Bu metodolojinin damlacık bazlı mikroakışkanlarla bütünleştirilmesi, tek hücre veya patojen ler arasındaki hücresel heterojenliği ve iletişimi kodlamak için sistem immünolojisi alanıyla ilgili anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Geliştirdiğimiz bu tekniğin en büyük avantajı, bu uç yükleme prosedürünün, nadir hücrelerin damlacıklarda öngörülen yüzde dağılımıyla yakından eşleşmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi, hücreleri cinsiyetli damlacıklara yüklemek ve damlacıklardan hücreleri almak için pipet uçlarının nasıl kullanılacağını anlamak için önemlidir.
Sulu damlacık üretimi için uç yüklemesi için, önce iki mililitre unlu yağa üç mililitre yüzey aktif madde ekleyin ve yağ fazkarışımını 2,5 mililitrelik şırınganın içine çekin. Şırıngadan hava kabarcıklarını çıkarın ve şırıngayı uygun uzunlukta bir teflon boru parçasına bağlayın. İki numune şırıngasını uygun bir iki uyumlu mineral yağla yükleyin ve şırıngayı uygun uzunlukta ikinci bir Teflon boru parçasına bağlayın.
Daha sonra, tedavi edilmiş bir EDMS levhadan beş milimetre çapındaki Polidimethylsiloxane veya PDMS fişini delin ve fişin ortasına bir milimetrelik delik delin. Fişi 200 mikrolitrelik pipet ucunun üst ucuna sıkıca takın ve iki uyumlu mineral yağ şırıngasına bağlı boruyu fişe takın. Pipet ucunu mineral yağla doldurmak için şırınga pistonuna yavaşça bastırın ve kalan tüm havayı dışarı itin.
Hem numune şırıngalarını hem de unlu yağ şırıngasını bir şırınga pompasına dikkatlice yerleştirin. Tüm hava çıkarıldığında, her pipet ucunu numune çözeltisine indirin ve yaklaşık 100 mikrolitre hücre örneğini uçlara aspire edin. Daha sonra, numune içeren pipet uçlarının her ikisini de PDMS çipin iki iç girişine takın ve yağ fazı karışımını içeren tüpü dış girişe takın.
Şırınga pompasındaki akış oranlarını belirtildiği gibi ayarlayın ve her şırınganın boyutlarını girin ve ayarlayın. Numune çözeltisini cihazın iç kanallarından ve yağ fazını cihazın dış kanalından temizlemek için pompayı çalıştırın. Daha sonra damlacık oluşumu kararlı olduğunda damlacıkları toplamaya başlamak için çıkış içine uygun uzunlukta bir boru parçası takın, bir kilit tüpü içinde damlacıkları toplama.
Tüm damlacıklar toplandığında, 200 mikrolitre RPMI ortamı ekleyin, serumsuz, damlacıkların üzerine ve uygun deneysel süre boyunca kilit tüpünün kapağındaki delik ile numuneyi kuluçkaya yatırın. Emülsiyon kırma için, ilk flouinated yağ sekiz mililitre pfo iki mililitre ekleyin ve damlacık toplama tüp ününden fazla yağ kaldırmak için bir şırınga kullanın. Daha sonra emülsiyona 100 mikrolitre 20 PFO çözeltisi ekleyerek kapsüllenmiş hücreleri sulu faza bırakın ve karıştırmak için tüpün kısa bir süre içine dokunun.
PFO'nun hücrelere zararlı olabileceğini unutmayın. Ve bu nedenle, pfo ile temas minimumda tutun. 1-2 dakika sonra, 30 saniye boyunca mümkün olan en düşük göreceli santrifüj kuvvetinde çözeltiyi döndürün ve hemen 550 mikrolitre sulu fraksiyonu 500 mikrolitre soğuk PBS içeren yeni bir kilitli tüpe aktarın, %2 Fetal Buzağı Serumu veya FCS ile tamamlayın.
Herhangi bir artık yağ yeni kilit tüp altına lavabo ve dikkatle yeni bir kilit tüpü sulu faz içeren hücrenin 950 mikrolitre transfer edelim. Yağın sulu fazla birlikte yeni kilit tüpüne aktarılmadığından emin olun. Sonra santrifüj ile hücreleri toplamak ve taze soğuk PBS 300 mikrolitre içinde pelet yeniden askıya 2% FCS ile birlikte.
İpucu yükleme yaklaşımı az önce gösterildiği gibi, Jurkat T hücre kapsülleme oranları istatistiksel olarak tahmin edilen değerlerle çakışabilir. Dikkat çekici, tümör hücreleri gibi yapışık hücreler bile, hangi kümeeğilimindedir, ya da plazmasitoid dendritik hücreler gibi nadir hücreler, geliştirilmiş bir kapsülleme verimliliği gözlenmektedir. Bu temsili kapsülleme sırasında, damlacıklar ultra-düşük jelleşme sıcaklığı agarose kullanılarak rejenere ve üretimden sonra mikroskop ve akış sitometri sitometrisi ile sonraki downstream analizi sağlayan agarose hidrojel boncukoluşturmak için jelleştirilmiş.
Mikroskobik analizler, hücre eşleşmesinin farklı kombinasyonlarda yüksek iş akışı hücre eşleşmesi ve aynı popülasyonun akış sitometrisi ile analiz edildiğini ortaya koymuş, hücresiz boncukların farklı ileri ve yan dağılım desenlerine göre hücrelerle boncuklardan ayrılabildiğini ortaya koymuştur. Gerçekten de, hücresiz boncuk popülasyonu üzerinde gating hücrelerile boncuk popülasyonu üzerinde gating farklı etiketli Jurkat T hücrelerinin kapsülleme gösteren birden fazla alt popülasyonvarlığını ortaya çıkarırken floresan sinyallerin yokluğunda hücre kapsülleme eksikliği doğruladı. Bu yöntemle çalışırken, hücre konsantrasyonu sınırlayıcı bir faktör olduğunu hatırlamak önemlidir ve verimli hücre kapsülleme ve hücre eşleştirme sağlamak için optimize edilmelidir.
Bu prosedürü takiben, sadece bir veya iki hücre yüksek verimlilik ile damlacıklar kapsüllenmiş olabilir, ama birden fazla hücre, ya da hücre türleri, hücresel mikro ortamın daha doğru bir çoğaltma için kapsüllenmiş olabilir. Bu teknik, skar hücresi popülasyonlarının optimal kullanımı ve damlacıklarda etkin kapsülleme için immünoloji ve ilgili disiplinler alanlarında araştırmacıların gürültüsüz bir ortamda hücresel davranışları incelemelerinin önünü açacaktır.
