This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

NOT: Etik Açıklama: hayvan taşıma için protokol California, Irvine, protokol # 2010-2943 Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Omurilik 1. Kaldırma <ol><li> Bölmesine euthanizing içinde ~% 100 sıvı izofluran, USP ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin ve üstüne kuru kağıt havlu yerleştirin. Fare izofluran dokunmadan değil çok kuru kağıt havlu üstüne odasında fare yerleştirin ve oda kapalı olduğundan emin olun. Fare ötenazi olduğundan emin olmak için nefes kesilmesinden sonra en az bir dakika bekleyin. </li><li> Fare ötenazi sağlamak için boyun spinal transeksiyonu gerçekleştirin. Bu omuriliği zarar verebilir gibi bir servikal dislokasyon yapmayın. </li><li> Saç ıslak% 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> (Yaklaşık servikal lamina 1 omuriliğe maruz C1 fare arkasından saç ve cilt kaldırmak için keskin bir makas kullanın İnce) Sakral lamina 4 (S4) için. </li><li> Bir 10. bıçak ile bir neşter kullanarak, kas ve yağ ayırmak için omurganın sol ve sağ kesiler yapmak. Bu omurilik çıkarılması çok daha kolay hale getirecek. </li><li> opsiyonel: eğimli bir Luer rongeurs ilave etini kepçe için kullanılabilir. </li><li> Tırtıklı Graefe forseps ile omurilik vertebra üst tutarken, omurilik dokunmamaya dikkat ederek, yukarı C1 maruz omuriliğin içine kavisli tarafı titanyum kavisli Vannas makas yerleştirin. </li><li> Tüm yol sağa titanyum kavisli Vannas makas kaydırın ve bir küçük bir kesim yapmak. Küçük krizi sesi duydum ve makas omurları kesilerek olarak hissettim edilmelidir. Kablonun kadar sol tarafında bu kesim tekrarlayın. Çok hızlı gitmek veya bu makas ile kabloya zarar riski gibi bir kesim çok büyük yapmak için dikkatli olun. </li><li> Tek lamina omurları kenarları kesilir kez forseps ile kaldırılması gerekir. Rtutun ve omurilik vertebra geri çekmeye devam S4 kadar her tabakanın için bu adımı EPEAT. NOT: nakli sitesine kısmak kez nakli sitenin üstünde vertebra olasılıkla kapalı gelecektir. Sadece nakli sitesi altında başlayan prosedürü devam edin. </li><li> İsteğe bağlı: nakli site ve ölçü ve ~ nakli sitesine 20 mm rostral ve kaudal kesmek nerede görmek için aşağı omurga yatıyordu. NOT: Daha fazla genellikle 15 mm&#39;den daha öteye göç yok nakledilen NPC olarak ihtiyaç olmayacaktır NPC nakli. gerekli omurilik miktarı nakledilen hücre tipi deney ve göç özelliklerine bağlı olacaktır. Nakli sitesine eşit uzaklıkta olan rostral ve kaudal kesim yapma görüntüleme sırasında daha kolay bulunduğu için nakli sitesini sağlayacaktır. </li><li> # 11 bıçak ile bir neşter kullanılarak dikkatle sağda ganglionlar kesti ve rostral sonunda başlayan omurilik ventral tarafında sol. Bu ağırlıkhasta daha kolay ventral omurları kaldırılacak omuriliği etkinleştirin. NOT: Hızlı Bitti (1,7-1,11 adımları), spinal kord kurumasına olmayacaktır. Bununla birlikte, 1 x PBS nemli tutmak için kordon tatbik edilebilir. </li><li> Fareyi ters çevirin ve böylece omurilik aşağı bakacak fareyi tutun. Dikkatle kapalı dişli Graefe forseps kullanarak omuriliği dışarıda soyun. Omuriliği nicklemek olmadan, dikkatle omurilik tek sağlam bir parça dışarı kaldırdı izin vermek için kalan ganglionlar kesti. </li><li> Spinal kord RPMI-1640 olduğundan emin olun ve 2P mikroskop ulaşım için buz üzerine yerleştirin. </li></ol> Görüntüleme Omurilik 2. Hazırlık <ol><li> Agaroz omuriliği katıştırma <ol><li> Görüntü vermeden önce, buz üzerinde soğutulmuş, RPMI-1640 içinde ve izole spinal tutun. </li><li> Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı) tartıldı ve 1 x PBS, 5 ml% 5 solüsyon hazırlanır. Ag çözmek için 15 saniye için% 5 agaroz çözümü mikrodalgaortaya çıkan ve 37 ° C serin çözüm sağlar. </li><li> Ventral yüzü yukarı bakacak Parafilm bir levha üzerine yerleştirilerek omuriliği hazırlayın. </li><li> Pipet omurilik ventral yan üzerinde 5% agaroz çözeltisi, yaklaşık 5 mi. Agaroz, oda sıcaklığına kadar soğutma yoluyla katılaşır olsun. Tam katılaşma yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> 22 mm kare kapak kayma doku yapıştırıcı hafif bir kat uygulayın. </li><li> Parafilm ventral tarafı yerleştirerek, gömülü omuriliği ters çevirin. dorsal tarafı şimdi karşı karşıya olacak. Dorsal tarafına kapak kayma uyun ve yapıştırıcı katılaşmaya RMPI agaroz gömülü omurilik / kapak kayma hazırlık daldırın. Aşırı bir jilet kullanarak agaroz katılaşmış çıkarın. </li></ol></li><li> Mikroskop sahnede omuriliği Montaj <ol><li> Kapak kayma altına vazelin uygulayın. Bu perfüzyon sırasında hazırlık stabilize edecek. </li><li> Bir omurilik hazırlık yerleştirin25X daldırma hedefi doğru yukarı bakacak ventral yüzü mikroskop sahnede iyi görüntüleme. ısmarlama görüntüleme de yaklaşık 20 mm, 50 mm uzunluğunda derin ve karşısında 50 mm. </li><li> Resim oksijenli ısıtılmış ile hazırlanması (37 ° C) superfusing ise serumsuz (95: karbon dioksit karbojen: 5 oksijen), RPMI-1640 ortamı. <ol><li> Pre-sıcak su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar ortam ve ortam şişeye borunun sokulmasıyla boru pompasına bağlanır. </li><li> Bölmeye boru bağlantısı 37 ° C arasındaki bir ısıtıcı cihaz ile ortam sıcaklığı muhafaza edin. Superfuse ortam maddesi de yoluyla 3 mL / tüp pompası (Şekil 1B) bağlı bir hortum kullanılarak Min. </li></ol></li></ol></li></ol> Ventral Omurilik 3. 2P Görüntüleme <ol><li> Mikroskop Kurulum <ol><li> 900 nm ayarlı Sapphire lazer: Bir Chameleon Ultra Ti kullanarak Thy1-EYFP omurilik görüntüleri edinin. Lazer gücünü zayıflatır&lt;% 5 örnek minimum fototoksisite 16 sağlamak. Istikrarlı görüntüleme sağlamak için, ve doku sürüklenme ve hücresel hasarı önlemek için tek bir satır içi çözüm ısıtıcı kullanarak sabit 37 ° C&#39;de oksijen-perfüze RPMI-1640 perfüze sıcaklığını korumak. </li><li> EGFP ve EYFP floresan sinyalini ayırmak için, bilerek görünürlüğünü artırmak için yeşil emisyonu bölme, üç kanal içine 2P emisyon ayırmak için seri bir 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı yerleştirin. NOT: Bu kanal mavi-yeşil (emisyon &lt;520 nm), (520-560 nm), yeşil-sarı, kırmızı ve (emisyon&gt; 560 nm) olarak adlandırılır. Fotomultiplier tüpler her kanalda yayılan ışığın saptar. </li></ol></li><li> Ilgi yerlerinin görüntüleme alanları <ol><li> Mercek ve parlak bir alan ışık kaynağı kullanarak, bir referans noktası ayarlamak için omuriliğe ventral kenarında daldırma hedefi odak. </li><li> Emin ortam ışık kaynağı kapalı ve sw olunLazer deklanşörü açarak 2P uyarım kaşıntı. </li><li> Varsa ilgi alanları için doku ararken, son görüntüler satın alırken daha düşük bir çözünürlük ayarı, dijital zoom olmadan yüksek hacim ve yüksek tarama hızı kullanın. Ilgi bölge için doku arıyor bu sistem ile tipik ayarlar şunlardır: çözünürlük: 256 piksel; hacim: x = y 600 mikron = 600 mikron, z = 0-300 mikron. </li><li> Spinal kord ventral kenarında EYFP aksonlar gözlemleyin. Kolajen (mavi) ikinci harmonik sinyal omurilik dokusu kenarında parlak olacaktır. EYFP aksonlar sadece kolajen ikinci harmonik sinyal dorsal bulun ve EYFP sinyali yeşil-sarı kanalda görüntülenmiştir. </li><li> Omurilik hazırlama 14 uzunlamasına merkezi nakli sitesi bulun. EGFP-NPC nakli sonrası fareler 1 gün için, derin dokuya z düzleminde ışın yolunu odaklanarak nakli sitesini bulun. nakli sitesi will hayvanlar arasında biraz değişir ama genel olarak ventral kenarından ~ 200 mikron yer almaktadır. 1 gün sonra transplantasyonundan sonra farelerde ventral ve lateral kenarları daha yakın, beyaz madde yollarının EGFP-NPC kümeleri dikkate alınmalıdır. </li></ol></li><li> Nihai görüntüleri alınıyor <ol><li> 512 piksel görüntü çözünürlüğü Edinme; hacim: x = 270 y um, = 212 mikron ve z = 100 mikron kullanarak Slidebook 6 yazılımı. 2.5 mikron artışlarla sıralı odak uçakları alarak z-yığınları Derleme. </li><li> Spinal kord herhangi göç nesnelerin hızlı ölçümünü sağlamak için ofset uygun geçmeli ile çift yönlü tarama gerçekleştirin. Omurilik yaklaşık 1 kare / sn içinde ideal bir kazanım kare hızı hücresel hız belirlemek için emin olun. NOT: Görüntüleme ayarları, satın alma kare hızı, görüntüleme çözünürlüğü ve görüntüleme hacimleri gibi bireysel kullanıcı tercihlerine, değiştirilebilir. Büyük görüntüleme hacimleri genellikle GIV de kazanmak için daha uzun sürertr çözünürlük. </li><li> Böyle Bitplane Imaris 7.7 olarak görüntü analiz yazılımı ile kırpma, pürüzsüz, ve Pseudocolor Slidebook görüntü dosyaları, analiz. Slidebook ve Imaris bir otomatik işlem kullanarak ardışık görüntüleme birimleri penye nihai time-lapse videolar üretmek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+model+of+MS:+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment.">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li><li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis:+the+role+of+cell+transplantation.">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li><li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li><li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination.">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li><li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li><li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li><li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis.">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination.">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status.">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).</li><li>Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+3.">Ch. 3.</a> Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).</li><li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1,+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li><li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+CXCL12+(SDF-1alpha)+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis:+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein.">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus.">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834 (2011).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca(2+)+imaging.">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826 (2013).</li><li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development.">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22 (2014).</li><li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li><li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system.">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li><li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+the+immune+system.">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance.">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li><li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy.">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).</li></ol>

The authors have no competing interests.

Gerçek zamanlı sağlam doku 2P görüntüleme demiyelinize fare omuriliğe nakli sonrası NPC kinetik ve etkileşimleri araştırmak için gereklidir. Intravital 2P görüntüleme yaygın yaşayan farelerde omurilik dorsal tarafında hücresel dinamikleri belirlemek için kullanılır, ve hastalık 17-19 demiyelinizan dorsal demiyelinizasyonu incelemek için kullanılır olmuştur. Transplant NPC 2P mikroskopi kullanılarak yerinde görüntüye çok derin yatıyor ventral beyaz cevher, göç Ancak, bir ex vivo hazırlık gereklidir. Bu metodoloji hasarlı ve hasarsız omurilik 6 nakledilen NPC motilite ve remiyelinizasyon kinetiği belirlemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Ex vivo hazırlıkları sadece uzunlamasına omurilik taranmasını sağlamak değil, aynı zamanda enine ventral yüzü 6,20 den . Bu T hücre hareketi farklılıklar (hız ve yön) ve etkileşimlerin analizine izin verirtransplant alanının bitişik ve transplant alanının 6 çeşitli mesafelerde ransplant Alanı. Başlangıçta, omurilik ventral tarafında EGFP-NPC nakledilen görüntüye bu hazırlığı tasarlanmış ise, bu görüntüye kullanılabilecek herhangi bir floresan etiketli ventral, dorsal boyalı hücre veya yan yüzler omurilik yönünü değiştirerek monte. Intravital görüntüleme üzerinden bu hazırlık Faydaları ventral yüzü görüntüleme sağlayan ve hala tekrarlanan ameliyatlar 19,21 olmadan birden fazla görüntüleme oturumları için izin bir &#39;cam pencere&#39; kurulumu kullanarak yeni intravital hazırlıkları ile gerekli anesthetization ve sağkalım ameliyat gereksinimini, eksik dahil . Bu omurilik kaldırılır beri intravital görüntüleme ile birlikte &#39;cam pencere&#39; yaklaşımı ile karşılaştırıldığında bu prosedürün bir sınırlama, tek bir fare birden fazla kez puan elde edememek olduğunu belirtmek gerekir ve fare ötenazi. 2P görüntüleme ideal dokulara 22,23 tek hücre dinamiklerini çözülmesi için uygundur. 2P uyarma az fototoksisite derin doku görüntüleme uzun süre izin yakın kızılötesi fotonları kullanır. 2P uyarma fluorofor iki foton aynı anda emilimi üzerine oluşur. 2P uyarılması için gerekli olan foton yüksek konsantrasyonu, tek bir odak düzleminde 2P, lazer çıkışının uzay-zaman sıkıştırma ile elde edilir. Bu daha odak düzlemi dışında omurilik bölgelerinde fototoksisite en aza indirerek, odak noktasına floresan uyarma kısıtlar. Yakın-Kızılötesi fotonlar da yaklaşık 300 mikron omurilik 16 ventral tarafında kadar görüntüleme sağlayan, saçılma azalttı. Herhangi bir yeni tekniği ile olduğu gibi, ancak, Eksplante omurilik 2P görüntüleme akılda tutulmalıdır sınırlamaları vardır. Bu görüntüleme protokolü 520 nm Dichro kullanırgenellikle mavi ışık için ayrılmış floresan kanala eGFP emisyonunu aktarma ile eGFP ve EYFP floresan ayrılmasını sağlayan ic ayna. Omurilikteki kollajen tarafından oluşturulan ikinci harmonik üretimi de mavi kanal görünür, ancak yeşil-sarı kanal olarak tanımlanabilir bu hazırlık ölçüde parlak ve onların emisyon bir kısmını sahip eGFP etiketli hücrelerin kolayca ayırt edilir kollajen değil. Kanal harmanlama ve spesifik dichroics kullanan bir emisyon spektrumları farklı kısımlarının ayrılması Bu teknik genellikle yakın ya da hemen hemen üst üste emisyon spektrumu ile tek tek florofor görsel ya da otomatik tanımlanması için yararlıdır. Fototoksisite Bu 2P görüntüleme protokolü başka bir sınırlama olduğunu. Tek bir görüntüleme hacmi içinde Hücreler fototoksisite duyarlı; Bu nedenle, Deneyciler fototoksisite belirtileri hevesle farkında olmalıdır. Fototoksisite tipik olarak azaltılması veya hücre olmaması ilk belirgindirmotilite, lokal dokularda ve / veya morfolojik değişiklikler ışıkla ağartma eklenmiştir. Çeşitli faktörler doku fototoksisite giden veya canlı hücre görüntüleme için uygun hale getirerek zarar verebilir. Bu perfüze RPMI-1640 lazer gücü ve sıcaklık ve oksijen izlemek için çok önemlidir. Aşırı germe veya omurilik bası olmadan ve bıçaklar ile omuriliği kesmeden fare spinal kord uygun kaldırılmasını sağlamak için de zorunludur. Gerei Eğer on saat sonrası çıkarma hiçbir azalma ile birlikte ventral spinal kord içinde sağlam hücresel hareketlilik tarafından belirlendiği gibi, eksplante omurilik hazırlık, en fazla on saat boyunca canlı kalacaktır. Ekstre dokusunun çeşitli yaygın uzun uzunlukları için görüntülü ve 23-26 canlı kabul edilir. Bu nedenle, tek bir omurilik dokusu içinde birden çok bölgede hücresel dinamiklerinin ölçümü mümkündür. Son olarak, not edilmelidir ki hücreler tha büyük çoğunluğut floresan (doğal autofluorescent sürece) bu hazırlık tarafından görüntülenmiştir olmayacak etiketli değildir, ve bu etiketli hücreleri diğer etiketsiz, görünüşte görünmez endojen hücreler ve yapısal elemanların karmaşık bir çevre ile etkileşim kabul etmek önemlidir.

Deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve neuroadapted fare hepatit virüsü (Geminin) ile intrakranial enfeksiyon dahil demiyelinizasyon Fare modelleri, moleküler yollar ve hastalıkla ilişkili hücresel etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Onlar yol ve FDA etkinliği ağırlıklı olarak otoimmünite ve inflamasyon 1 durması hedefleyen, ilaç tedavileri kabul desteklemiştir. Endojen remiyelinizasyon başarısız sonra, ancak, şu anda onaylanan terapiler, etkili bir şekilde, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybetmiş lezyonlar, onarım yapmaz. Bu nedenle, hastalığın bu aşamada onarım odaklı tedaviler kronik semptomlar ve yaşam kalitesinin iyileştirilmesi giderilmesi için kritik öneme sahiptir. Son zamanlarda, nöral öncü hücreler (NPC) inflamasyon ve demiyelinizasyon alanları hedef potansiyel rejeneratif tedavi yöntemi olarak ön plana çıkmıştır. Çeşitli çalışmalar, endogeno indükleme NPC yeteneğini ortaya çıkarmıştırBize remiyelinizasyon ve remiyelinizasyon 2-8 doğrudan katılmak. NPC doğrudan remiyelinizasyon dahil Çünkü, bu nakli sonrası endojen hücreler ile kinetik ve etkileşimleri anlamak şarttır. Transplantasyon sonrası, NPC sonra rostrally ve nakli sitesine 5,9 kaudal göreli beyaz cevher hasarı alanları ile ventral göç. göç kinetik çevresel uyaranlara yanıt olarak farklılık; Olmayan bir hasar omuriliğe nakledilen NPC hasarlı omurilik 6 nakledilen NPC daha büyük hızlara sahip. Bir göç süre sonra, bir sağlıklı omurilik 6 bozuk bir omurilik nispetle daha yüksek bir hızda, NPC yaygın olarak çoğalırlar transfer edilir. Son olarak, NPC çoğunluğu oligodentrositlere farklılaştırmak ve doğrudan remiyelinizasyon 4,6,9 başlatmak. miyelin kaybetmiş lezyon karmaşıktır ve çeşitli aşamalarında bir hücre, farklı popülasyon ihtiva edebilirctivation. Örneğin, bir aktif multipl skleroz (MS), lezyon aktive edilmiş T hücreleri, M1, mikroglia ve M1 makrofajlar, ancak kronik sessiz MS lezyon temel olarak birkaç enflamatuar hücreler 10-13 ile reaktif astrositler içerebilir önemli bir nüfus içerebilir. Çünkü efektör hücrelerin çeşitliliği, demiyelinizasyon fare modellerinde iki-foton (2P) görüntüleme lezyon içinde yerel hücresel etkileşimleri anlamak için son derece yararlı bir araçtır. MS ve birçok yaygın olarak kullanılan MS araştırma modellerinde, lezyonların çoğunluğu nedeniyle lezyon derinliği ve omurilik yüksek yağ içeriği omurilik, intravital 2P görüntüleme erişilemez bir bölge ventral tarafında yer almaktadır. Ventral spinal kord boyunca lezyonlarında bu konuları ve çalışma hücre-hücre etkileşimleri aşmak için biz ex vivo 2P görüntüleme hazırlık 6 basit geliştirdik. Bu çalışma gösterdi Önceki yöntemler yayın, takipMHV kaynaklı demiyelinasyon 14 JHMV suşu ardından fare omuriliğe gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) -expressing NPC nakli için prosedür. Beş haftalık fareler JHMV ile enfekte ve gün 14 sonrası enfeksiyon torakal seviyede 9&#39;da eGFP-NPC ile nakledilen. Burada sunulan protokol bir ex vivo agaroz hazırlık yapmak, omuriliği ayıklamak ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) -expressing akson görüntü nakledilen eGFP-NPC etkileşimleri konusunda ayrıntılı adımları sağlar. Nöronal spesifik Thy1 promotörün kontrolü altında EYFP sentezleyen Fareler Bu prosedür 15 kullanılmıştır. Sadece akson bazı bireysel aksonlar görüntüleme için yararlı hale EYFP ifade eder. Burada 7 gün transplantasyon sonrası çıkarılmış omurilikleri göstermektedir; Bununla birlikte, omurilik transplantasyonundan sonra herhangi bir zaman noktasında elde edilebilir. Zarar görmüş aksonlar NPC etkileşimlerini gösterirken, protokol genetik floresan işaretler ile kombinasyon halinde de kullanılabilirdiğer hücre türleri fare omurilik oluşan hücresel etkileşimler çok sayıda araştırmak.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fine scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>sharp</td></tr><tr><td>scalpel blade #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>scalpel handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agarose, low gelling temperature</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (tissue adhesive)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm square cover slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X dipping objective, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Single inline solution heater</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm single-edge dichroic beam splitter</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>photomultiplier tubes</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L variable-speed tubing pump</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>digital thermometer</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Çıkarılan omurilik görüntüleme protokolü omurilik içinde herhangi bir floresan görselleştirmek için kullanılabilir iken, bizim temsilcisi sonuçları EYFP-akson ile eGFP-NPC etkileşimleri göstermek. Öncelikle, biz Şekil 1A gömülü ventral spinal kord hazırlanmasını göstermektedir. Sonra, Şekil 1B 2P mikroskop kurulum ve anahtar bileşenleri göstermektedir. 2 ventral spinal kord içinde bir tek z-yığın içinde eGFP ve EYFP floresan gösterir Şekil. Ardışık z-yığınlarının kazanılması sağlam doku içindeki gerçek zamanlı hücresel dinamikleri analiz etmek time-lapse videolar üretmek için derlenmiş olabilir. 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı kullanarak, protokol belirtildiği gibi, EGFP ve EYFP sinyalini ayırabilirsiniz. Bireysel kanallar yeşil ve sarı kullanarak görüntüleme yazılımı yalancı olabilir. 80 / 52580fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: Omurilik ve mikroskop kurulumu. (A) (sol)% 5 agaroz jel gömülü bir spinal kord ve aşırı agaroz (sağda) çıkarılmasının ardından bir lamel üzerine monte edilmiş. (B) işaretli anahtar bileşenleri ile mikroskop kurulum bir görüntü. 1. Su banyosu 37 ° C olarak belirlenmiştir. 2. RPMI-1640 Ön ısıtıldı. 3. C / L değişken hızlı boru Pompası. 4. Tek satır içi çözüm ısıtıcı. 5. Daldırma hedefi. 6. Dijital termometre. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52580/52580fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52580/52580fig2.jpg" /> Şekil 2: Örnek 2P görüntü ventral spinal kord içinde edinilen bulaşmamış, olmayan hasarlı (A) ventral tarafında ve JHMV-enfekte, demiyelinize (B) omuriliğin 3D rekonstrüksiyon.EGFP-etiketli NPC ile Thy1-EYFP fare aşağıdaki nakli gelen. Floresan-etiketli aksonlar sarı yalancı ve NPC yeşil yalancı edilir. Görüntü çözünürlüğü: 512 piksel; görüntü hacmi: (a) X = 239 um, y 259 um, 65 um 26 Z-yığınları kullanılarak inşa z = kullanılarak 2.5 birbirinden um ve X = 497 um, y = 389 um, z = 127.5 um inşa (B) aralıklı = 51 z-yığınları 2.5 mikron aralıklı.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.2K Görüntüleme.  University of California, Irvine.  Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir. 

Video: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Biyomühendislik

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler