tampon ile bloke yıkandı ve maruz bırakıldı Alexa Fluor 488 anti-fare ve Alexa Fluor 586 anti-tavşan ikincil antikorlar. yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2500 kullanarak (A) Birleştirilmiş görüntünün (mümkünse 0-65.535 dışarı). Yıldızlarla notu bölgeler olan N-kaderin sinyali. Olasılıkla doğmakta interkalate diskleri temsil trabeküler kardiyomiyositlerinin, enine sonuna sınırlı (B) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal edilir. (C) s-α -actinin sadece yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (DG) Bölümler tavşan poliklonal maruz, 1x engelleme tampon sadece (hiçbir anti-fare IgG tek değerlikli Fab fragmanı engelleme adımı) ile bloke edildiN-kadherin, sadece (herhangi bir fare monoklonal birincil antikor) yıkandı ve Alexa Fluor 488, anti-fare ve Alexa Fluor 586 anti-tavşan sekonder antikor maruz bırakılmıştır. (D) karşı birincil antikor yoğunluğu histogram ekranı aralığı 480-2500 kullanarak görüntü birleştirilmiştir. (E) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2500 kullanarak kanal. (F) s-α-aktinin sadece yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (G) s-α-aktinin-tek kanal kullanarak anti-fare IgG, tek değerli Fab parçası bloke aşamasının bulunmadığı ortamda, endojen fare IgG arka algılama ortaya yüksek hassasiyetli yoğunluk histogramı gösterge aralığı 480-530. (HK) Bölümler anti-fare IgG&#39;si ve ardından 1 x bloke edici tamponu ile bloke edilmiştir tek değerli Fab parçası, N-kadherin (herhangi bir fare monoklonal birincil antikor) yıkandı karşı tavşan poliklonal birincil antikora maruz bırakılır ve Alexa Fluor 488, anti-fare ve A maruzlexa Fluor 586 anti-tavşan ikincil antikorlar. (H) yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak görüntü birleşti. (I) N-kaderin-tek yoğunluk histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak kanal. (J) s-α-actinin- sadece kanal yoğunluğu histogram görüntüleme aralığı 480-2,500 kullanarak. (K) s-α-aktinin sadece arka plan endojen fare IgG tespiti eksikliği gösterir, yüksek hassasiyet yoğunluğu histogram görüntüleme aralığı 480-530 kullanarak kanal zaman anti-fare IgG tek değerlikli Fab fragmanı engelleme adımı kullanılır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Şekil 7. s- α -actinin ve trabeküler Cardi aktin organizasyonus-α-aktinin karşı fare monoklonal klon EA53 antikor Z diskler ve birleştirilmiş diskler etiketlemek için kullanıldı olurken embriyonik gün 12,5 omyocytes. LifeAct-RFPruby transjenik fare soyu, lifli aktin 19 görselleştirmek için kullanılmıştır. Embriyolar PFA-tespit edildi. 0.2 um optik dilim az yığın olarak toplanmıştır (A) Düz z yığın s-α-aktinin boyama hızlı bir şekilde dondurulup aseton sabit bölümleri (Şekil 2-5) göre PFA sabit dokuda daha yaygın olduğunu gösteriyor.. (B ) Düz z yığın ipliksi aktin ve hem s-α-aktinin gösterir. Kaslarında myofibriller (ok uçları) içinde Z-diskler arasında lokalize İpliksi aktin floresan. İpliksi aktin floresan da trabeküler miyositleri (oklar) hat endokardiyal hücreler görüldü. (C) yığının üst bakıldığında trabeküler kardiyomiyositlerinin Üç boyutlu görünümü. (D) Üç boyutlu görünümtrabeküler kardiyomiyositler olarak yığının altından inceledi. Yoğunluk Histogram görüntüleme aralığı 470-900 (mümkün 0-65.535 dışarı) 488 nm lazer kanal ve A ve B 561 nm lazer kanal için hem; C ve D Ölçek bar 10 mikron her iki kanal için görüntü aralığı 460-800. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Film</a> 1. S- α -actinin ve embriyonik günde 12.5 ile trabeküler kardiyomiyositlerde aktin örgütünün 360 ° dönme 3D görünümü. Şekil 6 görüntü yığını Fiji görüntü analiz programı dahilinde Resim J 3D Görüntüleyici eklentisi kullanarak üç boyutlu hale getirildi. Yoğunluk Histogram görüntüleme aralığı 470-800 (mümkün 0-65.535 dışarı) 488 nm ve 561 nm lazer kanalları hem. &lt;/ P&gt; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Film</a> 2. Embriyonik günde 12.5 ile trabeküler kardiyomiyositlerde s- α -actinin ve aktin örgütü Seçilmiş 3D görünümleri. Şekil 6 görüntü yığını Fiji görüntü analiz programı dahilinde Resim J 3D Görüntüleyici eklentisi kullanarak üç boyutlu hale getirildi. X, y ve z eksenleri etrafında küçük rotasyonlar nispeten kardiyomiyositlere ama çoğu kardiyomiyositlere arasındaki zayıf uyum içinde Miyofibril hizalanmış gösterdi. Küçük rotasyonlar da kardiyomiyositlere etrafında s-α-aktinin eksik endokardiyal hücrelerinin yakın yaklaşım gösterdi. Yoğunluk Histogram ekran aralığı 470-800 488 nm ve 561 nm lazer kanalları hem (mümkün 0-65.535 dışarı).

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.2K Görüntüleme.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Video: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Görüntüleme Tek hücreli Çözünürlük embriyonik ve Postnatal Kalpleri Temizlendi

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Temizlendi Embriyonik Kalpler Koroner Damarlar Analizi

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...