Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
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This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1. Allgemeine Trypanosom Haltung <ol><li> Wiegen Feststoffe zur Herstellung SDM79 Medien (Tabelle 1). </li><li> Lagerung bei 4 ° C in 50 ml konischen oder einem Plastikbeutel. HINWEIS: Die Reagenzien sind für mindestens 6 Monate stabil. </li><li> Auftau fötalem Rinderserum (FBS) in einem 37 ° C Wasserbad und periodisch mischen durch Umkehrung. HINWEIS: FBS wird vom Lieferanten als sterile Lösung erhalten. Filtersterilisieren FBS verringert seine Fähigkeit, das Wachstum des Parasiten zu unterstützen. </li><li> Sobald die gesamte Flasche aufgetaut, Hitze inaktiviert Serum für 30 min in einem 56 ° C Wasserbad, periodisch Mischen, um eine Ausfällung von Serumkomponenten zu minimieren. </li><li> Tauwetter Penicillin / Streptomycin-Lösung (Pen / Strep), Hämin (2 mg / ml in 50 mM NaOH) und Grundmedium Adler Vitamin-Lösung bei Raumtemperatur. </li><li> Um einen 1.000 ml-Messzylinder, fügen 20,2 g SDM79 Feststoffe (Tabelle 1) mit den flüssigen Komponenten (Tabelle 2) und gut mischen auf einer Rührplatte. </li><li> PH-Wert auf 7,35 und das Volumen auf 850 ml mit Wasser. </li><li> Filter sterilisieren Medien, indem ein Vakuumschlauch an der Unterseite des Filterflasche. Ziehe Vakuum bis die Lösung filtriert. </li><li> Filter entfernen oben in der biologischen Sicherheitsschrank und fügen Sie 150 ml hitzeinaktiviertem FBS. Kunststoffabdeckung entfernen aus sterilen Kappe und Dichtung Medien Flasche. </li><li> Vorbereitung SDM80 Medien in der gleichen Weise wie SDM79 mit folgenden Ausnahmen; nicht Glucose oder Glucosamin hinzufügen und MEM ohne Glutamin. Anstelle von 150 ml hitzeinaktiviertem FBS, fügen Sie 135 ml dialysiert, Hitze inaktiviert FBS und 15 ml hitzeinaktiviertem FBS. </li><li> Kultur PCF Parasiten in 25 cm 2-Kolben mit 10 ml geeigneten Medium bei 27 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Zellen sollten täglich mit einer Zählkammer und mit einem Durchflusszytometer gezählt werden (siehe Abschnitt 6) und Kulturen sind bei Dichten zwischen 1 x 10 5 und 5 x 10 6 Zellen / ml gehalten werden. </li></ol> 2. Transfection von PCF Parasiten mit dem fluoreszierenden Reporterkonstrukt HINWEIS: Um glycosome Dynamik zu folgen, ein Reporterprotein, das die peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) von Aldolase zu mehr gelb fluoreszierenden Protein fusioniert ist in den Parasiten ausgedrückt. Die Sequenz für das Fusionsprotein kodiert, in pXS2bla 12, die den procyclin Promotor und die Tubulin intergenen Regionen, die direkt homologe Rekombination in das Genom und die Blasticin Resistenzgen zur Selektion enthält, kloniert. Prozyklischen Zelllinien, die Gene beherbergen, die T7-Polymerase und Tetracyclin-Repressor (PF29-13) kodieren, sind mit dem Targeting-Konstrukt, pXS2 verwandelt: PTS2eYFP. <ol><li> Bereiten cytomix durch Mischen der in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren und lagern bei RT. </li><li> Linearisieren von Plasmid-DNA mit MluI durch Pipettieren von 10 ul DNA (1 ug / ul), 5 ul Restriktionsenzym-Puffer, 33 ul Wasser und 2 μL MluI Enzyms in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Reinige den Restriktionsverdau durch Zugabe von 1 Volumen von Bindungspuffer zu dem Restriktionsenzym-Verdau. Mischen Bindungspuffer und verdauten DNA durch Verwirbelung. Kurz zentrifugieren, um die Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Legen Sie eine DNA-bindende Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen, und Übertragung verdaute DNA / Bindungspufferlösung Spalte. </li><li> Zentrifuge für 10.000 g für 1 min. Nach der Zentrifugation verworfen Filtrat von Sammelröhrchen und gibt die Spalte an die Sammelröhrchen. </li><li> Fügen Sie 700 ul Waschpuffer SPW und Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min. </li><li> Verwerfen Filtrat von Sammelröhrchen, kehren die Spalte an die Sammelröhrchen und wiederholen SPW Waschschritt und Zentrifugieren. </li><li> Verwerfen Filtrat, Rück Spalte Sammelröhrchen und Zentrifuge leere Spalte für 3 min bei 10.000 × g Rest Ethanol zu entfernen. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank, wegwerfen colwahl Rohr und Ort Spalte in einem sterilen Reaktionsgefäß. </li><li> Zur Elution der DNA, fügen Sie 25 ul sterilem Wasser auf Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. Zentrifugieren bei 10000 × g für 1 min. </li><li> Fügen Sie weitere 25 ul sterilem Wasser in biologischen Sicherheit Haube Spalte und bei Raumtemperatur für 2 min. </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min. </li><li> In einer biologischen Sicherheitsschrank übertragen gesamte Volumen der DNA auf eine neue sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Dieser Schritt verhindert die Kontamination von der offenen Deckel während der Zentrifugation. </li><li> Hinzufügen des sterilen, gereinigt linearisierte DNA (10 ug) in 400 ul sterilfiltriert cytomix. </li><li> Zählen von Zellen, wie in Abschnitt 6 durch Zentrifugation bei 800 g für 15 min bei RT beschrieben und ernten 5 x10 7 -10 8 Zellen. </li><li> Überstand abgießen und Zellpellet in 450 ul DNA + cytomix mit einer 1 ml serologische Pipette. </li><li> Transfer-Lösung enthält ce<html> lls, DNA und cytomix in ein steriles Abstand von 4 mm Küvette und Ort in der Küvette Elektroporationskammer. </li><li> Wählen Sie &quot;exponentiellen Abfall&quot; und geben Sie manuell die folgenden Einstellungen: Spannung: 1,5 kV, Kapazität: 25 mF, Widerstand: Ω und Küvette: 4 mm. Drücken Puls. Sobald der Impuls beendet ist, entfernen Küvette aus dem Elektroporationskammer und zum Biosicherheitswerkbank. </li><li> In eine neue sterile Flasche, Pipette 10 ml SDM79. Übertragen der transformierten Zellen in den Kolben mit 10 ml SDM79. </li><li> Inkubieren ohne Arzneimittel Selektion für 24 h bei 27 ° C, 5% CO 2. Nach 24 Stunden hinzu G418 (15 ug / ml), Hygromycin (50 ug / ml) und Blasticidin (10 ug / ml). Pass 1 ml transformierten Zellen mit Drogen in 9 ml SDM79 mit Drogen. </li><li> Analysieren Sie die Zellen täglich, wie in Abschnitt 6 und 7. Wenn Zellen fluoreszierende sind beschrieben und haben eine Zelldichte von 1 x 10 7 / ml erreicht, stellen stabilates für die Langzeitspeicherung (3.1-3.3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Erstellen Stabilates <ol><li> Um das Einfrieren Medien, ein gleiches Volumen von 100% Glycerin zu cytomix und Filter sterilisieren. </li><li> Geben Sie 200 ul des Einfrierens Medien bis 800 ul von Zellen (1 x 10 7) in einem Kryoröhrchen, vorsichtig mischen und Inversion zwischen zwei Styropor-Racks und frieren bei -80 ° C. </li><li> Einmal gefroren (~ 24 h), Transfer Zellen in flüssigen Stickstoff. HINWEIS: Es ist wichtig, Zellen in LN 2 nach 24 h bei -80 bewegen, wie eine längere Lagerung ° C führt zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 4. Auftauen Aktien <ol><li> Entfernen gefrorenen Ampulle von -80 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur für etwa 10 min. </li><li> Pipette 9 ml SDM79 mit Drogen in eine neue sterile Flasche. Fügen Sie aufgetauten Zellen zu diesen Kolben. Geben Zellen 1:10 Zugabe von 1 ml dieser Kultur in 9 ml SDM79 in einen neuen Kolben (Endkonzentration von 1 x 10 5 / ml). </li><li> Bevor die Zellen eine Dichte von 10 7 / ml erreichen, beginnen Durchflusszytometer eingestelltund Verdünnungsanalysen. </li></ol> 5. Durchflusszytometer-Setup <ol><li> Schalten Sie das Durchflusszytometer und CFlow Plus-Programm zu öffnen. HINWEIS: Bevor Sie irgendwelche Proben sollten die Fluidik gemäß den Schritten 5,2-5,7 rückgespült und ausgespült werden. </li><li> Ersetzen Sie den Schlauch von Nanopure Wasser, in dem die SIP ist mit einem Leerrohr gespeichert. </li><li> Wählen Sie die &quot;Rückspülung&quot;-Taste. </li><li> Nach Rückspülung abgeschlossen ist, entfernen Mikrozentrifugenröhrchen von Schluck und entsorgen. </li><li> Legen Sie eine neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml neuen nanoreinem Wasser auf dem Schluck. </li><li> Wählen Sie einen neuen Brunnen in CFlow Programm. Unter &quot;Ausführen Limits&quot; eingestellte Zeit für 2 min. Unter &quot;Fluidtechnik&quot; wählen Sie &quot;schnell&quot; und &quot;Ausführen&quot;. </li><li> Sobald die 2 min Frist abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Löschen Beispieldaten&quot;. </li></ol> 6. Zellzählung mit dem Durchflusszytometer <ol><li> Wasser zu ersetzen mit der Probe, die gezählt werden. Set &quot;Führen Limits &quot;bis 30 Sekunden&quot;, Fluidik &quot;auf&quot; schnell &quot;und wählen Sie dann&quot; Ausführen &quot;. </li><li> Nach Ablauf der 30 Sekunden Frist abgeschlossen ist, CFlow Plus wird die Ereignisse / ul unter &quot;Last Run&quot;. Zahl für jede Kultur Wiederholen bieten. HINWEIS: Bevor Zellen erreichen 1 x 10 7 Zellen / ml, fahren Sie mit Verdünnungsanalyse. Zellen sollten nicht fort nach einer Verdünnungsanalyse abgeschlossen ist. Zellen für längere Zeiträume kultiviert verlieren ihre Fähigkeit, sich an Umweltbedingungen zu reagieren. </li></ol> 7. Messung der Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer <ol><li> , Um die Fluoreszenz zu beurteilen, setzen Sie &quot;Run Limits&quot; zu 10.000 Ereignisse und &quot;Fluidtechnik&quot; auf &quot;langsam&quot;. Wählen Sie &quot;Schwelle&quot;. Unter &quot;Primary Threshold&quot;, wählen Sie &quot;dauerhaft zu beseitigen Veranstaltungen&quot;, &quot;FSC-H&quot; (in Drop-Down-Box) und geben Sie weniger als 30.000. Klicken Sie auf &quot;Übernehmen&quot; und dann auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Wählen Sie die220; Histogramm &quot;-Taste in einem der neuen Plot-Fenster und wählen Sie&quot; FSC-A &quot;aus der Dropdown-Liste, wählen Sie&quot; FL1-A &quot;. HINWEIS: FL1-A Maßnahmen Fluoreszenz in der 530 nm Wellenlänge. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; und wiederholen Sie für alle Kulturen. </li><li> Führen Sie die Reinigungslösung durch die Fluidik Linie für 2 Minuten und Wasser für 2 min. </li></ol> 8. Verdünnungsanalysen <ol><li> Geben Zellen auf eine Dichte von 1 x 10 5 Zellen / ml in 3 ml SDM79 in einer 25 cm 2 Kulturflasche und Messen Fluoreszenz unmittelbar nach Durchgang und dann 3 Stunden und 24 Stunden. </li></ol> 9. Datenanalyse <ol><li> Wählen Sie &quot;Analysieren&quot; Vorsprung auf CFlow Plus an. </li><li> Klicken Sie wird &quot;Histogramm&quot; unter &quot;Machen Sie eine neue Handlung.&quot; Wählen einer Dropdown-Liste &quot;FSC-A&quot; und erscheinen. Wählen Sie den Kanal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Markieren Sie eine gut zu analysieren. Wählen Sie &quot;Gate&quot;-Taste und manuell zeichnen eine Gate-für die Bevölkerung von Interesse. </li><li> Flow Plus liefert Zelle &quot;Count&quot; in diesem Tor und &quot;% dieser Plot&quot;. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem eine schnelle, dynamische Organell verzögerten Antworten überwacht, in lebenden Zellen. Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme verwendet worden, um Organelle Dynamik in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen, Pilzen und Säugern 23-25 ​​untersuchen. Wir haben einen Stamm von transgenen Parasiten, die PCF PTS2eYFP auszudrücken, die gezielt auf Glykosomen reifen erzeugt, was fluoreszierenden Organellen. Änderungen in der Zusammensetzung glycosome kann über folgende zellulären Fluoreszenz überwacht werden. Mit diesem System haben wir herausgefunden, dass die Umweltbedingungen, insbesondere Glucose, zu regulieren glycosome Zusammensetzung 12. Im Gegensatz zu Verfahren oft verwendet, um Organelle Dynamik in Kinetoplastiden studieren Mikroskopie, bietet das Reportersystem eine Methode, mit der schnellen Screening-Verbindungen und Bedingungen, die Gesamt glycosome Dynamik beeinflussen. Die Veränderungen in der Fluoreszenz spiegeln jedoch Änderungen in der Gesamtorganelle Kompositionen. Weitere biochemische und mikroskopische Experimente sind erforderlich, um die spezifische molekulare Unterschiede zwischen Zellpopulationen, die unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten zu definieren. Wir haben eine Reihe von kritischen Schritte in den Umbau-Tests identifiziert. Interessanterweise haben wir gefunden, dass die Zellen für längere Zeiträume (mehr als zwei Durchgänge) gezüchtet werden, ist ihr Verhalten gegenüber Umgebungsänderungen nicht vorhersehbar. Nach längerer Kultivierung von Zellen hohen Dichten übergeben an die frische medien, zeigen einen vorübergehenden Anstieg im schwachen Bevölkerung, die anzeigt, dass sie noch in der Lage, Glykosomen renovieren, aber nach 24 Stunden sterben. Wir haben auch festgestellt Situationen, in denen kein Umbau beobachtet. Der Grund für dieses Verhalten ist nicht klar, aber wir haben gefunden, dass, wenn die Zellen behandelt werden, wie hier beschrieben (Beschränkung der Anzahl der Zellpassagen, zwei Kulturen und Aufrechterhaltung von weniger als 1 x 10 7 / ml), ist glycosome Umbau reproduzierbar. Wenn die Zellen nicht mehr in Reaktion auf Umweltbedingungen, Retransformieren Zellen mit dem Reportergen-Konstrukt Plasmid Regel schafft Abhilfe. Dieses System wurde verwendet, um glycosome Verhalten in afrikanischen Trypanosomen zu studieren, kann es auch auf die Untersuchung von Organellen in anderen Parasiten durch Verschmelzen fluoreszierende Proteine ​​Aminosäuresequenzen, die direkte Proteinlokalisierung zu anderen Zellkompartimenten angenommen.

Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle 1 erfordert. Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen 13. Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird 14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen 14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP 16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine ​​mit glykolytischen Proteine ​​in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine ​​im TCA-Zyklus und Atmungskette 13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen. Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit 20 niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit 17 Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um 18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt. Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei 2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei 12. Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen 25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine ​​wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert. Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) 12 verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren. Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA purifiation</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosome transformation</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosome transformation</td></tr></tbody></table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern 1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen 2-5. Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt 4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden. Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen 12 leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.

In diesem System wurde eine glucoseabhängige Änderung glycosome Zusammensetzung beobachtet. Wenn Zellen in Glucose enthaltenden Medien gezüchtet werden zwei Populationen beobachtet; eine helle und eine dim (Abbildung 2a). Dim Zellen beherbergen unreifen Glykosomen, die nicht importiert haben die PTS2eYFP während helle Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Glykosomen 12. Wenn Glukose in den Medien vorhanden ist, ist Fehllokalisation von Proteinen tödliche glycosome 15,28 und glycosome Proteinexpression wahrscheinlich eng mit Import gekoppelt. Diese enge Regelung ist für das Auftreten von schwachen Zellen, bei denen glycosome Protein-Expression unterdrückt, wenn die Zellen keine ausreichende Importfunktion verantwortlich. Sobald die glycosome Importmaschinerie wird komplett montiert und funktionsfähig, exprimieren die Zellen glycosome Proteine, die dann in Glykosomen importiert werden, was fluoreszierenden Zellen. In Glukose-Abbau Medien, ist die Fehllokalisation von Proteinen glycosome tolerierenD 15, und die bimodale Verteilung der Bevölkerung durch einen einzigen Peak mit einem breiteren Bereich von Fluoreszenz (2B) ersetzt. Dieses System wurde verwendet, um Bedingungen, die Änderungen in der Zusammensetzung auszulösen glycosome identifizieren. Wenn hohe Dichte Kulturen mit ~ 10% dim Zellen (3A) in frisches Medium übergeben, gibt es eine vorübergehende Erhöhung des Anteils der dim Zellen (3B). Um 24 h. die ursprüngliche Verteilung der Bevölkerung wieder hergestellt (Abbildung 3C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 Solids </td><td > Gewicht (g / l) </td></tr><tr ><td > Ziert Insektenzellmedium Pulver </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Glucose </td><td> 1 </td></tr><tr ><td > HEPES </td><td> 8 </td></tr><tr ><td > MOPS </td><td> 5 </td></tr><tr ><td > NaHCO 3 </sub&gt; </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Natriumpyruvat </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-Alanin </td><td> 0,2 </td></tr><tr ><td > L-Arginin </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-Glutamin </td><td> 0,3 </td></tr><tr ><td > L-Methonine </td><td> 0,07 </td></tr><tr ><td > L-Phenylalanin </td><td> 0,08 </td></tr><tr ><td > L-Prolin </td><td> 0,6 </td></tr><tr ><td > L-Serin </td><td> 0,06 </td></tr><tr ><td > L-Taurin </td><td> 0,16 </td></tr><tr ><td > L-Threonin </td><td> 0,35 </td></tr><tr ><td > L-Tyrosin </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > Adenosin </td><td> 0,01 </td></tr><tr ><td > Guanosin </td><td> 0,01 </td></tr><tr ><td > Glucosamin HCl </td><td> 0,05 </td></tr><tr ><td > Folsäure </td><td> 0,004 </td></tr><tr ><td > r-Aminobenzoesäure </td><td> 0,002 </td></tr><tr ><td > Biotin </td&gt; <td> 0,0002 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. SDM79 festen Komponenten. Feste Medien Komponenten und Menge (g / l) vorgesehen sind. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 </td><td ></td></tr><tr ><td > MEM mit Glutamin </td><td > 600 ml </td></tr><tr ><td > Pen / Strep </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > BME Vitaminlösung </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > MEM Aminosäuren Lösung </td><td > 8 ml </td></tr><tr ><td > MEM nicht essentielle Aminosäure-Lösung </td><td > 6 ml </td></tr><tr ><td > Hämin </td><td> 3,75 </td></tr><tr ><td > Wasser </td><td > 162.25 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. SDM79 flüssigen Komponenten. Volumes ml angegeben. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td ><strong&gt; Cytomix </td><td > Für 20 ml </td></tr><tr ><td > 120 mM KCl </td><td > 1,4 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 0,15 mM CaCl 2 </td><td > 3 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 10 mM K 2 HPO 4 </td><td > 400 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > 25 mM HEPES </td><td > 500 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 2 mM EDTA </td><td > 80 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > 5 mM MgCl 2 </td><td > 100 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > Wasser </td><td> 16.52 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Cytomix Rezept. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Fluoreszierende glycosome Reportersystem. A) PTS2eYFP Expressionskonstrukt Integration. PCF Trypanosomen wurden mit dem pX umgewandeltS2PTS2eYFP Plasmid mit dem Restriktionsenzym MluI linearisiert. Dieses Konstrukt integriert durch homologe Rekombination in das Tubulin-Locus (Wanne) und PARP-Sequenzen (PARP) den Promotor, der die konstitutive Expression PTS2eYFP und die für die RNA-Prozessierung. B erforderlichen Sequenzen) PTS2eYFP Einfuhr antreibt. PTS2eYFP im Cytoplasma, wo es die lösliche Rezeptor PEX7, die das Reporter-Protein den Glykosomen liefert bindet synthetisiert. Einmal mit dem glycosome Membran geliefert wird das Protein eingeführt werden. Ältere Organellen mit Importmaschinen Import PTS2eYFP und Fluoreszenz während diejenigen, die funktionelle Importmaschinerie nicht enthalten dim bleiben. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Glucose-abhängige glycosome Zusammensetzung. PCF-Zellen wurden in SDM79 (+ GLC) oder SDM80 (-Glc) gewachsen undmittels Durchflusszytometrie analysiert. Histogramme von 10.000 Ereignisse. A) Analyse der Zellen in SDM79 gewachsen konsequent zeigt zwei Peaks. Fluoreszierenden Zellen beherbergen eine Mischung aus reifen und unreifen Organellen mit Zellen höherer Fluoreszenzintensitäten mit reifer Glykosomen. In SDM79 ist Fehllokalisation von Proteinen glycosome tödlich und glycosome Proteinexpression und Import muss streng kontrolliert werden. Dies wird in Abwesenheit von Zellen, die mit Zwischenfluoreszenzintensitäten. B) In SDM80 reflektiert wird, wird die Fehllokalisation von glycosome Proteinen toleriert, die bimodale Verteilung der Bevölkerung geht verloren, und die Zellen des mittleren Fluoreszenz beobachtet werden. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Glycosome Umbau. Remodeling der Glykosomen wird durch Durchgang in frische Medien ausgelöst. <stRong&gt; A) Histogramm von 10.000 Ereignisse in der Ausgangskultur (~ 4 × 10 6 / ml). B) 3 Stunden nach der Verdünnung in frisches SDM79 gibt es eine Zunahme des Anteils der schwachen Zellen mit unreifen Glykosomen im linken Gate-C fall ) Histogramm der verdünnten Kultur nach 24 Stunden. Nach 24 Stunden hat sich die Verteilung der Bevölkerung wieder normal, wie die unreifen Glykosomen enthalten nun die Peroxisomen-Proteine ​​notwendig, um das fluoreszierende Protein importieren.

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Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Aufrufe.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Serie: Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Verwenden Sie von<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging zur Überwachung der Progression of Experimental Maus Cytomegalovirus-Infektion bei Neugeborenen

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Biologie

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Entwicklung eines pHluorin2-basierten Sensors für den glykosomalen pH-Wert bei Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der glykosomalen pH-Überwachung bei Trypanosoma brucei mit dem pHluorin2-Biosensor

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die Verwendung von Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) auf Lymphozyten-Proliferation-Monitor

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Verwenden Sie von

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Hochdurchsatz-Gene Tagging in

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei

Messung dynamischer glykosomaler pH-Änderungen bei lebenden Trypanosoma brucei