Name: sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology
Uploaded: 2015-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology at JoVE.com

We thank Dr. Mitch Doktycz, Dr. Jennifer Morrel-Falvey, Dr. Amber Bible, and Dr. Brandon Razooky for helpful advice and conversations, and acknowledge Dr. Sukanya Iyer for constructing the Pet3a-EGFP plasmid used in the gene expression tests. We acknowledge support from the Center for Nanophase Materials Sciences, which is sponsored by the Scientific User Facilities Division, Office of Science, U.S. Department of Energy. SEN and PMC acknowledge support from Bredesen Center Fellowships at the University of Tennessee, Knoxville. This research was performed at Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL is managed by UT-Battelle, LLC, for the U.S. Department of Energy.

Cihaz Masters 1. Optik Litografi <ol><li> En az 1 saat ~ 250 ° C&#39;de sıcak plaka temiz silikon gofret kurutmak. NOT: Bu kullanıcı hatası durumunda, master hazırlarken birden fazla gofretin kullanmak iyi bir uygulamadır. </li><li> Fotodirenç alikotları hazırlayın. Kullanarak 1 oranında seyreltici olarak SU-8 tiner: 2015 SU-8 ışığa ve 2 SU-8 2015 fotorezist bir seyreltme hem hacimde hazırlayın. Not: Yaklaşık fotodirenç 1 mi spin kaplama, bir çok ince bisküvi için gereklidir. </li><li> Bu ustalar üretilmesi için üç maskelenmesi hazırlayın. Bir desenlendirme membran kanal ve diğer desenlendirme reaksiyon odaları: Membran Master, iki maske hazırlayın. Kontrol Vanası master, tek bir maske deseni hazırlamak. NOT: Maske desenleme dahil taşbaskı teknikleri hakkında daha fazla bilgi için, cihaz tasarımı daha ayrıntılı bilgi için Ito ve Okazaki, 2000. 36 Bkz Fowlkes ve Collier, 2013 bakınız 37. </li><li> Membran Usta hazırlayın <ol><li> Spin-kat 2: 45 saniye boyunca 1.000 rpm&#39;de gofret 1 SU-8 2015 fotorezist seyreltme. </li><li> 2 dakika boyunca 95 ° C &#39;de yumuşak fırında gofret. Bir kişi hizalama kullanılarak, 10 saniye süre ile membran kanal desenli gofret maruz ve 95 ° C&#39;de 2 dakika boyunca bir maruziyet sonrası fırında gerçekleştirin. </li><li> 1 dakika için SU-8 geliştirici gofret geliştirin, ya fotodirenç kalıntı kaldırılıncaya kadar. Yukarıdan aşağıya doğru hareket, izopropanol ile gofret durulayın. Tekrar yukarıdan aşağıya hareket eden azot ile kuru gofret,. 4 dakika boyunca 180 ° C&#39;de fırında gofret. </li><li> 45 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de 1 SU-8 seyreltme spin-kat 2 ile tekrar gofret desenli. </li><li> Yumuşak fırında 95 ° C&#39;de 2 dakika boyunca gofret desenli. Iletişim hizalama kullanarak, tepkime haznesi desenli desenli gofret uyum ve 10 saniye maruz kalmaktadır. 95 ° C&#39;de 2 dakika süreyle maruz kalma sonrası fırında yapın. </li><li> Aşama 1.4.3 tarif edildiği gibi gofret geliştirir. 4 dakika boyunca 180 ° C &#39;de gofret, fırında gofret geliştirilmesi ve kurutma sonrasında. NOT: gofret önceki aşamada kullanılan aynı geliştirici geliştirilebilir. </li></ol></li><li> Kontrol Vanası Usta hazırlayın <ol><li> Spin-kat 45 saniye boyunca 2.000 rpm&#39;de temiz gofret üzerine SU-8 fotorezist inceltilmiş. </li><li> 6 dakika boyunca 95 ° C &#39;de yumuşak fırında gofret. Bir kişi hizalama kullanarak, 10 saniye boyunca kontrol vanası desenli gofret maruz. 6 dakika boyunca 95 ° C &#39;de bir maruziyet sonrası fırında yapın. </li><li> 2 dakika için SU-8 Developer gofret geliştirin, ya da artık kaldırılıncaya kadar. Yukarıdan aşağıya doğru hareket, izopropanol ile durulayın. 4 dakika boyunca 180 ° C&#39;de, nitrojen ve fırında Kuru gofret. </li></ol></li></ol> 2. PDMS Cihaz İmalatı <ol><li> Buhar biriktirme ile 0.2 mi trimetilklorsilan ~ Tüm ustaları Silanize. <ol><li> Hızla Silanizing ajanı birkaç damla ile oda sıcaklığında hava geçirmez bir kapta usta içine. NOT:. Diğer Silanizing protokolleri kabul edilebilir 38 ise yapılan properly PDMS kaldırmak kolay olacaktır. </li></ol></li><li> Içindeki çok katmanlı valfın gösterilmiştir olarak 39 tasarımları, cihazın membranı ve kontrol valfı katmanları için farklı oranlarda bir ticari poli (dimetilsiloksan) (PDMS) tabanı ve sertleştirme ajanı karıştırılır. 1 ve 5: baz oranı 1: 20 kullanarak zar ve kontrol valfı kalıplar için sertleştirme maddesi olarak bulunmuştur. <ol><li> Membran kalıp için, sertleştirme maddesi, 0.5 g baz, 10 g karıştırılır. NOT: Bu birim zar ustası üzerine spin-kaplı olacaktır. </li><li> : 1 oranında kontrol vanası kalıp, bir 5 taban ve sertleştirme ajanı karıştırılır. Kontrol vanası ustası tutmak için kullanılan kap bağlıdır kontrol vanası kalıp gerekli PDMS miktarı; ana PDMS ~ 1 cm ile kaplanmış şekilde doldurunuz. </li></ol></li><li> İyice hava kabarcıkları görebilir kadar her ikisi de bir vakum odası içinde preparatlar ve de-gaz bunları PDMS karıştırın. Isıya dayanıklı kontrol valfi ana yerleştirinkutu, bir cam tabak gibi. 1 oranında Master üzerinde PDMS ve de-gaz kabı ikinci kez: dikkatlice 5 dökün. </li><li> Kontrol vanası PDMS konteyner de-gassed edilirken, spin-kat 20: dikkatle hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için zar ustası üzerine PDMS karışımı dökerek membran yöneticisinde 1 oranında PDMS, daha sonra spin-kaplama usta 1,000 rpm&#39;de 45 saniye boyunca karıştırılmıştır. </li><li> Kısmen zar ana 6 dakika ve kontrol valfı ana için 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de bir fırın içinde, her iki ustaları tedavi. NOT: Kısmen tedavi zaman PDMS şeklini tutmak gerekir, ama malzeme biraz pejmürde olacaktır. PDMS henüz tedavi değilse basıldığında malzeme şeklini tutar kadar bir seferde bir kaç dakika artışlarla tekrar pişirin. </li><li> Uzakta yavaşça kalıp soyma, kontrol vanası ustadan dikdörtgen PDMS kalıplar kesin. 0.75 mm delik yumruk kullanarak kalıplı bileşeni aracılığıyla giriş delikler. NOT: delik 23 birimlik bir blun sokulmasıyla temizlenebilirGerekirse t ucu iğne ve kalıp dış, selofan bant ile temizlenebilir. </li><li> Membran yöneticisinde reaksiyon odaları bulmak tepkime haznesi membran özellikleri ile kontrol vanası kalıp bileşeni hizalayın ve membran ustanın üstüne doğrudan kontrol vanası bileşeni yerleştirmek için bir optik mikroskop kullanarak. Cihazın sol alt köşesine kontrol vanası girişini yönlendirmek ve reaksiyon odaları ve membran master kanal dikdörtgen kontrol vanası içinde görünür olduğundan emin olun. </li><li> 2 saat süre ile 80 ° C &#39;de hizalanmış kalıp bileşenleri pişirilir. NOT: membran ve kontrol vanası kalıpları şimdi birlikte mühürlü ve bir kalıp olarak manipüle edilecek. </li><li> Membran delmek için değil bu yüzden çok yavaşça ustadan kalıp soyma, uzak zar ustadan katmanlı PDMS kalıp kesin. </li><li> Giriş Punch ve 0.75 mm delik yumruk kullanarak hücre ekstresi girişi için delik çıkış. Her iki katmanları üzerinden delikler,Aşama 2.6 de tarif edildiği gibi aynı şekilde temizleyin. </li><li> Bir indüktif eşleşmiş plazma-temizleyici, plazma tedavi hem kalıp (membran tarafı yukarı) ve 20 saniye boyunca 10.5 W bir numaralı 0 cam lamel kullanma. Hemen plazma temizleyici lamel ve kalıp çıkarmak ve cam ve kalıp arasındaki hava cepleri en aza indirmek için çalışırken, cama doğru, membran tarafı bileşenleri katman. Membran giriş kanalı doğrudan basmayın, ya da zar zor reaktanları ile kanal doldurmak için yapım, cam tavlama olabilir. <ol><li> Cam katmanı kesilmesini önlemek için monte aygıtları tutarken özel özen gösterin. Cihaz yüksek büyütme yağ daldırma hedefleri kullanılarak cam lamel ile görüntülü gerekir gibi ince cam lamelleri kullanın - cam çok kalın ise, cihaz özellikleri görünür olmayabilir. </li></ol></li><li> Son olarak, 2 saat süre ile 80 ° C&#39;de tamamlanır cihazları tedavi. </li></ol> 3. Deneysel Kurulum foR Hücresiz protein sentezi Reaksiyon <ol><li> 1 saat boyunca deiyonize edilmiş su içinde kaynayan bir cihaz hidratı. NOT: Tamamen sulu Aygıt bulutlu bir görünüm olmalıdır. Cihaz, aynı zamanda hidrat için oda sıcaklığında steril su içinde O / N bırakılabilir. </li><li> Bir inkübasyon odası bir ters mikroskop kullanılarak, 30 ° C çevre sıcaklığı ayarlayın. NOT: Bu sıcaklık, böylece diğer reaksiyonlar için en uygun sıcaklıklar 40 değişebilir, bir T7 promotörü ile GFP ekspresyonu optimize etmek üzere seçilmiştir. </li><li> Dağı cihaz selofan bant ile sahne tutucu mikroskop ve yerel hidrasyon korumak için ıslak kağıt mendil ile cihazın kenarları sarmak için. </li><li> Kontrol valf harekete ve reaktif girişi için azot gazı basıncı modüle iki yüksek hassasiyetli kapalı-çevrim gerilim basınç dönüştürücüler kullanın. NOT: diğer atıl gazlar kullanılabilmektedir ama bu protokol, sadece düşük saflıkta azot ile test edilmiştir. <ol><li> Ilk dönüştürücüyü bağlayınBir septum kapak ile 4 ml bir cam şişe içinde tutulan bir su deposu 24 gauge PTFE tüp. Bir 23 gauge küt uçlu iğne ile sonlanan bir ikinci tüp kullanarak kontrol valfı girişine rezervuar bağlayın. NOT: Her iki tüpler iki keskin 23 gauge iğne ile rezervuar septum nüfuz. </li><li> Bir erkek-erkek Luer-lok konnektörüne bağlı 24 ayar PTFE tüp ikinci transdüser bağlayın. Her cihaz için ayrı ayrı monte başka 23 göstergesi künt uçlu iğne ile tüp bağlı bir Luer-lok 23 gauge iğne bu takın. Bu iğne, membran tepkime kanalına bağlar; Reaksiyon kanalı ve giriş reaktif su temizlemek için kullanın. </li></ol></li><li> Bir hücresiz protein sentezleme sistemi kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre, buz üzerinde Çağrıları reaksiyon bileşenleri bir araya getirin. Buz üzerinde Teklif Çağrılarını reaktifleri tutan harcanan zamanı en aza indirmek ve montajdan sonra hemen cihaza reaksiyonu yerleştirin. NOT: Bu cihaz olmuşturticari bir E. kullanılabilir E. coli protein ifadesi seti ve yapısal olarak GFP ifade eden bir plazmid elde. Toplam reaksiyon hacmi 25 ul&#39;ye ayarlandı - bu arzu edildiği takdirde, reaksiyona giren maddeler için daha düşük bir hacim kullanmak mümkün olabilir. Teklif Çağrılarını reaktifler donma-erime döngüleri duyarlı olma eğilimi gibi, deney öncesinde uygun hacimde reaktif numunelerinin yapmak yararlı olabilir. Diğer reaktif maddeler, reaksiyon karışımına ilave edilebilir, ama reaksiyon tam olarak cihaz üzerine tatbik edilmeden önce monte edilmelidir. <ol><li> Geçen DNA girişi ekleyerek, reaksiyonu birleştirin. Not: bir Eppendorf tüpü içinde bir araya sonra buz üzerinde tutulmuştur takdirde Çağrıları reaksiyon başlar. Bu sorun giderme tutarlı deneyler arasındaki zaman ölçeği ve yardım tutacak - Zaman cihaza reaktifler uygulamak ve deney değişebilir başlamak için alınan beri reaksiyon monte ve karıştırılır sonra, bir zamanlayıcı başlatmak için yararlı olduğunu. </li></ol></li><li> KullanmaAşama 3.4.2 anlatılan boru ve iğne konektörü, bir 1 ml şırınga ile bir tüp içine monte reaksiyon geri. Reaksiyon odası girişine künt ucu iğne takın. Şırınga, iğne konnektörünü ayırın ve reaksiyon odası dönüştürücü için kullanılan erkek-erkek konnektörüne takın. </li><li> Kanalı doldurmak için Çağrıları reaktanlar basınç (&lt;10 psi) uygulanır. Reaksiyon dolduğunda iğne çıkarın. </li><li> Kontrol vanası girişine diğer transduserden künt tüp yerleştirin. Henüz kontrol vanası basınç etmeyin. </li><li> Sahnede monte cihazı yerleştirin. Aydınlık görüntüleme kullanarak, bir 100X yağ daldırma amacı ile reaksiyon odaları bulun. </li><li> Harekete geçirir 20 psi kontrol vanası transdüser tazyikli tarafından kontrol vanası; Kontrol valfı harekete geçirildiği zaman zarda gözle görülür bir değişiklik belirgin olacaktır. Reaksiyon odalarının dipleri odaklanın. </li><li> Görüntü elde etme başlayın; floresanstaki artış ağırlıkbüyük olasılıkla reaksiyonun erken dönemlerinde belirgin olmayacak olsa hasta, iç ve reaksiyon odalarının dış çevresinde görülebilir. Reaksiyon kararlı durum floresan ulaşıncaya kadar her 1-3 dk görüntüleri yakalayın. Otomatik odaklama aşaması mevcut değilse, kısaca görüntüler atılıyor önce her görüntüyü yönlendirmesi. NOT: Bazı photobleaching meydana olsa nedeniyle photobleaching göre floresan üzerindeki etkileri sürece photobleaching oranı bilindiği gibi hesaba olabilir. Bu ışıkla ağartma hızı belirli bir süre boyunca sabit bir ışıkla ağartma tür GFP bilinen bir konsantrasyonda ya da florofor karışımı gibi bir floresan standart, maruz bırakılması ile tahmin edilebilir. </li><li> Edinilen ilk görüntüye tepki düzeneğinden geçen zamanını kaydedin. NOT: Bu genellikle 4-5 dakika sürer. </li></ol> 4. Görüntü Analizi ve Veri İşleme <ol><li> Böyle ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak seçinBir ROI olarak reaksiyon odalarının iç. Tüm resimler için ROI ortalama floresan yoğunluğu değerini kazanır. NOT: Bu ham floresan yoğunluğu izidir. <ol><li> Her reaksiyon haznesinin iç çevresinde ilgi bölgeleri seçmek için kullanın Zaman Serisi Analyzer - Zaman Serisi Analyzer ve ROI Müdürü eklentileri kullanarak ImageJ Bu görevi gerçekleştirmek. Her reaksiyon odasının iç tekabül eden bir alana &quot;AutoROIProperties&quot; Set &quot;tıklayın On ekle&quot; onay ve her odayı seçin. NOT: Bu adım aynı zamanda floresan odasının etrafında bir ROI çizmek için elips aracını kullanarak yapılabilir. Bu ROI boyutu genellikle 100X amacı ile inceledi 10 mikron çaplı odası için 30 x 30 piksel elips karşılık gelir. </li><li> ROI Yöneticisi tüm ROI&#39;leri vurgulayın. Tüm görüntü yığını içinden her ROI floresan yoğunluğu ortalama belirlemek için &quot;Çok Tedbir&quot; işlevini kullanın. NOT: Sta adında bir eklentickReg gerekirse, görüntü yığını hizalamak için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Bir deneyde tüm odaları için ham floresan yoğunluğu izlerini aldıktan sonra, tüm izleri arasında inter-deneysel ortalaması alınarak, bireysel ham izlerinden ortalama çıkarılarak reaksiyon deterministik bileşeni belirlemek. Böyle bu analiz için Igor veya MS Excel gibi kullanın veri analiz yazılımı. NOT: Bu gürültü sağladığı reaksiyon odası için izler. </li><li> Hücreler 25 türetilen gen sentezleme gürültü analiz etmek için kullanılan aynı usuller kullanılarak, bu tepkime hazneleri gen ifadesi gürültü analiz edin. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücrelerinde gen ifadesi nedeniyle küçük hücresel hacimleri ve önemli reaktanları düşük kopya numaraları doğal gürültülü. Gürültü biyoloji genellikle kaynaklar, işlenmesi ve gen devreleri ve ağları 44 kontrol moleküllerin nüfus konsantrasyonlarda, pozisyonları, ya da devletlerin dalgalanmaların biyolojik sonuçları üzerinde duruluyor. Bu çalışmanın büyük bölümü, hücre içindeki genetik ağların doğal kapsamında bir gen devresinin gürültü görüntüleme avantajı hücresel sistemlerde gerçekleştirilmiştir. Fakat, hücre içermeyen sistemler hücresel sistemlerde önlenemez karıştırıcı dış etkilere 18 olmadan tek bir gen devresinin iç dalgalanmaların karakterizasyonu sağlar. Gürültü analizi, işleyişi, genetik devreleri yapılandırılmıştır ve nasıl içine önemli fiziksel anlayışlar sunabilir, negatif ve pozitif 25 karakterize hücresel sistemlerde kullanılan olmuştur <sup&gt; 27 otoregülasyon, dışsal ve 45,46 patlama ifade gürültü 18, ve transkripsiyonel içsel katkıları. Burada daha iyi tutulmasının ve 47,48 sıkıştırmadan asli protein sentezleme gürültü sahip rolleri anlamak için, reaktör büyüklüğü ve reaksiyon başlatma kez aynı anda kontrol edilmesini sağlamak mikroakışkan cihazlarda, hücre içermeyen bir ekspresyon sisteminin çalışmasını anlatmaktadır canlı hücreler ile bağlantılı komplikasyonları. tasarımın özelliği veren temel femtoliter hacim (mikron çaplı) yakalar PDMS elastomerik &quot;kontrol valfi&quot; membran, bir hücre serbest protein sentezleme sisteminin, reaktanların sınırlandırılması için kullanılan reaksiyon odaları dizilerinin entegrasyonu Reaksiyon başlatılması için iyi tanımlanmış bir &quot;sıfır zamanında&quot; de reaktifler (Şekil 1). Bu kontrol, protein sentezinde yer alan reaksiyonlar kinetik foll sağlaryüksek hassasiyet ile gerçek zamanlı olarak borçlu. Arası deneysel değişkenliği mümkün olduğunca en aza indirgenmesi için Bunun gibi, hücre içermeyen reaktiflerin idare etmek önemlidir. Bu kontrol bize teknikleri, daha önce canlı hücre içinde gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılan benzer bir şekilde, hücre içermeyen bir genetik devrelerin gürültü yapısının ölçülmesine olanak vermektedir. Çağrıları sistemlerinde kullanılan reaktanlar donma-erime döngüleri duyarlı olabileceği için, reaktiflerin, buz üzerinde çözülmesi için harcadıkları zamanı soğuk reaktantları tutmak ve en aza indirmek için önemlidir. Periyodik zaman içinde ekspresyon seviyelerindeki değişiklikleri tespit etmek için, toplu olarak Çağrıları sisteminin ifadeyi test etmek için iyi bir uygulama - bu, bir Eppendorf tüpü içinde 10-15 ml&#39;lik bir reaksiyon yapılır ya da bir mikro-plaka okuyucu gibi bir cihaz olabilir , birden gerçekleştirir reaksiyon kinetiği yakalamak için zamanla okur. Düşük ifade l sorun giderirken her deneyde girenler yaş ve çözülme sürelerini kaydeden yardımcı olacaktırdüzeyleri,. Çağrıları reaktifleri montaj Bundan başka, bu da tam olarak monte edilmiş ve buz çıkartıldıktan sonra, reaksiyon başlar dikkat etmek önemlidir. Tutarlı &quot;bir zaman sıfır&quot; korumak için, DNA girişi son ilavesinden sonra programdan hibe reaksiyonun başlatılması aşağıdaki süresini kaydetmek için, ve kuluçkaya cihaza mümkün olduğunca çabuk reaksiyonu uygulamak yararlı olacaktır. Bu işlem yaklaşık 4-5 dakika sürer, ve floresan henüz reaksiyon odaları içinde görünür olmamalıdır. Bu kontrol tepkime eğrisinin büyüme kısmı görselleştirmek için uygun zaman maksimum olmasını sağlar. Cihazda Teklif Çağrılarını reaksiyonları çalıştırmadan önce, kalite-kontrol testleri odalarından hiçbir sızıntı olduğunu doğrulamak için çalıştırmak için tavsiye edilir. Bir sıkı bağlamak test cihazı için bir flüorofor uygulanması ve de tamamen ağartılmış kadar bağımsız bir kuyu maruz bırakılması ile (Şekil 2B gibi) gerçekleştirilebilir. Fonksiyonlu odalar olması durumundabölmenin duvarları ve iç ve dış mekanlar arasında bir tezat var olmalı - hiçbir kurtarma içinde de görünür olmalıdır, iyi-mühürlü. Floresan kurtarma açıktır veya reaksiyon odasının duvarları iyi tanımlanmış değilse, kontrol vanası basınç artırılmalı veya cihaz cam slayt sızıntı veya delaminasyon kontrol edilmelidir. Bu protokol, ticari bir E. Çağrıları reaktifleri ile test edilmiştir diğer güçlü Çağrıları sistemleri kullanılabilir olsa da (25 ul ölçekli) E. coli hücre serbest protein sentezleme kiti. Bu tepkin madde maliyeti deneylerinde sınırlayıcı bir faktör olduğunda yararlı olabilir cihaz tepkileri uygularken 25 ul daha düşük miktarlar kullanılması da mümkündür. Böylece bu aygıt için müsait değildir - reaktifler cihaza ilave edilir ve reaksiyon odaları kapalı sonra, bu de harekete geçiren bir kontrol valfi olmadan çözeltisine tepkime maddelerini eklemek mümkün değildirReaksiyon sırasında belirteçlerin ilave edilmesi gerekmektedir reaksiyonlar için le. Değerlendirilmemiştir Bu süre sonra dehidratasyon ve cihazın kuruma etkileri - Bu cihaz aynı zamanda Teklif Çağrılarını 3 saat daha uzun çalışabilir reaksiyonları gözlemlemek için optimize edilmemiştir. Daha uzun reaksiyon süreleri arzu edildiği takdirde, bu etkiler, ya da bir rutubet gözünün kullanılarak, buharlaşmayı önlemek için cihaz conta inkübasyon sıcaklığının değiştirilmesi ile hafifletilebilir. Böyle odası duvarları 49,50 veya gözenekli zar tabakasının dahil olarak nano-gözenekli yapılar olarak cihaz tasarımı Değişiklikler, reaktif alışverişine izin ve böylece reaksiyon sürelerini uzatmak olabilir birkaç yöntem temsil eder. Muntazam hacim mikrofabrike reaksiyon bölmeleri bölme duvarlı &quot;yan reaksiyonların&quot; olarak deney ve araştırma için son derece uygundur tutarlı boyutlar muhafaza edilmesi için değerlidir. Kullanarak yöntemlerinin aksine hayırBu reaksiyonlar az sayıda değerlendirilmesi gerekirse de, teknik, n-mikrofabrike ve deneyler esnasında boyutsal bir esneklik sağlamaz. Ancak, bu reaksiyon odaları için kontrol tasarım time-lapse mikroskopi için son derece uygundur, ve lohusalık yüksek verimli yöntemine bir aydınlatıcı tamamlayıcısı olabilir.

Hücre-serbest sistemler canlı hücrelerin çalışmasında kaçınılmaz olan bu tür fitness, bölünme ve mutasyon gibi komplike faktörlerden arındırılmış biyolojik reaksiyonlar görüntülemek için basitleştirilmiş ve esnek bir platform sunuyoruz. Bu tür yaklaşımlar membran proteinlerinin 1 karakterizasyonu, protein etkileşimleri 2 sondalama ve çeviri 3-7 temel yönlerini keşif gibi hücresel sistemler incelemek için istihdam edilmiştir. Son zamanlarda hücre içermeyen sistemler sentetik biyoloji 8-10 için geçerli platformlar gibi bir dayanak başladı. Bu tür yaklaşımların itiraz yaşadıkları hücrelerde reaksiyon dinamiklerini etkileyen kaynak paylaşımı ve &#39;dışsal gürültü&#39; sentetik biyoloji özgür olmasıdır. Ancak soru hücre içermeyen reaksiyonlar gömülü olduğu fiziksel çevre reaksiyonun ilerlemesini ve sonucunu nasıl etkilediğini olarak kalır. Hücre-serbest reaksiyon ortamlar - özellikle sınırlı EnvironmHücre-ilgili birimleri yaklaşım veliler - kötü karakterize kalır. Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) litre ölçekli reaksiyon hacimleri 11 mikrolitre bir dizi genelinde eşdeğer kinetik sergileyen &#39;ölçek-ücretsiz,&#39; olarak geleneksel olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, hücresel ölçekli hacimlerine hapsedilmesini reaksiyonlar önemli ölçüde protein ekspresyon oranları 12 etkilediği gösterilmiştir. Stokastik hücre-serbest reaksiyonların doğası - özellikle hacimleri femtoliter altında gitmek bile bu sistem yaklaşımı olarak ya da - özellikle önemli olabilir. Gen ekspresyonunda Gürültü büyük ölçüde küçük hücreli hacim ve bileşenlerin yüksek yoğunluk gibi yalnız kalma sureti ile etkilenmiş bir özelliği önemli moleküllerin pek çok kuvvet çok düşük popülasyon seviyeleri göre - örneğin 1 fl hacmi içinde Escherichia coli sınırlandırır kadar 4,300 farklı polipeptidleri altında birkaç yüz farklı promotörlerin 1 uyanlabilir kontrolü3. Bu doğal gürültü chemotaxis 14 olmak üzere çok sayıda biyolojik süreçlerde merkezi bir itici güç olarak dahil olmuştur, aktif çoğaltma ve gecikme 15, lizis ve lizojeni 16,17 arasında λ faj kararı ve yetkinlik arasındaki Bacillus subtillus kararı arasında HIV kararı ve sporülasyon 17. Hücre içermeyen sentetik biyoloji sonra hücresel gen devreleri ve ağların stokastik özelliklerini keşfetmek ve belirli teknolojik hedeflere ulaşmak için bu davranışları değiştirmek için bir fırsat hem de sağlar. Hücresel sistemlerin az gürültü 18-27 iyi çalışılmış edilmiş olmakla beraber, özellikle de hücre bazında, hücre barındırmayan sistemlerde 8 temel ses davranışı az arama olmuştur. Burada hücre içermeyen sentetik biyolojide stokastik etkilerinin incelenmesi için bir platformu sunmak. Bu mikrofabrike platformu femtoliter ölçekli reaksiyon c içeriyorhızla açık (ve odanın dışında serbest difüzyon) ve devletlerin kapalı (bölme içinde sınırlı reaktanları) arasında geçiş olabilir Hambers. Kapalı durumda, bir yeşil floresan protein (GFP) ifade hücresiz protein sentezi (Çağrıları) reaktantları sınırlandırmak ve zaman atlamalı floresan mikroskobu 28 (Şekil 1) kullanılarak gen ekspresyonunu takip edin. Bu hücreler 25 karakterize etmek için kullanılan, doğrudan benzer bir şekilde gen ekspresyonu, stokastik dalgalanmalar yapısını ölçerek hücresiz ortam karakterize eder. Hücresiz tepkileri sınırlanması için olmayan mikroüretim yöntemleri veziküller ve lipozomlar 29-32, bir su-içinde-yağ emülsiyonları 12 ve gözenekli ortam 33 içerir. Bu yöntemler sınırlı hacimleri 34 boyutu dağılımı üzerinde kontrol sağlayabilir ancak bununla birlikte, mikroüretim yöntemleri bile nano üzerinde sıkıca belirtilen ebatlara yüksek tekrarlanabilir özellikleri oluşturmak.Ayrıca, bu sert yapılar kolayca buharlaşma veya dış ortamda değişikliklere duyarlı olmadan zamanla izlenebilir. Hızlı reaksiyon (zaman sıfır) başlatıldığı zaman zaman açıkça belirlenmesini zorlaştıran, reaksiyon başlangıcından aşağıdaki reaksiyon odaları mühür, önceki çalışma 8,35 olarak kullanılan mikrofabrike konteyner tasarımları. Burada yer alan yöntem kullanılarak, sadece 4-5 dakika bu şekilde iyi tanımlanmış bir &quot;sıfır zamanında&quot; sağlayan başlatma ve cihaz üzerindeki reaksiyon görselleştirme arasında ihtiyaç vardır. Aşağıdaki protokoller imal edilmesi ve optik litografi, cihaz grubu, cihaz test ve görüntü analizi için yöntemler de dahil olmak üzere, bu cihaz test etmek için yöntemler açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>SU-8 2015</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>SU-8 Thinner</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000 series</td><td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td></tr><tr><td>Chlorotrimethylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360 FLUKA</td><td>Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm hole-puncher</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>Harris Uni-Core</td></tr><tr><td>23 gauge needles blunt tip</td><td>Component Supply Co.</td><td>/NE-231PL-25</td><td></td></tr><tr><td>#0 glass coverslip</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260366</td><td>Gold Seal</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE 300</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Roper Scientific</td><td>CoolSNAP-HQ</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Shutter Insturment</td><td>Lambda SC</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>Color Filters</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission</td><td></td></tr><tr><td>100X oil-immersion objective</td><td>Nikon</td><td>N.A. 1.4</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Regulator</td><td>Oko Lab</td><td>H201-T</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Universal Imaging Corp.</td><td>Version 7.8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>Marsh Bellofram transducers</td><td>Marsh Bellofram</td><td>T2000</td><td></td></tr><tr><td>24 gauge PTFE tubing</td><td>Component Supply Co.</td><td>/SWTT-24-C</td><td></td></tr><tr><td>Septum vials</td><td>National Scientific</td><td>C4015- 17W</td><td></td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>Hewlett Packard</td><td>6205B Dual DC Power Supply</td><td></td></tr><tr><td>Sharp 23 gauge needles</td><td>Precision Glide</td><td>305129</td><td></td></tr><tr><td>Male-to-male luer lock adapters</td><td>Qosina</td><td>20024</td><td>Polycarbonate</td></tr><tr><td>Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge</td><td>Component Supply Co.</td><td>/NE-232PL-5C</td><td>Polypropylene</td></tr><tr><td>S30 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; protein expression system</td><td>Promega</td><td>L1110</td><td></td></tr><tr><td>Pet3a-GFP vector/protein</td><td>Novagen</td><td>69418-3</td><td>Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.</td></tr><tr><td>Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit</td><td>Biorad</td><td>#732-6120</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probes</td><td>AF555</td><td>http://www.lifetechnologies.com</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Version 1.46r</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: Time Series Analyzer</td><td>Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA</td><td>Version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: StackReg/TurboReg</td><td>Ecole Polytechnique F&amp;eacute;d&amp;eacute;rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td><td>Distribution is dated July 7, 2011</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: ROI Manager Tools</td><td>Tiago Ferreira</td><td>12/15/2013 Version</td><td></td></tr></tbody></table>

sealable femtoliter chamber arrays for cell-free biology

Hücre-serbest sistemler karmaşık kaynak paylaşımı izole biyolojik reaksiyonlar belirli ağları tarama için esnek bir platform sağlamak (örneğin, küresel gen ifadesi, hücre bölünmesi) canlı hücrelerin içinde karşılaştı. Ancak, geleneksel makro ölçekli toplu reaktörlerde kullanılan bu tür sistemler, genellikle kendi yaşam mikro ölçekli meslektaşları karakteristik dinamik davranışları ve verimliliği sergilemek için başarısız. Reaksiyon dinamikleri iç hücre yapısı ve ölçek etkisini anlamak karmaşık gen ağları anlamak için çok önemlidir. Burada kapalı moleküler sistemin esnek karakterizasyonu izin verirken hücresel ölçekli hacimlerindeki hücre içermeyen tepkiler sınırlayan bir mikrofabrike cihaz rapor. Bu çok-katmanlı poli (dimetilsiloksan) (PDMS) cihazı (açık ve kapalı) tahrik edilebilir bir elastomerik zar üzerinde femtoliter ölçekli reaksiyon bölmesi içerir. Çalıştırıldığında, odalar Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) reaksiyonları sınırlandırmakzaman atlamalı floresan mikroskopi kullanılarak zaman içinde kinetik reaksiyon görüntülenmesi için izin veren bir floresan proteini ifade etmiştir. Burada bu cihaz Çağrıları gen devreleri karakterize etmek ve böylece hücresel sistemlerde kullanılan ses biyoloji tekniklerinin kullanımını sağlayan, hücresel sistemlerin karakterize etmek için kullanılan, doğrudan benzer bir şekilde Çağrıları reaksiyonlar gürültü yapısını ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir ve Hücre içermeyen çevre ile etkileşimleri.

Bu mikrofabrike platformun belirgin bir avantajı, bağımsız bir Çağrıları tepkileri (Şekil 2A) sınırlandırmak üzere harekete geçirilir kontrol elastomerik &quot;kontrol valf&quot; uygulanması bulunmaktadır. Cihaz harekete geçirildiğinde, membrandan odaları reaksiyon bölmesinde (Şekil 2C) bir diziye floresan reaktifler sınırlandırmak için cam lam üzerine bastırılır. Bölmeler güvenilir deney süresi boyunca reaksiyonun sınırlandırmak doğrulamak için, bir bazik sıkı bağlamak testi (ışıkla ağartma sonra Floresan Kurtarma) 37 uygulanmıştır. Bir fluoroforun (AF 555) cihaza uygulanan ve kontrol vanası tahrik edildi; mikroskop deklanşör diyafram kullanarak, bir (Şekil 2D) tek sıra fluorofor izole edilmiştir hapsederek ve bireysel photobleached. karanlık oldu ve kontrol vanası 20 dakika basınçsız kadar parlaklık kurtarmak değil iyi seçilmiş60, daha sonra, cam bölmeyi serbest bırakır. Bu test, bu reaksiyon haznesine deney süresince iyi açılmadan doğrular. Uygun koşullar altında (örneğin, GFP veya Lusiferaz gibi) kolayca görülebilir proteini eksprese eden bir Çağrıları Reaksiyon bu cihaza uygulanan bir kaç dakika içinde fark edilebilir bir proteini ifade eder. Reaksiyonun süresi boyunca, tepkime hazneleri iç ve dış, protein sentezi görüntülenmiş olan ve her bir odanın (Şekil 3A) içinde flüoresan yoğunluğu birimleri ölçülmesiyle hesaplanabilir. Floresans yoğunluğu protein konsantrasyonuna karşılık gelen, her bir reaksiyon odası (Şekil 3D) zaman içinde eşlenebilir. Gen ifadesi her moleküler aşamada (bağlayıcı sentezi, yıkımı, protein-DNA, vb) 20 dalgalanmaları (gürültü) tanıtır doğal olarak stokastik süreçtir. Gürültü biyoloji Bir şube üzerinde duruluyorGen devre gürültü 41 ispat değeri. Hücresiz sistemlerde ifadesi ifade eden moleküler makine ve reaksiyon kapları sınırlarını tanımlayan yüzeyleri arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan dış gürültü etkileri olacaktır. Hücre-serbest reaksiyonlar bile küçük reaksiyon odalarına sınırlı olarak bu dışsal etkiler olasılıkla daha belirgin hale gelecektir. Birden çok sınırlı Çağrıları reaksiyonlar zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği daha sonra hücresel sistemler 25 bildirilmiştir yöntemlere, doğrudan benzer bir şekilde kapalı hücre içermeyen sistemlerde gürültü yapısı (büyüklük ve dinamikleri) dikkatli analiz sağlar. Şekil 3C ve 3B ile ilgili, sadece yaklaşık 300 fl hacim tekabül PDMS reaksiyon bölmesi 10 mikron çapında içinde göre, 15 ul&#39;lik bir oyuk hacmi olan bir standart 384-çukurlu bir mikrolevhadaki bir T7 promoterinden kurucu GFP süresini gösterir Yedi siparişdaha az büyüklükte s. 10 um, reaksiyon odası içinde protein ekspresyonu oranlarındaki farklılıklar hücrelerde görülen yaklaşan, iyi levha ölçümleri çok daha yüksektir. Cihaz üzerinde yapılan çoğaltılmış çok katlı reaksiyonlar bir mikroplaka okuyucu platolar, genellikle reaksiyon hacmi 42,43 içindeki kaynak sınırlama neden olduğu varsayılmaktadır floresanstaki hızlı bir artış vardır (Şekil 3B), toplu olarak yapılan Çağrıları reaksiyonlara benzer kinetik sergileyen . Bu belirleyici bir büyüme davranışı, dalgalı olsa da, bütün reaksiyon odası boyunca ve deneyler arasında tutarlıdır - deneyler boyunca odalar arasında izleri ortalama ile, belirgin bir eğilim reaksiyonu (Şekil 4A), sadece gürültü bileşenleri bırakarak iz değerlerinden çıkartılmaktadır edilebilir . Şekil 4B deterministik, geçici bileşenin çıkarılmasından (üst sonrasında GFP ifade gürültü gösterir) Ve Şekil 4A, 10 um, reaksiyon odası karşılık gelen izleri sırasında gürültü (alt) otokorelasyon. otokorelasyon izleri sıfır gecikme süresi varyans gibi, gürültü büyüklükleri verirken otokorelasyon izleri yarım zamanlarda dağıtım gürültü frekans bağımlılığını verir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> Şekil 1. hücresiz protein sentezi reaktifler gen sentezleme gürültü ölçümü amacıyla femtoliter tipi bir reaksiyon odası içinde hapsedilir. Ticari bir hücresiz protein sentezleme sistemi için reaksiyona giren maddeler içinde PDMS reaksiyon bölmesi GFP teşkil edici olarak ifade sınırlı için kullanılır. Bu bölmelerin bir dizi protein ekspresyonu ve gen sentezleme gürültü karakterize etmek amacıyla, zaman atlamalı floresan mikroskobu ile görüntülenebilir. floresan yoğunluğu ozamanla her reaksiyon haznesi bireysel iz olarak çizilen olabilir f. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> Şekil yapışmalı femtoliter ölçekli odaları ile iki katmanlı mikroakışkan cihazın 2. Fabrikasyon. (A) Düzen ve cihaz tabakalarının görünümü patladı. Cihaz iki PDMS katman ve bir cam lamel oluşmaktadır. Cam ve kontrol valfı tabakası arasında PDMS membran, tepkime haznesine sahiptir. PDMS tepkime haznesinin (B) SEM görüntüsü. İç çapı 10 mm. Cihazdaki giriş kanalı (C) şematik. Hücre-Free Protein Sentezi (Teklif Çağrılarını) reaktifler reaksiyon kanalıyla uçakla. Su kontrolünde basınçlı edilirValf odaları 37 sızdırmazlık, cam slayt karşı reaksiyon odaları sıkıştırmak için. Ref çoğaltılamaz. Royal Society of Chemistry izni ile 37. (D) Floresan Kurtarma iyi FITC odasını gösterir kullanarak tek üzerine (sıkı bağlamak) testi Photobleaching sonra dış ortama karşı iyi mühürlü olduğunu. Fluorofor odaları (üst resim) yakalandı ve bir tek kuyu (düşük görüntü) photobleached edildi. Hiçbir floresan kurtarma kontrol vanası serbest bırakılıncaya kadar photobleached odasında görüldü. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> Kapalı Hücre-Free Reaksiyon Şekil 3. EGFP ifadesi. (A) kapalı reaksiyon c Floresan görüntüleri<html> reaksiyonunda seçilen zaman noktalarında Hambers. Protein üretimi reaksiyon bölmesi içinde ve ana kanaldaki odası dışındaki görülebilir. (B), EGFP bir T7 polimeraz promotörünü ve terminatörünü ve güçlü bir ribozom bağlanma yeri (RBS) sağlayarak, pET3a vektörü içine klonlandı. (C) bir mikroplaka okuyucu içinde yapılan bir kütle hücresiz reaksiyonda EGFP yapısal ifadesi Normalleştirilmiş floresans ölçümleri. Teklif Çağrılarını reaksiyonlar genellikle hızlı bir şekilde &#39;kararlı durum&#39; floresan yavaşlama önce protein üretmek - Bu kaynak kısıtlılığı 43 ile ilişkilidir. Siyah tire ortalama iz gösterir. (D) birçok deney içinde 51 reaksiyon odalarından okunan 51 ham floresan yoğunluğu izleri normalize floresan. Siyah tire protein ifade deterministik bileşeni göstermek çeşitli deneyler üzerinde ortalama iz gösterir./52616/52616fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> Şekil 4. Bireysel Gürültü izleri ve Hücresel ve Hücre-Free Sistemi Gürültü Otokorelasyon. (A) Austin Gönderen ark., GFP (üst) ve bakterileri 25 canlı izleme GFP üretimi elde normalize otokorelasyon fonksiyonları (alt) 2006. Gürültü. Macmillan Publishers Ltd. izni ile yayımlanmaktadır: [Doğa] 25 (. Cilt 439), telif hakkı (2006). Mikroakışkan cihaz reaksiyon odalarında izlenen (B) GFP (üst) ve hücre-free sistemi GFP üretimi elde normalize otokorelasyon fonksiyonları (alt) Gürültü,. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">tıklayınız</a>Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Watch this Scientific Journal Video about Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology at JoVE.com

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Hücre-serbest Biyoloji yapışmalı femtoliter Odası Diziler

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

sealable-femtoliter-chamber-arrays-for-cell-free-biology

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Görüntüleme.  University of Tennessee, Knoxville. A microfabricated device with sealable femtoliter-volume reaction chambers is described. This report includes a protocol for sealing cell-free protein synthesis reactants inside these chambers for the purpose of understanding the role of crowding and confinement in gene expression.

Video: Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Kanser Araştırmaları

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

Yüksek Verim Micro-encapsulation Tek hücreli ve Çoklu-hücre

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and analyzing cells at the single-cell level by eliminating the influence of external factors on the cellular microenvironment. Encapsulation of cells in droplets is dictated by the Poisson distribution as a function of the number of cells present in each droplet and the average number of cells per volume of droplet. Primary cells, especially immune cells, or clinical specimens can be scarce and loss-less encapsulation of cells remains challenging. In this paper, we present a new methodology that uses pipette-tips to load cells to droplet-based microfluidic devices without the significant loss of cells. With various cell types , we demonstrate efficient cell encapsulation in droplets that closely corresponds to the encapsulation efficiency predicted by the Poisson distribution. Our method ensures loss-less loading of cells to microfluidic platforms and can be easily adapted for downstream single cell analysis, e.g., to decode cellular interactions between different cell types.

This article presents a protocol for seeding scarce population of cells using pipette-tips to droplet microfluidic devices in order to provide higher encapsulation efficiency of cells in droplets.

Pipet Ucu yöntemine damlacık mikrosıvısal platformlar tohum hücrenin temel

Amongst various microfluidic platform designs frequently used for cellular analysis, droplet-microfluidics provides a robust tool for isolating and ...

Mühendislik

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Kimya

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...