The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato UCSF istituzionale. 1. Crioconservazione e fissazione delle embrionali Cuori mouse. 1.1) Snap-congelamento cuori embrionali <ol><li> Riempire un 3,5 centimetri petri piatto e 7 mm cryomolds con Optimal taglio temperatura (OCT) medio (vedi Materiali tabella). In una cappa chimica, raffreddare 2-metilbutano in azoto liquido. </li><li> Dispensare 30 ml di tampone fosfato salino (PBS) in 10 centimetri di Petri piatti, 10 ml di PBS in 3,5 centimetri di Petri piatti, e mettere tutti i piatti di Petri sul ghiaccio. Preparare un piatto 10 centimetri e diversi 3,5 centimetri piatti per il mouse incinta. </li><li> Isolare embrioni come precedentemente descritto 15, eseguendo la dissezione in PBS freddo. </li><li> In breve, eutanasia la femmina incinta con CO 2 narcosi e dislocazione cervicale. <ol><li> Fare un&#39;incisione nell&#39;addome, sezionare l&#39;utero tagliando i vasi along la curvatura interna dell&#39;utero, e trasferire l&#39;utero di una capsula di Petri 10 centimetri contenente PBS ghiacciato. </li><li> Tagliare l&#39;utero tra ogni embrione e il trasferimento ad un individuo 3,5 centimetri piastra di Petri contenente ghiacciata PBS. Isolare ogni embrione come descritto 15. </li><li> Aprire la cavità pericardica utilizzando una pinza sottile, rimuovere il cuore lontano da polmoni e vasi tagliando alla aorta, vena cava inferiore, e vene polmonari, e trasferire in cm Petri 3,5 contenente ottobre </li><li> Lasciate che il cuore equilibrare in OCT per alcuni secondi, quindi trasferire il cuore nello stampo di 7 mm avente ottobre Orientare la parete anteriore del cuore al fondo dello stampo. </li></ol></li><li> Inserire delicatamente lo stampo in azoto liquido raffreddato 2-metilbutano. Fare attenzione a non permettere a 2 metilbutano liquido per toccare il cuore di Office o. Congelare fino al ottobre è solido bianco, poi il trasferimento lo stampo di un secchio di ghiaccio contenente ghiaccio secco. Passare al successivo dell&#39;embrione. </li><li> Wrap cryomolds in un foglio e conservare a -80 ° C fino al momento criosezionamento. </li></ol> 1.2) Alternativa: Paraformaldeide (PFA) che fissa, cryoprotecting, e ottobre incorporamento cuori embrionali <ol><li> Riempire i pozzetti di una piastra di coltura tissutale 12-bene con 4% PFA in 1x PBS. </li><li> Sezionare i cuori embrionali, come descritto in 1.1.3. Posizionare ogni cuore in un pozzo contenente 4% PFA e fissare a 4 ° CO / N. </li><li> Crioprotezione: con una pipetta di plastica trasferimento, spostare ogni cuore ad una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 1,5 ml di 15% di saccarosio in PBS e agitare delicatamente a 4 ° C fino al cuore scende sul fondo del tubo (diverse ore a O / N ). Trasferire ogni cuore ad un 1,5 ml provetta contenente 1,5 ml di 30% di saccarosio in PBS e agitare delicatamente a 4 ° C fino a che il cuore scende sul fondo del tubo (diverse ore per O / N). </li><li> Usando una pipetta di trasferimento in plastica, posizionare cuore crioprotetti in OCT e lasciarlo equilibrareper alcuni minuti per eliminare l&#39;eccesso di saccarosio, quindi trasferire il cuore nello stampo di 7 mm avente ottobre Orientare la parete anteriore del cuore al fondo dello stampo. </li><li> Fermo cuore in OCT ponendo lo stampo sia raffreddato con azoto 2-metilbutano liquido o ghiaccio secco. </li><li> Avvolgere cryomolds in fogli e conservare a -80 ° C fino al momento criosezionamento. </li></ol> 2. criosezionamento <ol><li> Impostare la temperatura criostato a -17 ° C. </li><li> Posizionare cryomolds nella camera criostato e raggiunga la temperatura per 15-20 minuti. </li><li> Invertire la cryomold e utilizzare una leggera pressione per espellere il blocco cardiaco dallo stampo. Orientare la parete anteriore del cuore per la parte superiore del blocco di tessuto stampato. </li><li> Mettere una grossa goccia di ottobre sul mandrino, e montare il blocco cardiaco sul calo ottobre a congelare sul mandrino. Mantenere l&#39;orientamento tale che la parete anteriore del cuore è lontano dal mandrino. </li><li> Caricare il mandrino e montato luiarte blocco sul portaoggetti criostato. Regolare in modo che l&#39;angolo della lama è 3-5 ° rispetto al campione. </li><li> Colleziona 10 micron sezioni su vetrini da microscopio che sono stati pre-trattati con un rivestimento carica positiva (vedi Materiali tabella). Lasciare asciugare completamente prima di riporlo a -80 ° C. </li></ol> 3. immunofluorescenza <ol><li> Per le sezioni snap-congelate, correggere e permeabilize tessuti in acetone per 10 minuti in una cappa aspirante a RT. </li><li> Per le sezioni snap-congelate e PFA-fisse, incubare in PBS-0.1% Triton X-100 per 20 minuti per rimuovere Office e di permeabilize sezioni PFA-fisse. </li><li> Block per 45 min in 1x tampone bloccante, diluito in PBS. </li><li> Se si utilizza un anticorpo primario generato nel topo, incubare in asino o di capra anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab diluito 1: 100 in PBS-0.1% Tween 20 per 45 minuti a temperatura ambiente (vedi Discussione). </li><li> Incubare in anticorpo primario o anticorpi diluito in 1x tampone bloccante per 2 ore a temperatura ambiente oO / N a 4 ° C (vedi tabella dei materiali / Attrezzature per diluizioni specifici). </li><li> Lavare le sezioni in PBS 1x tre volte per 10 minuti a RT. </li><li> Incubare in Alexa Fluor-coniugato anticorpo secondario diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio per 2 ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare le sezioni in 1x PBS tre volte per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. </li><li> Optional: incubare in Hoechst colorante diluito 1: 2.000 in PBS a RT (protetto dalla luce) a etichettare nuclei, poi risciacquare con PBS. </li><li> Post-fix etichettato sezioni in 1% PFA per 1 min a RT. </li><li> Mount scorre in mezzo anti-fade (con DAPI se nuclei non sono già etichettati) posizionando due gocce di supporto su ogni estremità della slitta e quindi coprire con un vetrino coprioggetto. Seal coprioggetto con smalto. Conservare protetto dalla luce a 4 ° C fino al momento di immagine. </li></ol> 4. confocale Imaging and Image Analysis <ol><li> Attivare le lunghezze d&#39;onda appropriate laser, macchina fotografica, e confocale microscopio incLuding fase mover e z motore. Avviare il programma software di imaging. Utilizzare i 405, 488, e 561 lunghezze d&#39;onda laser per l&#39;imaging Hoechst-, Alexa 488-, e Alexa sezioni 568-colorate, rispettivamente. NOTA: Vedi Tabella Materiali per le nostre specifiche hardware e software. </li><li> Montare il vetrino di controllo (coprivetrino premuto per un microscopio invertito) sul palco diapositiva. </li><li> Usando l&#39;obiettivo 4X (vedi Materiali Tavolo), trovare il campione e area di interesse. Cattura l&#39;immagine da utilizzare come mappa quando l&#39;imaging ad alto ingrandimento. </li><li> Rimuovere il vetrino, le regolazioni minime per la fase di presentazione. Passare l&#39;obiettivo ad immersione 60x olio (vedi Materiali Tavolo), posizionare una piccola goccia di olio sull&#39;obiettivo, e sostituire la slitta (coprivetrino giù) sul palco diapositiva. </li><li> Trova di nuovo campione. Impostare la potenza del laser, tempo di esposizione, e binning ai livelli desiderati per ciascun canale. NOTA: Usiamo generalmente potenza del laser di 0.8, tempo di esposizione della fotocamera di 100 msec, e binning di 2 (see Materiali Tavolo per le specifiche hardware e software); impostazioni ottimali devono essere determinati empiricamente per ogni esperimento. <ol><li> Una volta che le impostazioni ottimali sono determinate, utilizzare le stesse impostazioni per tutte le sezioni di tessuto all&#39;interno dell&#39;esperimento. Utilizzare l&#39;istogramma intensità notare la gamma ottimale intensità per ciascun canale (queste informazioni verranno utilizzate per l&#39;analisi). </li></ol></li><li> Generare pila az utilizzando la funzione di acquisizione: selezionare i canali laser appropriate, quindi scegliere i limiti superiore e inferiore della pila z. Seleziona taglia az passo stack che è la metà del valore dello spessore fetta ottica fornita dal software. Fare clic su &quot;Esegui&quot; per raccogliere le immagini. </li><li> Utilizzare Fiji 16 o un programma analogo per l&#39;analisi delle immagini. All&#39;interno di Fiji, aprire il file di stack z con l&#39;opzione modalità colore personalizzata e i canali suddivisi in finestre separate. Aprire la &quot;Regolazione Luminosità / Contrasto&quot; strumento dal menù a tendina immagine; all&#39;interno di ciascun canale, set il range ottimale di intensità istogramma determinato in 4.5.1. Applicare questi intervalli di canale per tutti gli stack z analizzato. </li><li> Unire i singoli canali in un&#39;unica immagine composita utilizzando Immagine-&gt; menu a discesa Colore. </li><li> Creare uno stack z appiattito dalla immagine composita con il Image-&gt; Stacks-&gt; menu project z. L&#39;immagine sarà significativamente più luminosa l&#39;immagine 3D di; regolare la gamma di intensità istogramma per il campione di controllo per evitare sovrasaturazione, e applicare le stesse impostazioni per la sperimentazione appiattito z stack. </li><li> Per generare una immagine 3D, prima di utilizzare il Image-&gt; Stacks-&gt; Menu progetto 3D 17. Scegliere l&#39;asse x o y-asse di rotazione. Impostare la spaziatura fetta come lo stesso numero di micron come dimensione dello stack z passo. Scegli la rotazione totale desiderata e impostare l&#39;incremento di angolo di rotazione a 1. Aprire quindi l&#39;immagine J 3D Viewer dal Plugin menu a tendina. Scegli l&#39;immagine composita generata in 4.8, display come Volume, e impostare il Recampionamento fattore da 1 o 2. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La tecnica di fissaggio del tessuto ottimale e diluizione devono essere determinati empiricamente per ciascun anticorpo. Nelle nostre mani, snap-congelamento è superiore alla fissazione PFA per diversi antigeni cardiomiociti, tra cui s-α-actinina, β-catenina, β1-integrina, tropomiosina, Talin (non mostrato) e N-caderina; in contrasto, fissazione PFA fornisce risultati superiori per focale chinasi aderenza (non mostrato). I legami crociati proteine ​​formate da PFA possono mascherare epitopi e limite vincolante di anticorpi; recupero di un antigene può essere richiesto in questi casi, e metodi per il recupero antigene può essere trovata altrove 20. Concentrazione PFA o la lunghezza del fissaggio possono essere diminuiti per ridurre epitopo mascheramento, con condizioni ottimali empiricamente determinati per ogni anticorpo e in ogni fase dello sviluppo. Appropriati controlli negativi dovrebbero essere utilizzati nella caratterizzazione di un nuovo anticorpo o mutante cardiaca, compreso il siero pre-immune come controllo anticorpo primario e un co &quot;no anticorpo primario&quot;ntrol. L&#39;uso di topi knockout è un controllo negativo ideale ma mortalità precoce impedisce l&#39;uso per molti dei prodotti genici studiati qui. L&#39;uso di volumi adeguati per sommergere completamente i vetrini sperimentali e di controllo nello stesso blocco immunofluorescenza, anticorpi, e le soluzioni di lavaggio è stato importante come era dolce dondolio delle diapositive durante l&#39;incubazione per garantire l&#39;esposizione uniforme delle sezioni alle soluzioni. Questo approccio minimizzato la variabilità tecnica in colorazione tra le sezioni e diapositive all&#39;interno di un esperimento. Quando il costo limita il volume della soluzione di anticorpi, utilizzare una penna Pap per limitare il flusso di soluzioni al di là delle sezioni di tessuto e di mantenere i vetrini in una camera umidificata durante lunghi incubazione. Se un monoclonale principale del mouse anticorpi - e quindi un anticorpo secondario anti-topo - è in uso, una seconda fase di blocco per coprire immunoglobuline endogene del mouse sarà necessario (punto 3.4) per ridurre non specifico segnale di fondo. Appropriate tecniche di microscopia e di elaborazione delle immagini sono fondamentali per ottenere informazioni accurate biologicamente 21. L&#39;istogramma intensità indica la distribuzione dei pixel per ogni livello di intensità (0-65.535 livelli per immagini a 16-bit) per ogni colore. Sfondo, la luminosità e il contrasto può essere regolato impostando una gamma di visualizzazione di intensità che costeggia il picco istogramma; per rendere validi confronti tra le condizioni, devono essere utilizzate le stesse impostazioni tra controllo e alle condizioni sperimentali. Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per analizzare la maturazione dei cardiomiociti e sviluppo nel nativo cuore embrionale del mouse. Mentre immunofluorescenza di proteine ​​specifiche per cardiomiociti è spesso usato per marcare cardiomiociti durante lo sviluppo, pochi studi impiegano tecniche che consentono l&#39;analisi ad alta risoluzione della struttura myofibril e l&#39;emergere di dischi intercalari e costameres 12-14,22,23. Questa tecnica può essere utilizzata per in vla valutazione ivo di mutazioni che causano difetti cardiaci di sviluppo, come mezzo per identificare cambiamenti di cardiomiociti di maturazione che possono far luce sui meccanismi di anomalie strutturali.

Durante lo sviluppo, le contrazioni del cuore iniziano subito dopo cardiomiociti migrano alla linea mediana e formano il tubo cuore 1,2 lineare. Il sarcomero è l&#39;unità contrattile base ai cardiomiociti; tale struttura citoscheletrica altamente organizzata contiene filamenti di actina ancorate al Z-disco sarcomerica α-actinina (s-α-actinina) e fibre miosina ancorate alla linea M (Figura 1). Come il cardiomiociti matura, sarcomeri assemblare in serie per formare miofibrille che si estendono attraverso la cella. Miofibrille sono ancorate alle estremità della cardiomiociti dal disco intercalato, la struttura giunzionale cellula-cellula che contiene una giunzione di transizione con un sottoinsieme di elementi Z-disco come s-α-actinina 3, adherens proteine ​​di giunzione come N-caderina e β catenina, proteine ​​gap di giunzione, e desmosomi (Figura 1) 4. Lungo la membrana longitudinale, gli Z-dischi di miofibrille periferici anchecollegare alla membrana cellulare via costameres; queste adesioni focali specializzati forniscono un ancoraggio tra miofibrilla, membrana plasmatica, e matrice extracellulare per fornire ulteriore supporto strutturale al cardiomiociti (Figura 1) 4. All&#39;inizio dello sviluppo del cuore, cardiomiociti sono disposti in proiezioni simili a dita noti come trabecole che sporgono nello spazio ventricolare e contengono miofibrille relativamente maturi 5. Come procede lo sviluppo del cuore, i cardiomiociti nella regione sub-epicardica proliferano a formare il miocardio compatto che comprende le pareti ventricolari, ma sarcomero e montaggio myofibril sono in ritardo rispetto al miocardio trabecolare 5,6. Modelli di sarcomero e montaggio myofibril provengono in gran parte da studi di immunofluorescenza su cardiomiociti in coltura 7-10, che sono semplici, ma non dispongono di un ambiente tridimensionale, il flusso di sangue, e contatti con altre cellule cardiaches presenti in vivo. studi strutturali ad alta risoluzione con immunofluorescenza nel cuore embrionale del mouse sono tecnicamente impegnativo, e pochi studi hanno esplorato l&#39;emergere di dischi intercalari e costameres durante topo sviluppo cardiaco. La proteina adherens giunzione β catenina sembra localizzare a dischi intercalari di giorno embrionale (E) 17,5 11, N-caderina localizza a strutture lineari che possono rappresentare dischi intercalari di E18.5 12 contro postnatale giorno 0 13, e costameres siano state accertate su E18.5 14, ma queste proteine ​​di membrana visualizzare la distribuzione diffusa e più continuo in precedenti momenti di sviluppo 11-13. Qui, descriviamo un metodo semplice e riproducibile per immunostaining e microscopia a fluorescenza di topo sezionata cuori embrionali che permette l&#39;analisi dettagliata di myofibril e dello sviluppo dei cardiomiociti, tra cui l&#39;emergere di intercalated Dischi già nel E12.5 e costameres nascenti a E16.5. Questo protocollo può essere utile per sondare gli effetti delle mutazioni sulla formazione sarcomere nonché myofibril e cardiomiociti maturazione.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>This size not available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>&quot;Plus&quot; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western Blocking Agent</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td></tr><tr><td>Anti-s-&amp;#945;-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;catenin antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9587s</td><td>Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;1 integrin antibody</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF2405</td><td>Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-tropomyosin antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>CH1</td><td>Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-talin antibody</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 dye</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td><td>Keysight (formerly Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X air objective</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td><td>Nikon&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

Durante lo sviluppo del cuore, la generazione di unità strutturali e funzionali specifici del miocardio tra cui sarcomeri, miofibrille contrattili, dischi intercalari, e costameres richiede il montaggio coordinato di più componenti in tempo e nello spazio. Turbativa in assemblaggio di questi componenti comporta difetti cardiaci sviluppo. Tecniche di colorazione immunofluorescenza sono usati comunemente in cardiomiociti in coltura per sondare la maturazione myofibril, ma questo approccio ex vivo è limitata dalla misura in cui saranno completamente miociti differenziare in coltura, mancanza di normali ingressi meccanici in vivo, e l&#39;assenza di segnali endocardici. Applicazione di tecniche di immunofluorescenza allo studio di sviluppare cardiaca mouse è desiderabile, ma tecnicamente più impegnativo, e metodi spesso non sensibilità e risoluzione sufficiente per visualizzare sarcomeres nei primi stadi di sviluppo del cuore. Qui, si descrive un metodo affidabile e riproducibile di co-mu immunostainproteine ​​ltiple o di co-visualizzare una proteina fluorescente con immunofluorescenza nel cuore embrionale del mouse e utilizzare questo metodo per analizzare miofibrille in via di sviluppo, dischi intercalari, e costameres. Questo metodo può essere ulteriormente applicato per valutare cardiomiociti cambiamenti strutturali causate da mutazioni che portano a difetti cardiaci sviluppo.

Le figure da 2 a 6 mostrano risultati tipici per co-colorazione delle proteine ​​differenti in un cuore snap-congelato e acetone-fisso. L&#39;anticorpo contro s-α-actinina riproducibile etichettati Z-dischi e dischi intercalati con alta specificità e sfondo minima (figure 2A, 3A, 4A, 5A, 6A e 6C); figura 6 dimostra che l&#39;anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente IgG topo endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo. L&#39;anticorpo contro la proteina adherens giunzione β catenina legata alla membrana sia cardiomiociti e cellule non-cardiomiociti, e co-localizzazione con s-α-actinina è verificato in dischi intercalari presunti a E16.5 (Figura 2C e D), come previsto dalla β modello catenina colorazione nel cuore adulto 18. β1 integrina immunofluorescenza nel cuore embrionale è particolarmente impegnativo e spesso non riesce a individuare adesioni focali di 14, ma il segnale β1 colorazione integrina in questi studi ha rivelato con la stessa periodicità Z-dischi-s-α-actinina marcato, forse riflettendo costameres nascenti formando a E16.5 (Figura 3D). A E12.5, s-α-actinina e tropomiosina (sarcomere proteine ​​sottile filamento) immunofluorescenza ha rivelato un pattern di colorazione con periodicità regolare in cardiomiociti trabecolare coerenti con miofibrille maturi in queste cellule (Figure 4A e 5A per s-α-actinina; Figura 4B per tropomyosin). N-caderina colorazione in cardiomiociti trabecolare a cuori E12.5 tendeva colocalizza con le aree di intensa s-α-actinina colorazione (Figura 5B - D e Figure 6A - C) che forse rappresenta dischi intercalari. Incontrasto al miociti trabecolare, s-α-actinina nella zona compatta era più puntata che lineare, e tropomiosina colorazione era diffusa piuttosto che lineare (Figura 4A e 4B). Così, il montaggio sarcomere può verificarsi più tardi nel compatto rispetto al miocardio trabecolare. Inoltre, i modelli differenziali di s-α-actinina e tropomiosina nella zona compatta suggeriscono che s-α-actinina organizza in puncta e immaturi Z-dischi primi, mentre tropomiosina incorporazione nella sottile filamento può essere un evento più tardi in assemblea myofibril. Figura 7, Film 1, e Movie 2 dimostrano risultati tipici di un cuore embrionale PFA-fisso E12.5. In questi esempi, un embrione transgenico LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per l&#39;imaging; il transgene LifeAct-RFPruby 19 etichette actina filamentosa ma richiede la fissazione PFA. Z-dischi etichettati con s-α-actinina erano facili da visualizzare in molte aree, ma il rapporto segnale-rumore era decre<html> ASED rispetto a scatto congelati sezioni di cuore (Figura 7A); questo segnale era tipico per s-α-actinina immunofluorescenza nel tessuto PFA-fisso, in cui epitopi possono essere mascherati da proteine ​​cross-link. Figura 7B mostra co-visualizzazione di actina filamentosa e immunolabeled s-α-actinina all&#39;interno miofibrille (punte di freccia) e actina filamentosa all&#39;interno delle cellule endocardico adiacenti miociti trabecolare (frecce). Tridimensionale di ricostruzione delle immagini ha rivelato ulteriori dettagli: singoli cardiomiociti sono stati più facilmente discernere, miofibrille all&#39;interno di un cardiomiociti sono stati all&#39;incirca parallele l&#39;una all&#39;altra, ma i singoli cardiomiociti sono state orientate ad angoli diversi tra loro (Figura 7C e D, Film 1, e Movie 2 ). La stretta approssimazione tra le cellule endocardico e cardiomiociti era meglio apprezzata nelle viste tridimensionali pure. <html> &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> Figura 1. sarcomeri cardiomiociti, dischi intercalari, e costameres. La Z-disco ancore filamenti di actina, mentre la linea M ancore fibre miosina, che si sovrappongono i filamenti di actina. Il sarcomero è composto da una Z-disco - linea M - unità Z-disco. Più sarcomeri in serie creano miofibrilla. L&#39;estremità laterale della miofibrilla inserisce nel bordo trasversale della cardiomiociti ad una struttura giunzionale cellula-cellula specializzata chiamato il disco intercalato. Miofibrille periferici collegano alla membrana plasmatica cardiomiociti longitudinale via costameres, che formano adesioni focali con la matrice extracellulare tra cardiomiociti. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> PLOAD / 52.644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. s- α -actinin e β catenina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina, che immagini cardiomiociti etichettato Z-dischi e dischi intercalari, e (B) coniglio anticorpi contro la proteina polycloncal adherens bivio β catenina. (C) Fusa mostrano s-α-actinina e β catenina colorazione. (D) ingrandita area di interesse dal pannello C ; mark asterischi presume dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e β catenina. Le immagini sono state ottenute dalla parete ventricolare sinistra periferico o miocardio compatta, con lo strato epicardico in alto a sinistra di pannelli AC. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1600 (fuori of possibile 0-65535) per entrambi i nm e β catenina / 561 canali laser nm s-α-actinina / 488. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> Figura 3. s- α -actinin e β 1 integrina immunofluorescenza al giorno embrionale 16.5. Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e immagini (B) di capra policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale β1 integrina. (C) Fusa mostrano integrina β1 in cardiomiociti e cellule non cardiomiociti. Nota sia diffusa epuntata β1 segnale integrina in cardiomiociti (D) area di interesse dal pannello C. nota puntata, β1 periodica integrina colorazione (frecce) con cadenza simile alla vicina s-α-actinina-colorazione in Z-dischi ingrandita.; queste strutture possono rappresentare costameres. Le immagini sono state ottenute dalla sinistra ventricolare miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1200 (fuori possibili 0-65535) per il / 488 canali laser nm s-α-actinina e 460-600 per il canale laser nm β1 integrina / 561. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> Figura 4. s- α -actinin e tropomyosin immunofluorescenza al giorno 12.5 embrionale: organizzazione myofibril in<html> trabecolare e compatta miocardio. Cuori di embrioni littermate venivano asportate, a scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) del mouse anticorpo monoclonale contro il filamento sottile miofibrilla proteine ​​tropomiosina (Developmental Studies Ibridoma Bank CH1). Trabecolare (frecce) e miocardio compatto (punte di freccia) sono indicati. Nota s-α-actinina colorazione lineare con regolare periodicità nel miocardio trabecolare, rispetto ad una gamma di pattern di colorazione compreso puncta nonché colorazione lineare nello strato compatto (A). Nota anche la colorazione tropomyosin lineare con periodicità regolare nel miocardio trabecolare ma colorazione più diffusa nel miocardio compatto. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 460-1,400 (di possibili 0-65535) per il canale s-α-actinina e 460-1,000 per il canale tropomyosin. Scale bar 10 micron.Target &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> Figura 5. s- α -actinin e N-caderina immunofluorescenza al giorno embrionale 12.5:. Miofibrille e dischi intercalari in cardiomiociti trabecolare Il cuore è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained con (A) monoclonale murino clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina e (B) di coniglio policlonale anticorpi contro la proteina di adesione focale N-caderina. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az, yez pile erano appiattite per generare le immagini. (C) unite pile appiattite mostrano sia N-caderina e s-α-actinina colorazione all&#39;interno cardiomiociti trabecolari come well come nuclei marcati con Hoechst dye (D) ingrandite area di interesse dal pannello C.; asterischi segnano dischi intercalari con co-localizzazione di s-α-actinina e N-caderina. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-1,200 (di possibili 0-65535) per il / 405 canali laser nm Hoechst e 470-2,000 sia per il nm s-α-actinina / 488 e N-caderina / 561 canali laser nm. Bar Scala 10 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> Figura 6. Anti-topo IgG (H + L) monovalente frammento Fab blocca efficacemente il mouse endogena vincolante da anticorpi secondari anti-topo IgG. Il E12.5 cuore embrionale è stato asportato, scatto congelato, cryosectioned, acetone-fisso, e immunostained. <sTrong&gt; (AC) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalenti Fab frammento, esposto a monoclonale clone EA53 anticorpo primario contro s-α-actinina e coniglio anticorpo primario policlonale contro N-caderina, lavato, ed esposto Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (A) immagine a video utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500 (fuori possibile 0-65535). Regioni note asterischi in cui N-caderina segnale è limitato alla fine trasversale cardiomiociti trabecolare, che probabilmente rappresenta dischi intercalari nascenti. (B) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (C) s-α -actinin solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (DG) Le sezioni sono state bloccate con 1x tampone di bloccaggio solo (no anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco), esposto a policlonale di coniglioanticorpo primario contro N-caderina solo (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, ed esposti a Alexa Fluor 488 anti-mouse e anticorpi secondari 586 anti-coniglio Alexa Fluor. (D) uniti dell&#39;immagine usando istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2500. canale con (E) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2500. (F) canale tramite istogramma intensità campo di visualizzazione 480-2,500 s-α-sola-actinina. (G) solo s-α-actinina- alta sensibilità istogramma intensità campo di visualizzazione 480-530, che rivela sfondo determinazione di anticorpi IgG endogena del mouse in assenza di anti-topo IgG monovalenti Fab frammento passo di blocco. (HK) Sezioni sono state bloccate con 1x tampone bloccante seguita da anti-topo IgG monovalente frammento Fab, esposto policlonale di coniglio anticorpo primario contro N-caderina (nessun mouse anticorpo primario monoclonale), lavato, e esposta a Alexa Fluor 488 anti-topo e Alexa Fluor anticorpi secondari 586 anti-coniglio. (H) Fusa immagine usando gamma istogramma intensità 480-2,500. (I) N-caderina solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (J) s-α-actinin- solo canale utilizzando istogramma intensità gamma di visualizzazione 480-2,500. (K) s solo-α-actinina-channel con alta sensibilità gamma visualizzazione istogramma di intensità 480-530, che dimostra la mancanza di sfondo endogena rilevamento IgG mouse quando il mouse anti-IgG monovalente frammento Fab passo di blocco viene utilizzato. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> Figura 7. s- α -actinin e organizzazione actina in cardi trabecolareomyocytes al giorno embrionale 12.5. La linea di topi transgenici LifeAct-RFPruby è stato utilizzato per visualizzare actina filamentosa 19, mentre il mouse monoclonale clone EA53 anticorpi contro s-α-actinina è stato usato per etichettare Z-dischi e dischi intercalari. Gli embrioni sono stati PFA-fisse. 0,2 micron fette ottici sono stati raccolti come pila az (A) appiattito z pila mostra che s-α-actinina colorazione era più diffusa nel tessuto PFA-fisse che in snap-congelato e fissate in acetone sezioni (figure 2-5).. (B ) appiattito z pila mostra sia actina filamentosa e s-α-actinina. Filamentosa fluorescenza actina localizzato tra Z-dischi all&#39;interno miofibrille (punte di freccia). Actina filamentosa fluorescenza è stata osservata anche in cellule endocardico che rivestono i miociti trabecolari (frecce). (C) vista tridimensionale dei cardiomiociti trabecolari, come visto dalla cima della pila. (D) vista tridimensionale dicardiomiociti trabecolare, come visto dal fondo della pila. Intensità istogramma campo di visualizzazione 470-900 (su possibili 0-65535) sia per il canale di laser 488 nm e per il canale laser 561 nm in A e B; intervallo di visualizzazione 460-800 per entrambi i canali in C e D. bar Scala 10 micron. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">Movie</a> 1. 360 ° di rotazione 3D di s- α -actinin e organizzazione actina in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell&#39;ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) per entrambi i canali di 488 nm e 561 nm laser. &lt;/ P&gt; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">Movie</a> 2. Viste 3D selezionati di s- α -actinin e actina organizzazione in cardiomiociti trabecolare a giorno embrionale 12.5. La serie di immagini della Figura 6 è stata resa in tre dimensioni utilizzando il plug-J immagine 3D Viewer nell&#39;ambito del programma di analisi delle immagini Fiji. Piccole rotazioni attorno x, y, e Z. mostrato relativamente allineati miofibrille all&#39;interno cardiomiociti ma scarso allineamento tra la maggior parte dei cardiomiociti. Piccole rotazioni anche dimostrato l&#39;approssimazione di cellule endocardico privi s-α-actinina intorno cardiomiociti. Intensità istogramma gamma di visualizzazione 470-800 (di possibili 0-65535) sia per il 488 nm e 561 nm canali laser.

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.1K Views.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Video: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Analisi della camera cardiaca sviluppo durante l'embriogenesi del Mouse utilizzando l'intero Monte epifluorescenza

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

Imaging dal vivo dei primi progenitori cardiaci nell'embrione di topo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biologia

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...