Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
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This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1. general Tripanosoma Ganadería <ol><li> Pesar sólidos para la preparación de medios SDM79 (Tabla 1). </li><li> Almacenar a 4 ° C en 50 ml cónico o una bolsa Ziploc. NOTA: Los reactivos son estables durante al menos 6 meses. </li><li> Descongelar el suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 37 ° C, y mezclar periódicamente por inversión. NOTA: FBS se recibe del proveedor como una solución estéril. Filtro esterilización FBS reduce su capacidad para apoyar el crecimiento del parásito. </li><li> Una vez que la botella entera se descongela, el calor inactiva suero durante 30 min en un baño de agua a 56 ° C, mezclando periódicamente para minimizar la precipitación de los componentes del suero. </li><li> Descongelar penicilina / solución de estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml en NaOH 50 mM), y la solución de vitamina medio basal de Eagle a temperatura ambiente. </li><li> Para unos 1000 ml probeta graduada, añadir 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabla 1) a los componentes líquidos (Tabla 2) y mezclar bien en una placa de agitación. </li><li> Ajustar el pH a 7,35, y llevar el volumen a 850 ml con agua. </li><li> Filtrar esterilizar medios por conectar una manguera de vacío a la parte inferior de una botella de filtro. Aplicar vacío hasta que se filtra la solución. </li><li> Retire la parte superior del filtro en la cabina de bioseguridad y añadir 150 ml de FBS inactivado por calor. Quite cubierta de plástico de la tapa y la botella estéril de medios de sellado. </li><li> Preparar medios SDM80 de la misma manera como SDM79 con las siguientes excepciones; no agregue la glucosa o la glucosamina y utilizar MEM sin glutamina. En lugar de 150 ml de FBS inactivado por calor, añadir 135 ml de dializado, FBS inactivado por calor, y 15 ml de FBS inactivado por calor. </li><li> Cultura parásitos PCF en 25 cm 2 matraz con 10 ml de medio apropiado a 27 ° C y 5% de CO 2. Nota: Las celdas deben contarse todos los días usando un hemocitómetro o un citómetro de flujo (ver sección 6) y las culturas deben mantenerse en densidades entre 1 x 10 5 y 5 x 10 6 células / ml. </li></ol> 2. Transfection de PCF parásitos con el constructo indicador fluorescente NOTA: Para seguir glicosoma dinámica, una proteína indicadora que contiene la secuencia de dirección peroxisomal (PTS2) de aldolasa fusionado a la proteína fluorescente amarilla mejorada se expresa en los parásitos. La secuencia que codifica la proteína de fusión se clonó en pXS2bla 12, que contiene el promotor procyclin y las regiones intergénicas de tubulina, que la recombinación homóloga directa en el genoma y el gen de resistencia a blasticidina para la selección. Líneas celulares que albergan procíclico los genes que codifican la polimerasa y la tetraciclina represor T7 (PF29-13) se transforman con la construcción de la orientación, pXS2: PTS2eYFP. <ol><li> Preparar citomix mezclando los componentes enumerados en la Tabla 3. Filtro esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Linealizar el ADN plásmido con MluI pipeteando 10 l de ADN (1 mg / l), 5 l de tampón de enzima de restricción, agua 33 l, y 2 μ; L de enzima MluI en un tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hr. </li><li> Purifica la digestión de restricción mediante la adición de 1 volumen de tampón de unión a la enzima de digestión de restricción. Mezclar tampón de unión y el ADN digerido mediante agitación con vórtex. Centrifugar brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del tubo. </li><li> Inserte un ADN vinculante columna en un tubo de recogida de 2 ml, y la transferencia de ADN digerido / solución tampón a la columna de unión. </li><li> Centrifugar para 10.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, desechar el tubo de recogida de filtrado y devolver la columna para el tubo de recogida. </li><li> Añadir 700 l de tampón de lavado SPW y se centrifuga a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Descartar filtrado de tubo de recogida, de regreso a la columna del tubo de recogida y repetir SPW etapa de lavado y centrifugación. </li><li> Descartar filtrado, la columna de retorno a tubo de recogida, y se centrifuga la columna de vacío durante 3 min a 10.000 xg para eliminar el etanol residual. </li><li> En un gabinete de bioseguridad, deseche coltubo de recolección y la columna a cabo en un tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Para eluir el ADN, añadir 25 l de agua estéril a la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Añadir otros 25 l de agua estéril en la campana de bioseguridad a la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Se centrifuga a 10.000 xg velocidad durante 1 min. </li><li> En una cabina de bioseguridad transferir la totalidad de volumen de ADN a un tubo nuevo de microcentrífuga estéril. NOTA: Este paso evita la contaminación de la tapa abierta durante la centrifugación. </li><li> Añadir la,, el ADN linealizado estéril purificada (10 g) a 400 l de Cytomix esterilizada por filtración. </li><li> Contar las células como se describe en la sección 6 y cosechar 5 7 -10 8 x10 células por centrifugación a 800 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 450 l de ADN + citomix usando un 1 ml pipeta serológica. </li><li> Solución de transferencia que contiene ce<html> LLS, ADN, y Cytomix a una cubeta de 4 mm brecha y lugar cubeta estéril en la cámara de electroporación. </li><li> Seleccione &quot;decaimiento exponencial&quot; e introduzca manualmente los siguientes parámetros: Voltaje: 1,5 kV, la capacitancia: 25 mF, Resistencia: Ω, y la cubeta: 4 mm. Prensa pulso. Una vez que el pulso es completa, Sacar la cubeta de la cámara de electroporación y volver a la cabina de bioseguridad. </li><li> En un nuevo frasco estéril, una pipeta 10 ml de SDM79. Transferencia de las células transformadas al matraz con 10 ml de SDM79. </li><li> Incubar sin selección de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO 2. Después de 24 horas, añadir G418 (15 mg / ml), higromicina (50 g / ml), y blasticidina (10 g / ml). Pase 1 ml de células transformadas con el fármaco en 9 ml de SDM79 con el fármaco. </li><li> Analizar las células diaria como se describe en las secciones 6 y 7 Cuando las células son fluorescentes, y han alcanzado una densidad celular de 1 x 10 7 / ml, hacer estabilizados para almacenamiento a largo plazo (3.1 a 3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Hacer estabilizados <ol><li> Para hacer que la congelación de los medios de comunicación, añadir un volumen igual de glicerol al 100% a Cytomix y el filtro de esterilizar. </li><li> Añadir 200 l de los medios de congelación a 800 l de células (1 x 10 7) en un criovial, mezclar suavemente por inversión y el lugar entre dos bastidores de espuma de poliestireno y congelar a -80 ° C. </li><li> Una vez congelado (~ 24 horas), las células de transferencia a nitrógeno líquido. NOTA: Es importante mover celdas en LN 2 después de 24 horas, como un almacenamiento más prolongado a -80 ° C conduce a una disminución de la viabilidad celular. </li></ol> 4. Existencias descongelar <ol><li> Eliminar vial congelado de -80 ° C y descongelación a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min. </li><li> Pipetear 9 ml de SDM79 con drogas en un nuevo frasco estéril. Añadir las células descongeladas a este frasco. Pasar las células 1:10 añadiendo 1 ml de este cultivo a 9 ml de SDM79 en un nuevo matraz (concentración final de 1 x 10 5 / ml). </li><li> Antes de que las células alcanzan una densidad de 10 7 / ml, comience a establecer citómetroy ensayos de dilución. </li></ol> 5. citómetro de configuración <ol><li> Encienda el citómetro de flujo y abrir el programa CFlow Plus. NOTA: Antes de ejecutar cualquier muestra, los fluidos deben ser toma retroactiva y enjuagarse de acuerdo a los pasos 5.2 a 5.7. </li><li> Vuelva a colocar el tubo de agua nanopura en la que la SIP se almacena con un tubo vacío. </li><li> Seleccione el botón de &quot;autolimpieza&quot;. </li><li> Una vez que toma retroactiva, retire el tubo de microcentrífuga de sorbo y descarte. </li><li> Colocar un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de agua nueva nanopura en el SIP. </li><li> Seleccione un nuevo pozo en el programa CFlow. En &quot;Límites Run&quot; establecer el tiempo de 2 min. En &quot;Fluidics&quot; seleccione &quot;rápida&quot; y &quot;Run&quot;. </li><li> Una vez que el límite de tiempo de 2 min se haya completado, haga clic en el botón &quot;Eliminar datos de ejemplo&quot;. </li></ol> 6. Recuento celular utilizando el citómetro de flujo <ol><li> Reemplazar el agua con la muestra a ser contado. Ajuste &quot;Límites Run &quot;a 30 seg,&quot; Fluidics &quot;a&quot; rápida &quot;y seleccione&quot; Ejecutar &quot;. </li><li> Después de que el límite de tiempo de 30 segundos es completa, CFlow además proporcionará los eventos / l en &quot;Última ejecución.&quot; Conteo de repetición para cada cultura. NOTA: Antes de células alcanzan 1 x 10 7 células / ml, proceder con el ensayo de dilución. Las células deben ser descontinuados después de completar un ensayo de dilución. Las células cultivadas durante períodos más largos pierden su capacidad de responder a las condiciones ambientales. </li></ol> 7. midiendo la fluorescencia usando el citómetro de flujo <ol><li> Para evaluar la fluorescencia, establecer &quot;límites Run&quot; a 10.000 eventos, y &quot;Fluidics&quot; a &quot;lentas&quot;. Seleccione &quot;umbral de Ajuste&quot;. En &quot;umbral básico&quot;, seleccione &quot;Permanentemente eliminar eventos en&quot;, &quot;FSC-H&quot; (en caja de abajo) y entrar a menos de 30.000. Haga clic en &quot;Aplicar&quot;, luego en &quot;Cerrar&quot;. </li><li> Seleccione el220; &quot;botón en una de las nuevas ventanas de trazado y seleccione&quot; Histograma FSC-A &quot;Desde la lista desplegable, seleccione&quot; FL1-A &quot;. NOTA: medidas FL1-A fluorescencia en la longitud de onda de 530 nm. </li><li> Seleccione &quot;Ejecutar&quot; y repita para todas las culturas. </li><li> Ejecutar la solución de limpieza a través de la línea de fluidos durante 2 min y el agua durante 2 min. </li></ol> 8. dilución ensayos <ol><li> Pasar las células a una densidad de 1 x 10 5 células / ml en 3 ml de SDM79 en un matraz de 25 cm 2 cultura y medir fluorescencia inmediatamente después del paso y luego a 3 hr y 24 hr. </li></ol> Análisis de datos 9. <ol><li> Seleccione &quot;Analyze&quot; pestaña en CFlow Plus. </li><li> Haga clic aparecerá el botón &quot;Histograma&quot; en &quot;Hacer una nueva parcela&quot;. Seleccione &quot;FSC-A&quot; y una lista desplegable. Seleccione el canal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Resalte un bien de analizar. Seleccione el botón &quot;Gate&quot;, y dibujar manualmente una puertapara la población de interés. </li><li> Flow Plus proporcionará celular &quot;Count&quot; dentro de esta puerta y &quot;% de esta trama&quot;. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Glycosomes son, orgánulos específicos del parásito esenciales y dinámicos. Los procesos que regulan la biogénesis, mantenimiento, proliferación y remodelación de estos orgánulos probable incluyen objetivos farmacológicos que podrían ser explotadas con fines terapéuticos. A pesar de la posibilidad de alta abundancia de tales objetivos farmacológicos, el campo de glicosoma biogénesis se ha quedado atrás el estudio de procesos similares en otros organismos, principalmente debido a la falta de un sistema de alto rendimiento manejable por el cual, para supervisar, respuestas orgánulos dinámicos rápidos en células vivas. Los sistemas indicadores fluorescentes orgánulo se han utilizado para estudiar la dinámica de orgánulos en eucariotas superiores tales como levaduras, plantas, hongos y mamíferos 23-25. Hemos generado una cepa transgénica de parásitos PCF que expresan PTS2eYFP que está dirigida a madurar glycosomes, produciendo orgánulos fluorescentes. Los cambios en la composición glicosoma pueden ser monitoreados a través siguiente fluorescencia celular. Utilizando este sistema, se ha encontrado que las condiciones ambientales, en particular de glucosa, regulan glicosoma composición 12. En contraste a la microscopía métodos utilizados a menudo para estudiar la dinámica de orgánulos en kinetoplastid parásitos, este sistema reportero ofrece un método por el cual para cribar rápidamente compuestos y condiciones que influyen en la dinámica general glicosoma. Sin embargo, los cambios en la fluorescencia reflejan cambios en las composiciones generales de orgánulos. Se necesitan más experimentos bioquímicos y microscópicos para definir las diferencias moleculares específicas entre las poblaciones de células que presentan diferentes intensidades de fluorescencia. Hemos identificado una serie de pasos críticos en los ensayos de remodelación. Curiosamente, hemos encontrado que a medida que las células se cultivan durante períodos más largos (más de dos pasadas), su comportamiento en respuesta a los cambios ambientales es impredecible. Después del cultivo prolongado, las células pasan de altas densidades en m frescaedia, exhiben un aumento temporal de la población tenue, lo que indica que todavía son capaces de remodelar glycosomes, pero mueren después de 24 horas. También nos hemos encontrado con situaciones en las que no se observe una remodelación. La razón de este comportamiento está clara, pero se ha encontrado que cuando las células se tratan como se describe aquí (limitando el número de pases celulares a dos y mantener los cultivos por debajo de 1 x 10 7 / ml), glicosoma remodelación es reproducible. Cuando las células ya no son sensibles a las condiciones ambientales, retransformar las células con el plásmido reportero constructo generalmente remedios a esta situación. Si bien este sistema ha sido utilizado para estudiar el comportamiento glicosoma en tripanosomas africanos, también puede ser adoptada para el estudio de los orgánulos en otros parásitos mediante la fusión de las proteínas fluorescentes a secuencias de aminoácidos que la proteína de localización directa a otros compartimentos celulares.

Trypanosoma brucei causa la enfermedad del sueño africana en los seres humanos y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino. Los fármacos utilizados en el tratamiento de estas enfermedades son anticuadas y extremadamente tóxico, las vacunas no están disponibles, y el potencial para el desarrollo de resistencia a los medicamentos requiere la búsqueda de nuevas dianas farmacológicas 1. Durante su ciclo de vida, T. brucei, se alterna entre un insecto vector y hospedador mamífero; dos hosts que se presentan muy diferentes entornos en los que el parásito tiene que sobrevivir. Una serie de cambios metabólicos y morfológicos se producen como el parásito está expuesto a diferentes condiciones ambientales. Algunos de los cambios más dramáticos se observan en parásitos microcuerpos específicos de una sola membrana limitada, denominada glycosomes 13. Los niveles de glucosa son relativamente altos (~ 5 mm) en el torrente sanguíneo y parásitos en el torrente sanguíneo (BSF) generan ATP exclusivamente a través de wh glucólisisile metabolismo mitocondrial es reprimida 14. A diferencia de otros eucariotas en el que la glucólisis se produce en el citoplasma, T. brucei compartimenta mayoría de las enzimas glucolíticas en glycosomes 14,15. Los parásitos son absorbidos por la mosca tsetsé durante una harina de sangre y experimentan una caída en la glucosa, que cae a niveles indetectables en los 15 minutos de ser ingerido por la mosca. El metabolismo de los insectos, la forma procíclica (PCF), parásitos es más flexible y glucosa, así como aminoácidos tales como prolina, se pueden utilizar en la síntesis de ATP 16-18. Estudios proteómicos comparativos revelan cambios de ciclo de vida que dependen en glicosomal y proteínas mitocondriales con proteínas glucolíticos aumento en los parásitos del torrente sanguíneo y proteínas mitocondriales implicadas en el ciclo TCA y la cadena respiratoria 13,19. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias entre BSF y glycosomes PCF, se sabe poco sobre los cambios en glycosomes PCF que se producen en respuesta a envcambios ironmental. En el intestino grueso de la marcha, los niveles de glucosa son bajos con aumentos transitorios durante una alimentación 20. En la mayoría de los estudios in vitro, los parásitos PCF se cultivan en medios que contienen glucosa. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los cambios del metabolismo PCF significativamente en respuesta a glucosa disponibilidad 17. En ausencia de glucosa, la captación de prolina y prolina aumento de la actividad deshidrogenasa 18. Este cambio en el metabolismo mitocondrial es probable que acompañado por un cambio en la composición y la morfología glicosoma, sin embargo, esto no ha sido evaluado directamente. Electron y microscopía de fluorescencia se utilizan técnicas comunes para estudiar la dinámica glicosoma en T. brucei 2,21-24. Estos protocolos son el tiempo y mano de obra intensiva, caro, y difícil de adaptar a los estudios en tiempo real y protocolos de alto rendimiento. Para superar esta limitación, un sistema indicador fluorescente u orgánulosed para estudiar orgánulos en los sistemas de mamíferos y levaduras se ha modificado para su uso en T. brucei 12. Sistemas de indicador fluorescente orgánulos se han utilizado ampliamente en eucariotas superiores tales como levadura, planta, y células de mamífero 25-27. En tales sistemas, una proteína fluorescente se fusiona a una secuencia de aminoácidos que se dirige a la proteína a orgánulos específicos. La degradación o síntesis de las proteínas específicas se mide a través de la fluorescencia y los cambios en la composición del orgánulo se reflejan en cambios en la fluorescencia celular. Cuando la fase de lectura abierta de la proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) se fusiona con una secuencia focalización peroxisomal tipo II (PTS2) 12, la proteína PTS2eYFP se importa a, glycosomes maduros-importación competente y de fluorescencia pueden ser monitoreados mediante citometría de flujo. Las variaciones en la composición glicosoma se reflejan en cambios en la fluorescencia celular. Este sistema puede ayudar a resolving los mecanismos que regulan los cambios inducidos por el medio ambiente en glicosoma composición. Este manuscrito describe la generación de un sistema reportero glicosoma en los parásitos PCF en conjunción con la citometría de flujo para controlar la dinámica de glicosoma en tiempo real en parásitos vivos y proporciona un ejemplo de cómo se ha utilizado para seguir los cambios en glicosoma composición en respuesta a diferentes entornos. En resumen, glicosoma composición está influenciada por las concentraciones de glucosa extracelular y paso de cultivos en fase logarítmica en medio fresco provoca cambios en glicosoma composición. Este sistema puede ser modificado para estudiar el comportamiento dinámico de otros orgánulos en tripanosomas y otros parásitos.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA purifiation</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosome transformation</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosome transformation</td></tr></tbody></table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei es un parásito kinetoplastid que causa tripanosomiasis humana africana (THA), o enfermedad del sueño, y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino 1. Los suplentes de parásitos entre el torrente sanguíneo del huésped mamífero y el vector de la mosca tsetsé. La composición de muchos orgánulos celulares cambia en respuesta a las diferentes condiciones extracelulares 2-5. Glycosomes son los peroxisomas altamente especializados en los que muchas de las enzimas que intervienen en la glucólisis son compartimentados. Cambios en la composición glicosoma de una manera regulada en el desarrollo y el medio ambiente 4-11. Actualmente, las técnicas más comunes que se utilizan para estudiar glicosoma dinámica es la microscopía electrónica y de fluorescencia; técnicas que son caros, tiempo y mano de obra intensiva, y no adaptarse fácilmente a los análisis de alto rendimiento. Para superar estas limitaciones, un sistema indicador fluorescente en glicosomaque mejoró la proteína fluorescente amarilla (eYFP) se fusiona a una secuencia de peroxisomas focalización (PTS2), que dirige la proteína de fusión a glycosomes 12, se ha establecido. Sobre la importación de la proteína de fusión PTS2eYFP, glycosomes vuelven fluorescentes. Orgánulos la degradación y los resultados de reciclaje en la pérdida de la fluorescencia que puede ser medido por citometría de flujo. Un gran número de células (5000 células / seg) se pueden analizar en tiempo real sin extensa preparación de la muestra tales como la fijación y el montaje. Este método ofrece una forma rápida de detectar cambios en la composición orgánulo en respuesta a las fluctuaciones de las condiciones ambientales.

En este sistema, se observó un cambio dependiente de la glucosa en glicosoma composición. Cuando las células se cultivan en medios que contienen glucosa, se observaron dos poblaciones; uno brillante y una tenue (Figura 2A). Células Dim albergan glycosomes inmaduras, que no han importado la PTS2eYFP mientras que las células brillantes albergan una mezcla de glycosomes maduros e inmaduros 12. Cuando la glucosa está presente en los medios de comunicación, mislocalization de glicosoma proteínas es letal 15,28 y glicosoma expresión de la proteína es probable que acopla estrechamente con la importación. Esta regulación estricta es responsable de la aparición de células oscuras en la que glicosoma expresión de la proteína se suprime cuando las células carecen de la capacidad de importación suficiente. Una vez que la maquinaria glicosoma importación está totalmente montado y funcional, las células expresan glicosoma proteínas, que luego se importan a glycosomes, produciendo células fluorescentes. En los medios de comunicación-glucosa agotan, la deslocalización de glicosoma proteínas es tolerard 15, y la distribución de la población bimodal se sustituye por un único pico con una gama más amplia de la fluorescencia (Figura 2B). Este sistema se ha utilizado para identificar las condiciones que desencadenan cambios en glicosoma composición. Cuando los cultivos de alta densidad que contienen ~ 10% de células DIM (Figura 3A) se pasan en medio fresco, hay un aumento transitorio en el porcentaje de células DIM (Figura 3B). Por 24 horas. la distribución de la población original se restablece (Figura 3C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 Sólidos </td><td > Peso (g / l) </td></tr><tr ><td > Graces célula de insecto polvo Los medios de </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Glucosa </td><td> 1 </td></tr><tr ><td > HEPES </td><td> 8 </td></tr><tr ><td > MOPS </td><td> 5 </td></tr><tr ><td > NaHCO3 </sub&gt; </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Piruvato de sodio </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-Alanina </td><td> 0,2 </td></tr><tr ><td > L-Arginina </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-Glutamina </td><td> 0.3 </td></tr><tr ><td > L-Methonine </td><td> 0.07 </td></tr><tr ><td > L-fenilalanina </td><td> 0.08 </td></tr><tr ><td > L-prolina </td><td> 0,6 </td></tr><tr ><td > L-serina </td><td> 0.06 </td></tr><tr ><td > L-Taurina </td><td> 0,16 </td></tr><tr ><td > L-Treonina </td><td> 0.35 </td></tr><tr ><td > L-tirosina </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > La adenosina </td><td> 0.01 </td></tr><tr ><td > Guanosina </td><td> 0.01 </td></tr><tr ><td > Glucosamina HCl </td><td> 0.05 </td></tr><tr ><td > El ácido fólico </td><td> 0.004 </td></tr><tr ><td > ácido r-aminobenzoico </td><td> 0.002 </td></tr><tr ><td > Biotina </td&gt; <td> 0.0002 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. SDM79 componentes sólidos. Componentes de medios sólidos y la cantidad (g / l) se proporcionan. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 </td><td ></td></tr><tr ><td > MEM con glutamina </td><td > 600 ml </td></tr><tr ><td > Pen / Strep </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > Solución de vitamina BME </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > MEM solución de aminoácidos </td><td > 8 ml </td></tr><tr ><td > Solución de aminoácido no esencial MEM </td><td > 6 ml </td></tr><tr ><td > Hemin </td><td> 3,75 </td></tr><tr ><td > Agua </td><td > 162,25 ml </td></tr></tbody></table> Se dan Tabla 2. SDM79 componentes líquidos. Volúmenes ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td ><strong&gt; Cytomix </td><td > Durante 20 ml </td></tr><tr ><td > 120 mM KCl </td><td > 1,4 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 0,15 mM CaCl 2 </td><td > 3 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 10 mM K 2 HPO 4 </td><td > 400 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > 25 mM HEPES </td><td > 500 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > EDTA 2 mM </td><td > 80 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > 5 mM MgCl2 </td><td > 100 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > Agua </td><td> 16.52 </td></tr></tbody></table> Tabla 3. receta Cytomix. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig1highres.jpg" /> Figura 1. reportero sistema glicosoma fluorescente. A) la integración construcción de expresión PTS2eYFP. Tripanosomas PCF se transformaron con el pXS2PTS2eYFP plásmido linealizado con la enzima de restricción MluI. Este constructo se integra mediante recombinación homóloga en el locus tubulina (Tub) y las secuencias de PARP (PARP) incluye el promotor que conduce la expresión constitutiva de PTS2eYFP y las secuencias requeridas para el procesamiento de ARN. B) PTS2eYFP de importación. PTS2eYFP se sintetiza en el citoplasma donde se une el receptor soluble, PEX7, que entrega la proteína indicadora para los glycosomes. Una vez entregado a la membrana glicosoma, la proteína ha sido importada. Orgánulos maduros contienen maquinaria de importación PTS2eYFP importación y de fluorescencia, mientras que los que no contienen maquinaria de importación funcional siguen siendo tenue. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig2highres.jpg" /> Figura 2.-glucosa dependiente glicosoma composición. PCF células fueron cultivadas en SDM79 (+ Glc) o SDM80 (-Glc) yanalizada por citometría de flujo. Histogramas de 10.000 eventos. A) análisis de las células cultivadas en SDM79 revela consistentemente dos picos. Células fluorescentes albergan una mezcla de orgánulos maduros e inmaduros con células de la intensidad de fluorescencia superiores que tienen glycosomes más maduros. En SDM79, mislocalization de glicosoma proteínas es letal y glicosoma expresión de proteínas y de importación debe ser estrechamente controlada. Esto se refleja en la ausencia de células con intensidades de fluorescencia intermedios. B) En SDM80, la deslocalización de glicosoma proteínas se tolera, la distribución de la población bimodal se pierde, y se observan las células de fluorescencia intermedia. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig3highres.jpg" /> Figura 3. glicosoma remodelación. Remodelación de glycosomes es provocada por el paso en medio fresco. <strong&gt; A) Histograma de 10.000 eventos en el cultivo de partida (~ 4 x 10 6 / ml). B) 3 horas después de la dilución en SDM79 fresco hay un aumento en la proporción de células con dim glycosomes inmaduros que caen dentro de la puerta izquierda C ) Histograma del cultivo diluido después de 24 horas. Después de 24 horas, la distribución de la población ha vuelto a la normalidad, como los glycosomes inmaduros ahora contienen las proteínas de peroxisomas necesarios para importar la proteína fluorescente.

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Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K vistas.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

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The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

El uso de diacetato de carboxifluoresceína Ester succinimidil (CFSE) para controlar la proliferación de linfocitos

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Biología

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Desarrollo de un sensor basado en pHluorin2 para el pH glusómico en Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor destacado: Avances en el monitoreo del pH glusómico en Trypanosoma brucei usando el biosensor pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

Resumen

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Capítulos en este video

El uso de diacetato de carboxifluoresceína Ester succinimidil (CFSE) para controlar la proliferación de linfocitos

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

El uso de

Imágenes de bioluminiscencia para detectar la infección en fase tardía de la tripanosomiasis africana

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo

Medición de los cambios dinámicos del pH glusómico en el Trypanosoma brucei vivo