AFは欧州共同体の第7次フレームワーク·プログラムの下での欧州研究評議会から始まる助成金によってサポートされていました（FP7 / 2007年から2013年）/ ERCグラント契約がn 203413を°、複雑なsystems.HAバイオハイブリッドとAIのためのミネルヴァセンターがサポートされていますダリアとダン·メイダンフェローシップによるエルサレムのヘブライ大学で高度な学位学生のため。

1.ペプチドアレイの設計<ol><li>一部は10〜20残基の重複ペプチドへの標的タンパク質の配列を分割する。具体的な実験と行うラボのリソースにオーバーラップの量を変化させるが、原理的にはより長いオーバーラップがより良い。ペプチドを設計する場合の相互作用を担当することができるタンパク質の二次構造要素を知ら考慮する。 </li><li>商業ベンダーを通じて設計されたペプチドアレイを注文。ここでは、共有結合C末端を通じてアレイに結合したペプチドを使用しています。 </li></ol> 2.非特異的結合をブロック<ol><li> NaClで0.05％のTween 20（TBST / PBST）を含む50mMトリスまたはリン酸緩衝液を作り、（正確なイオン強度を知るために）のHClまたはNaOHの測定量で所望のpHに調整し、所望のイオン強度。ここでは、7.5のpHおよび150mMのイオン強度を使用しています。 </li><li>ブロッキング溶液を作っ2.5％（w / vの）をTBST / PBST中脱脂粉乳。 </li><li>非特異的結合を防ぐために、ブロッキング溶液5mlにアレイを浸す。室温または一晩シェーカー上で4ºCで2〜4時間の配列をインキュベートする。 </li></ol> 3.タンパク質とインキュベート<ol><li>室温でシェーカー上で5分間5ミリリットルTBST / PBSTで二回、次に30秒間ブロッキング溶液と5mlで最初の配列を洗ってください。 </li><li> （w / v）の非特異的結合を防ぐために、脱脂粉乳、2.5％を含有するHisタグ化タンパク質溶液5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。ここでは、説明したブロッキング溶液中に溶解したタンパク質溶液の4.5μM（STIL 500〜650）を使用します。 NOTE：通常5-10μMタンパク質は（スクリーニングに使用されるが、タンパク質濃度は、結合親和性及びアレイで結合したペプチドの局所濃度に依存して、2-3μMでさえ低くすることができる効率合成）。バッファ内のタンパク質変化するが、上記と同じブロッキング溶液を用いてタンパク質を希釈することが一般的であることができ溶解する。 </li><li>室温または一晩、4ºCで3-8時間、タンパク質溶液中の配列をインキュベートする。 </li></ol> 4.抗体とインキュベート<ol><li> 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。 </li><li>室温でシェーカー上で1時間、ブロッキング溶液と同じ濃度で同じ成分を含有するインキュベーション緩衝液中で：希釈したHRP結合抗体（1,500 1）5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。抗体が標的タンパク質またはタグのいずれかを結合することができる。 </li><li>セントせずに同じプロトコルを繰り返すことにより、アレイは、標的タンパク質（ 例えば 、オリゴマー化のための研究）からのペプチドが含まれている場合は特に、アレイ上のペプチドと抗体との相互作用を試験する対照実験を行うp 3が、タンパク質と共にインキュベートする。 </li><li> 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。 </li></ol> 5.アレイを読む<ol><li> ECLウエスタンブロッティング基質キットで化学発光開発を行う。 </li><li>発光画像解析装置で検出を行う。 </li><li>結果を分析します。アレイ上の両方の重複が同じシグナルを示すので、結果は信頼性があることを確認してください。タンパク質パートナーの構造がわかっている場合、結合ペプチドのための構造上の検索および結合部位を探します。遠くの順序で並んでいても、ペプチドは、三次構造に一緒に近くなるとの結合部位を作成することができます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ペプチドアレイスクリーニングは、そのパートナーで標的タンパク質の結合部位を同定するための優れたツールである。このアッセイは、実行するために迅速かつ容易であり、結果は、1つまたは2つの営業日で得ることができる。ペプチドアレイスクリーニングは汎用性があり、多くの目的に使用することができる。これは、リン酸化などの翻訳後の修飾を特徴付けるし、キナーゼの基質を同定するために使用することができる。例えば：骨髄性白血病急性する関連するFLT3キナーゼ、ペプチドアレイ6をスクリーニングすることにより発見さチロシン含有基質ペプチドをリン酸化する。チロシンキナーゼ阻害剤パゾパニブおよびラパチニブの阻害特性は、23のスクリーニングのペプチドアレイを用いて試験した。ペプチド配列は、タンパク質 - タンパク質相互作用を媒介する部位を同定するために使用することができる。この方法を使用して私たちの研究室で研究このようなタンパク質の例は：HIV-1 Vifタンパク質と細胞A3Gタンパク質間の相互作用は、私たちを特徴付けたペプチドアレイ24る。ペプチドアレイスクリーニングは、プロアポトーシスタンパク質ASPP2 25と抗アポトーシスBCL-2ファミリーの相互作用を研究し、ミトコンドリアタンパク質MTCH2 26と、tBIDを、BCL-2ファミリーのメンバーの結合を研究するために使用した。ミオシンIICドメイン間の分子内相互作用は、27のスクリーニングのペプチドアレイを用いて分析した。ここで我々はSTIL-CHFR相互作用、増殖および癌14における重要なタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する部位を同定するためのスクリーニングペプチドアレイを使用する方法の例を提示する。正確な結合部位を明らかにすることに研究の相互作用の阻害剤の合理的設計のための基礎として役立つことができる。 ペプチドアレイスクリーニングは、定量アッセイはない。アレイ上の各スポット中のペプチドの量は、合成収率およびペプチドの純度の違いにより変化するので、それは半定量的である。これは、次にPEPTに依存IDEシーケンス、長さなど収率および純度のばらつきも偽陰性または偽陽性の結果を時々つながることができます。同じアレイ内の強度の比較は、半定量的順位付けをもたらすことができる。しかし、同じ配列を持つ異なるアレイまたは異なる実験間のこのような比較は信頼できません。結合を定量するために、ペプチド配列のスクリーニングにおいて見出さペプチドが等のようなアッセイである蛍光異方性、等温滴定熱量測定（ITC）、表面プラズモン共鳴（SPR）などの生物物理学的方法を用いて、標的タンパク質の結合のために合成し、試験されるべきである彼らはそのような結合を検出するために、タンパク質の高濃度を必要とするので弱い結合に常に敏感ではない。ペプチドアレイスクリーニングは、一方で、弱い結合に非常に敏感である。したがって、アレイのスクリーニングにおいて観察相互作用のいくつかは、蛍光anisotなどの方法を用いて観察または定量化することができなかった<html> 14粘着性。ペプチドアレイのスクリーニングアッセイの高い感度と組み合わせたタンパク質の非常に低い濃度を必要とするという事実は、ペプチド配列の類似性の広い範囲のタンパク質 - ペプチド相互作用をスクリーニングするための有用な方法を作る。 偽陰性結果はまた、線状ペプチドが適切タンパク質における結合部位の三次元構造を表していない可能性があるという事実によるものであることができる。しかし、これはうまくペプチドによって表され本質的に無秩序タンパク質、の問題ではありません。偽陽性の結果は、アレイへの抗体の結合によって引き起こされ得る。これらのプロトコルセクション4.3で説明したように対照実験を行うことによって検出することができる。抗体によって認識されるタンパク質エピトープは、ペプチド配列に結合した際、未露光になった場合に偽陰性結果を得ることもできる。この問題は一般的ではないが、タンパク質に対するポリクローナル抗体を使用することによって解決することができる。 jove_contentは&quot;&gt;ペプチドアレイスクリーニングはまた、アラニンスキャンとSAR 7を研究するなど、リードペプチドを向上させるために使用することができる。標的の結合部位が既知であるならば、その配列に基づいて配列がそれぞれの交換を含む複数の修飾を設計することができるアラニン（Alaのスキャン）に残留物が相互作用のための重要な残基を同定することができる。同様に、SAR試験は結合ペプチドの異なる特性を変更することによって行うことができる。これらは、ペプチドの長さを変化させることに対応するDにより残基を置換することが含まれる - アミノ酸などの非天然アミノ酸によるメチル化、グリコシル化、交換などの他の修飾を含む。このような修飾されたペプチドは、全ての標的配列に基づいて、一つの配列に基づいて合成することができ、1つ高速かつ簡単実験において、標的タンパク質の結合についてスクリーニング、潜在的な阻害剤を改善し、相互作用の分子機構を理解するための豊富な情報を提供する。 <p class=「jove_contentは &quot;&gt;のペプチド配列をスクリーニングするための方法論は、非常に柔軟であり、必要に応じてプロトコルの変更を適用することができる。例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはスクロースなどのミルク以外の他のブロッキング化合物を使用することができる。非特異的結合が観察された場合、ミルク/ BSA /スクロースより高い濃度を使用すべきである。タンパク質は、任意の所望の緩衝液中のアレイと共にインキュベートすることができるが、それはバッファミルク/ BSA /スクロースまたは非特異的結合を防ぐために、ブロッキング溶液中で使用される任意の他のブロッカーに追加することが重要である。タンパク質濃度は比較的低いままでなければならず、強い結合も3-5μMタンパク質で観察することができる。すべてのステップでのインキュベーションのボリューム（、タンパク質または抗体と洗浄とのインキュベーションを遮断する）は、完全に配列をカバーするのに十分であるべきである。通常4〜5ミリリットルで十分です。一次抗体が検出されない場合に二次抗体を使用することができる。この場合、図6及び図7は、希釈およびインキュベーション時間で繰り返されるべきであるステップそれは、特定の二次抗体にフィット。検出手順は、抗体に依存します。このプロトコールに記載されているように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート抗体は、化学発光が一般に使用される。別の選択肢は、蛍光または電気化学発光4などの異なる抗体のために使用することができる。本明細書中に記載されるペプチド配列は、単一の使用のためのものであり、再利用することができない。 ここで紹介するプロトコルは、ペプチドアレイの広い有用性を実証する。正しく設計された配列を使用して、2つのタンパク質間の結合部位を詳細に特定することができる。結合部位が十分に特徴付けされたら、それは、関連するタンパク質 - タンパク質相互作用を阻害するための薬物の標的部位として使用することができる。アレイスクリーニングで発見結合ペプチドに基づいて、阻害小分子は、薬物リー​​ドとして設計され、スクリーニングされ得る。

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生細胞内のプロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、タンパク質相互作用を研究するための優れたツールとして役立つ。ペプチドは容易に合成され、一方、他方の1,2-高スループット様式での複数のタンパク質標的上の特定の相互作用部位に焦点を可能にすることができるからである。ペプチドアレイスクリーニングは、短時間3に多数のパートナーと標的タンパク質との相互作用に関する大量のデータを得るための方法を実行するのは簡単、高速で。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出し、分析するための他の生化学的または生物物理学的方法とは異なり、ペプチドアレイスクリーニングは、タンパク質の非常に低い濃度を必要とし、非常に弱い結合を検出することができる。ペプチド配列は、酵素活性6と高スループットを研究する抗体エピトープ5を特徴付ける、そのようなタンパク質-タンパク質または受容体-リガンド相互作用部位4、ホモまたはヘテロオリゴマー化インターフェースのマッピングのようなペプチド-タンパク質相互作用の多くの用途に使用することができる構造-活性関係（SAR）は7を研究。ペプチドアレイのスクリーニングについての詳細なレビューについてはカッツらを参照してください。4 ペプチドアレイのいくつかのタイプは、現在存在している。固体支持体にそれらを取り付ける前に、ペプチドの合成、または固体支持体上に直接ペプチドの合成は主に、SPOT技術の4,8を使用して、：ペプチドアレイを作製するための2つの主要な合成戦略があります。ザ·ペプチドは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）化学8、通常、固体支持体上で合成される。一般的な合成スキームの中でC末端を介してペプチドのN末端 ​​を介してアタッチメント（ 例えば、JPTのpepstarアレイ9）およびペプチドアタッチメントがある（ 例えば、PEPSCANのpepchipアレイ10、JPTのペプスポットアレイ9とINTAVISのcelluspotアレイ11）4。固体支持体は変わるので、それへのペプチド結合の化学を行いますことができます。システイン-末端ペプチドは、チオール基12を介してスライドガラスに付着させることができる。ペプチドのN末端 ​​に共有結合したアミノ酸のエステル化セルロース膜上のヒドロキシル基に結合することができる8を取り付け。 ここでは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法として、ペプチドアレイをスクリーニングするための詳細なプロトコールを提示する。私たちが使用する配列は、大規模なAMOを含むマイクロアレイであるCelluspots配列ですスライドガラスでサポートされている小さなセルロース膜上にスポット（最大384スポットの重複）のUNT。これは、低タンパク質のボリュームと抗体と協力し、一回の実験あたりのデータのかなりの量を得ることができます。この配列はまた、低親和性結合の検出を可能にする高いペプチド密度が含まれています。アレイは、正常な細胞増殖13を制御するために非常に重要であるSTIL、CHFRの相互作用をマッピングするために使用した。 2つのタンパク質間の制御されない相互作用が癌の発生につながる可能性がある。この相互作用をマッピングすることによって、私たちは、特定の結合部位を発見し、残基14を結合。これは、このタンパク質 - タンパク質相互作用を阻害する阻害剤の合理的設計のための道を開く。

<table><tbody><tr><td>Peptide array</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Antibody (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological industries</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 camera&amp;nbsp;</td><td>FUJI film</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

タンパク質 - タンパク質相互作用は、生物の生きている細胞および対照恒常性プロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、ペプチドを容易に合成することができるので、タンパク質相互作用を研究し、特定の相互作用部位に焦点を可能にするための優れたツールを提供。ペプチドアレイは、2つのタンパク質間の相互作用部位の同定、ならびに治療目的のために、標的タンパク質に結合するペプチドのスクリーニングを可能にする。彼らはまた、高スループットのSAR研究を可能にします。結合部位の同定のため、typi校正ペプチドアレイは、通常、部分的に、所望の標的タンパク質の1つまたは複数のパートナータンパク質の完全な配列に由来する10〜20残基の重複ペプチドが含まれています。標的タンパク質を結合するためのアレイをスクリーニングするタンパク質の少量のみを使用して簡単かつ迅速な方法では、パートナータンパク質における結合部位に対応し、結合ペプチドを明らかにする。 この記事では、標的タンパク質とそのパートナーの間の相互作用部位をマッピングするためのペプチド配列をスクリーニングするためのプロトコルを記述します。ペプチドアレイを考慮し、それらの二次構造をとるパートナータンパク質の配列に基づいて設計されている。このプロトコルで使用されるアレイは、INTAVISバイオ分析·インスツルメンツによって調製しCelluspots配列だった。アレイは、非特異的結合した後、勉強タンパク質とインキュベートを防ぐためにブロックされます。抗体を用いた検出は、タンパク質間の特定の相互作用部位に対応する結合ペプチドを明らかにする。

STILは非常に重要な中心体タンパク質である。 19 -これは、正常な細胞分裂および細胞増殖13,15を制御する。 STILいくつかのタンパク質18,20,21と相互作用し、相互作用の大部分は、本質的に無秩序領域（IDR）14は 、その中央部を介して起こる。私たちは、STIL結合タンパク質CHFR由来のペプチドで構成される配列を設計しました。 CHFR応力22を有糸分裂に応答して誘導される腫瘍抑制因子である。 CHFRのSTIL結合ドメインの構造は時に不明であったため、プロトコルのステップ1.1で説明したように、私たちは、7残基の重複を有する15残基の長さのペプチドにタンパク質ドメインを分割。上記のプロトコルで詳述し、 図1に示すように、我々は、CHFR、STILの結合部位を同定するためのスクリーニングペプチドアレイを行った、我々は提供することができる二重に384のペプチドから成るINTAVIS Celluspotアレイを使用<html> 図2に示されたように大量の情報。私たちはその結合タンパク質CHFR（ 図3）にSTILの結合部位を発見し、このペプチドアレイを使用する。配列内の各黒点はSTILをバインドCHFR由来のペプチドを表します。結果の信頼性を検証する、それが重複して存在するため、各ペプチドが二回表示されることに注意してください。 STILとCHFRの間の相互作用は、以前にタンパク質レベル13,14で実証された。ペプチドアレイスクリーニングはSTIL IDR、残基500〜650（ 図3、Amartely ら 14）に結合した7 CHFR由来ペプチドを明らかにした。これらの結果は、私たちはCHFR上STILの結合部位をマッピングすることができました。 CHFR一次配列上のこれらの7のペプチドの距離にもかかわらず、彼らは（ 図4）14 CHFRにおけるSTILのための明確に定義された結合部位を作成します。 <html> 7 / 52097fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1：ペプチドアレイスクリーニングのスキーム A-部分的に考慮し、その二次構造をとる、一つ以上のパートナータンパク質に由来するオーバーラッピングペプチドからなるペプチド配列を設計する;。標的タンパク質とインキュベートB-。検出用抗体とインキュベートC-。 D-検出は、（化学発光、蛍光等により行うことができる）。タンパク質結合部位を明らかにするために、結果を分析し、E-。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig2highres.jpg" /> 図2：ペプチドアレイスクリーニングの例検出は化学発光を使用して達成スライドが重複として二つの同一の配列が含まれています。ES / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig3highres.jpg" /> 図3：CHFRタンパク質にSTIL IDRの結合のためのペプチド配列をスクリーニングは：4.5μMのHisタグSTIL 500から650は、配列を結合するためにスクリーニングした。各黒点はSTIL断片とCHFR由来ペプチド14との間の結合を示している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52097/52097fig4highres.jpg" /> 図4：CHFRのCysリッチドメインの構造に示さCHFRにおけるSTIL結合部位（残基424から661、PDB ID：2XPO）7。ペプチドアレイスクリーニングにおいてSTILを結合した​​ペプチドは、一次配列に離れているが、1つの結合部位を作成する3D構造で一緒に閉じピンク、オレンジ、赤色に3つの領域に分割することができる。このフル領域はダイマーCHFR 14におけるSTILのための結合ポケットを形成している。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52097/52097fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K ビュー.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ビデオ: Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

生化学

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

免疫・感染学

<meta charset="utf8"></head><body>タンパク質-タンパク質結合界面のアミノ酸選好の予測

Computational Prediction of Amino Acid Preferences of Potentially Multispecific Peptide-Binding Domains Involved in Protein-Protein Interactions

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the recognition of linear motifs with variable conservation. The combination of highly conserved and more variable regions in the same ligands often contributes to the multispecificity of binding, a common property of enzymes and cell signaling proteins. Characterization of amino acid preferences of peptide-binding domains is important for the design of mediators of protein-protein interactions (PPIs). Computational methods are an efficient alternative to the often costly and cumbersome experimental techniques, enabling the design of potential mediators that can be later validated in downstream experiments. Here, we described a methodology using the Pepspec application of the Rosetta molecular modeling package to predict the amino acid preferences of peptide-binding domains. This methodology is useful when the structure of the receptor protein and the nature of the peptide ligand are both known or can be inferred. The methodology starts with a well-characterized anchor from the ligand, which is extended by randomly adding amino acid residues. The binding affinity of peptides generated this way is then evaluated by flexible-backbone peptide docking in order to select the peptides with the best predicted binding scores. These peptides are then used to calculate amino acid preferences and to optionally compute a position-weight matrix (PWM) that can be used in further studies. To illustrate the application of this methodology, we used the interaction between subunits of human interferon regulatory factor 5 (IRF5), previously known to be multispecific but globally guided by a short conserved motif called pLxIS. The estimated amino acid preferences were consistent with previous knowledge about the IRF5 binding surface. Positions occupied by phosphorylatable serine residues exhibited a high frequency of aspartate and glutamate, likely because their negatively charged side chains are similar to phosphoserine.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:多重特異性タンパク質間相互作用におけるアミノ酸選好を解読するための計算アプローチ

We describe a methodology based on sequence diversification to estimate the amino acid preferences of multispecific binding sites in protein-protein interactions (PPIs). In this strategy, thousands of potential peptide ligands are generated and screened in silico, thus overcoming some limitations of available experimental methods.

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

Many protein-protein interactions involve the binding of short protein segments to peptide-binding domains. Usually, such interactions require the ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants. Low affinity interactions can be preserved through the use of less-stringent buffer conditions and remain readily identifiable. This protocol discusses the labeling of tissue culture cells with stable isotope labeled amino acids, transfection and immunoprecipitation of an affinity tagged protein of interest, followed by the preparation for submission to a mass spectrometry facility. This protocol then discusses how to analyze and interpret the data returned from the mass spectrometer in order to identify cellular partners interacting with a protein of interest. As an example this technique is applied to identify proteins binding to the eukaryotic translation initiation factors: eIF4AI and eIF4AII.

SILAC immunoprecipitation experiments represent a powerful means for discovering novel protein:protein interactions. By allowing the accurate relative quantification of protein abundance in both control and test samples, true interactions may be easily distinguished from experimental contaminants, and low affinity interactions preserved through use of less-stringent buffer conditions.

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

生物学

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

要約

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ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロアレイ技術

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

要約

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ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

タンパク質間相互作用に関与する潜在的に多重特異的なペプチド結合ドメインのアミノ酸選好の計算予測

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロアレイ技術