SS, KB ve Avrupa Komisyonu FP7 Hibe PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX için Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF 01 EO 0803), ve / Alman Araştırma Vakfı Hibe scha 1442 için Fazit Vakfı Lisansüstü bursu tarafından desteklenir CS 3-1 yazarlar çakışan mali çıkarları var.

1. Karışık Kortikal Hücre İzolasyonu ve Kaplama Astrosit kültürleri için Karma kortikal hücre izolasyonu P4 fare yavruları P1 kullanılarak yapılabilir. Uygun astrosit yoğunluğu elde etmek için, her iki T75 doku kültürü şişesi başına 4 fare korteksi pup kullanmak gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki protokol miktarlar 4 fare yavru kullanarak bir hücre hazırlama için hesaplanmıştır. <ol><li> Diseksiyon işlemine başlamadan önce, kültür ortamı astrosit prewarm 30 ml (DMEM, yüksek glikoz +% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu +% 1 penisilin / streptomisin; tabloya bakınız) 37 ° C&#39;ye kadar 37, 1 saat boyunca hücre kültür dereceli su içinde 50 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ° CO2 kuluçka makinesi içinde C, poli-D-lizin (PDL) 20 ml T75 ile kaplayın bir flask. </li><li> Diseksiyon işlemi için gerekli tüm reaktifleri ve malzemeleri hazırlamak. İhtiyacınız olanlar: cerrahi makas, düz ince forseps, düz meme forseps, kağıt havlu, çöp torbası,% 70 etanol birbuz üzerinde d 2 diseksiyon yemekleri (3.5 cm çapında) 2 ml HBSS her ile doldurulur. </li><li> Hafifçe tutun ve% 70 etanol ile yavru fare baş ve boyun püskürtün. Hayvan makas kullanarak hayvanlar feda edilir. </li><li> Kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca anterior posterior orta hat kesi, gerçekleştirin. </li><li> Boyun burun dikkatli kafatası kesin. İki ek kesikler beyne daha fazla erişim sağlamak için yapılır: İlk kesik olfaktor, kafatası tabanından kafatası kesmek için serebellumun alt diğeri anterior yapılır. </li><li> Düz uç forseps kullanılarak, kafatası kanatlar hafifçe yana doğru çevrilmiş ve beyin HBSS ile dolu birinci kesme çanak içine alınır ve yerleştirilir. Buz üzerinde yemeğin geri yerleştirin ve tüm 4 beyinleri hasat devam ediyor. </li><li> Disseksiyon Prosedürün geri kalan bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. Birincisi, olfaktor ve beyincik ince kullanarak kaldırılırdiseksiyon forseps (Şekil 1B). </li><li> , Korteksleri almak ince forseps ile beyin arka ucunu yakalamak için, hemisfer arasında orta hattan bir kesik gerçekleştirmek oluşturulan koru ile forseps ikinci bir dizi eklemek ve soyma uzağa dan korteksin plaka benzeri bir yapıya beyin. </li><li> Dikkatlice ince forseps (Şekil 1D &#39;) ile çekerek korteks hemisferden meninksler teşrih. Bu adım, meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültürünün kirletmeyecek. HBSS ile dolu ikinci yemeğin içine hazırlanmış korteks hemisferlerin aktarın ve buz üzerine geri. Tüm 4 korteksleri buna göre devam edin. </li><li> Son olarak, keskin bıçakları (yaklaşık 4 ila 8 kez) kullanarak küçük parçalar halinde her korteks yarımkürede kesti. </li><li> Steril koşullar altında, transfer korteks bir 50 ml Falcon tüp içine parçalar ve 22.5 ml toplam hacmi ile HBSS ekleyin. </li><li> % 2.5 tripsin, karışımı 2.5 ml ekleyin ve inkübe37 su banyosunda doku ° C&#39;de 30 dakika süre ile. Her 10 dakikada sallayarak arada çevirerek karıştırın. </li><li> Pelet korteks doku parçaları için 300 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle dekantasyon ile süpernatant kaldırmak. Doku pelet kaybetmemek için size mekanik bir pipet kullanarak tutabiliriz. Doku parçaları tek hücreler (20-30 defa) içine ayrılamaz oluncaya kadar bir 10 ml plastik pipet kullanılarak 10 mL astrosit kaplama orta ve şiddetli pipetleme eklenmesi ile tek bir hücre süspansiyonu içine doku ayrışır. Astrosit kaplama orta kullanarak 20 ml ses seviyesini ayarlayın. Bir hematocytometer kullanarak sayarak tek hücre içine kanıtı korteks doku ayrışma olabilir. 4 fare yavru korteks biri hazırlanması 10-15 x10 6 disosiye tek hücre boyun eğmek zorundadır. </li><li> T75 kültür şişelerinde gelen PDL aspire plakası 37 disosiye tek bir hücre süspansiyonu ve inkübe ° CO 2 inkübatör C. </li></ol> 2. Bir Enr Edinmeiched astrosit Kültür <ol><li> Bundan sonra karışık kortikal hücreleri ve tüm 3 gün sonra kaplama orta 2 gün değiştirin. </li><li> Astrositler konfluent ve bindirilirken mikroglia vardır astrosit katmanda maruz oturmak veya zaten astrosit tabakası (Şekil 2) ayrılmış olan 7 ila 8 gün sonra, mikroglia kaldırmak için orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca 180 rpm&#39;de T75 çalkalanır. Süpernatant içeren mikroglia atın veya kültür isteyen ve mikroglia tetkik edersek, aşağı doğru döndürün ve kültür 28,29 için plaka. </li><li> 20 ml taze astrosit besiyeri ekleyin ve oligodendrosit prekürsör hücrelerinin (OPC) kaldırmak için 6 saat boyunca 240 rpm&#39;de şişeyi sallayarak devam. Bazı OPCs tamamen astrosit katmanından terketmez yana, OPC kirlenmesini önlemek amacıyla 1 dakika boyunca elle şiddetle sarsmaya devam ediyor. Süpernatantı atın veya kültür OPCs 29 isterseniz, aşağı ve plaka dönerler. </li><li> Kalan conflue DurulamaPBS ile iki kere nt astrosit tabaka, 37 CO2 kuluçka makinesi içinde 5 ml tripsin-EDTA ile inkübe eklemek ° C&#39;de, PBS aspire Astrositlerde dekolmanı her 5 dakikada kontrol edin ve elinizi (2-3 kez) ve palmiye karşı şişeyi vurarak astrositlerde dekolmanı zorlamak. </li><li> Astrositler kültürü şişesi ayrılmış, sonra, astrosit kültür ortamı, 5 dakika boyunca 180 xg&#39;de sıkma hücreler, 5 ml eklemek süpernatan aspire ve 40 ml taze ortam astrosit kaplama ekleyin. Bir T75 doku kültürü şişesi ilk hücre bölünmesinden sonra 6 1x10 çevresindeki hücreleri boyun eğmek zorundadır. 37 iki T75 kültür şişeleri ve inkübe Levha hücreleri ° CO 2 inkübatör C. Her 2 ila 3 gün orta değiştirin. </li><li> Ilk split astrositler sonra 12-14 gün deneme gerçekleştirmeden önce uygun hücre konsantrasyonu 24-48 saat içinde kaplanır. Bir T75 doku kültürü şişesi ikinci hücre bölünmesinden sonra 1.5-2 çevresindeki x10 6 hücre boyun eğmek zorundadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+for+astrocytes:+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain.">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li><li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energy+metabolism:+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation.">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457, 675-677 (2009).</li><li>Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+influence+of+MeCP2-deficient+glia+on+neuronal+dendritic+morphology.">Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology.</a> Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).</li><li>Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+astrocytes+induce+developmental+delays+in+dendrite+maturation+and+synaptic+protein+expression.">Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression.</a> BMC Neurosci. 11, 132 (2010).</li><li>Kaneko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain.">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li><li>Min, R., Nevian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+signaling+controls+spike+timing-dependent+depression+at+neocortical+synapses.">Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses.</a> Nat. Neurosci. , (2012).</li><li>Eroglu, C., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+connectivity+by+glia.">Regulation of synaptic connectivity by glia.</a> Nature. 468, 223-231 (2010).</li><li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action-potential+modulation+during+axonal+conduction.">Action-potential modulation during axonal conduction.</a> Science. 331, 599-601 (2011).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+VEGF+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 .</li><li>Alvarez, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hedgehog+pathway+promotes+blood-brain+barrier+integrity+and+CNS+immune+quiescence.">The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence.</a> Science. 334, 1727-1731 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+of+brain+endothelium+in+vitro+are+enhanced+by+astroglia.">Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia.</a> J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).</li><li>Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metabolism+dictates+the+polarity+of+astrocyte+control+over+arterioles.">Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.</a> Nature. 456, 745-749 (2008).</li><li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+beyond+the+glial+scar.">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li><li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li><li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage.">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113, 221-233 (2002).</li><li>Dabir, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glutamate+transport+in+a+mouse+model+of+tau+pathology+in+astrocytes.">Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes.</a> J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).</li><li>Wisniewski, H. M., Wegiel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+relationships+between+astrocytes+and+classical+plaque+components.">Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components.</a> Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).</li><li>Shin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mutant+huntingtin+in+glial+cells+contributes+to+neuronal+excitotoxicity.">Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity.</a> J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).</li><li>Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP/alpha-synuclein-positive+filamentous+inclusions+in+astrocytes+and+oligodendrocytes+of+Parkinson's+disease+brains.">NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains.</a> Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).</li><li>Lioy, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glia+in+the+progression+of+Rett's+syndrome.">A role for glia in the progression of Rett's syndrome.</a> Nature. 475, 497-500 (2011).</li><li>Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+and+its+role+in+Alexander+disease.">GFAP and its role in Alexander disease.</a> Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li><li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+damage+in+the+central+nervous+system:+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta.">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II.">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li><li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS,+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects.">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li><li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain:+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages.">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+disease:+a+neurodevelopmental+perspective.">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li><li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1.">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada belirtilen yöntem, ilk olarak 1980 de 27 McCarthy ve De Vellis tarafından tarif kemirgen neonatal beyin gelen astrosit kültür hazırlanması dayanmaktadır. Postnatal P1 P4 fare beyin kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültür modifiye metodu Burada sunulan, verimleri saf primer astrosit hızlı ve son derece tekrarlanabilir olduğunu. Bu teknik kolaylıkla böyle sıçan veya domuz ve böyle omurilik gibi diğer beyin bölgelerinden gibi diğer türler, gelen astrositler yalıtmak için transfer edilebilir. McCarthy ve deVellis yöntemi ile neonatal beyin astrosit progenitör hücre izolasyonu yüksek proliferatif hücreleri üretir Oysa, hücre çoğalması ve postnatal P1-P4 fare yavrular izole astrositlerde yayılımı sınırlıdır. Yarma astrositler kez vitro 7 günde (DIV), onlar büyüyecek sonra confluency ve olgun. Vivo olarak, çoğu astrosit proliferasyonu P14 32 tarafından büyük ölçüde tamamlandı. Ore, biz izole astrositlerde olgun fenotipi sağlamak için günde 21 ila 28 DIV (Şekil 2F) deneyleri için astrositler kullanmanızı öneririm. Astrosit kültürleri çoğalmaya içsel kısıtlama nedeniyle 3 kat daha fazla parçalı edilmemelidir. Tarif edilen ayırma yöntemi kritik adımlar korteksleri sindirim ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için sindirilmiş doku aşağıdaki ezerek toz haline getirme bulunmaktadır. Bu nedenle, 20-30 kat için beyin korteks dokusu ezerek toz haline getirme sonra tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tripsin konsantrasyon ve sindirim süresini optimize etmek için gereklidir. En aza indirmek için varyasyon tripsin aliquoted edilmeli ve donma-çözülme döngüleri kaçınılmalıdır. Açıklanan prosedür PDL kaplı kültürü şişeleri, astrositlerde bağlayıcı sağlar ve birkaç gün sonra kaplama bir konfluent astrosit tabakası teşvik üzerine karışık kortikal hücrelerin kaplama dayanmaktadır. PDL kaplama astrosit m için gerekli olmamakla birliktemikroglia ve oligodendrositler onların ayrılması sonra aintenance, bu tür immunofluorescene boyama gibi belirli uygulamalar için alt-yapılabilir. İlk hücrenin bölünmesi İyi zamanlama hücre bütünlüğü ve verimi açısından önemlidir. Onlar confluency ulaştı ötesinde astrosit kültürleri varsa, ilk hücre bölünme sırasında yetersiz dekolmanı nedeniyle hücrelerin çoğunluğu kaybedebilir. Bu olumsuz hücre bütünlüğünü etkileyen tripsin ile kapsamlı inkübasyon zamandan beri, dekolmanı için zaman artırarak üstesinden gelinemez. Buna karşın, pek çok kortikal hücre süspansiyonu kaplama birleşen astrosit hücre tabakasının yetersiz oluşumuna neden olur. Astrositler konfluent ve mikroglia hücreleri astrosit tabakasının üst konumda oturduğunuzda ilk hücre bölünme için en iyi zaman, karışık kortikal hücrelerin kaplama sonrasında 7 ila 8 günüdür. Tarif kortikal hücre kültüründe, astrositler (hücresel heterojenite göstermektedir &lt;kuvvetli&gt; Şekil 3), bu da in vivo 33,34 astrositler için tarif edildiği gibi. Ancak, çeşitli astrosit morfolojisi ve işlevselliğini tanımlayan potansiyel heterojen astrosit alt tiplerini tanımlamak ve ayırt etmek belirteçlerinin sınırlı sayıda engel olmuştur. Olgun fibröz ve reaktif astrositlerde bir iyi karakterize işaretleyici GFAP olduğunu. Ancak, GFAP ancak tüm astrositler için bir belirteç olarak kullanımı sınırlayıcı, olgun protoplazmik astrositler ile ifade edilir ve aynı zamanda bir sahne özgü marker olarak kullanımını kısıtlayan, gelişim sırasında ve erişkin B hücreleri tarafından RG hücreler tarafından ifade edilir. GLAST, ALDH1L1 veya BLBP dahil astrositlerin, diğer belirteçler de olgunlaşmamış astrositler tarafından ifade edilmiştir ve bu nedenle sadece olgun astrositler işareti yok. Son olarak, GFAP, AQUAPORIN-4 ve S100B gibi olgun astrosit işaretleyicileri (Şekil 3) postnatal olgunlaşma boyunca giderek up-regüle vardır. Bizim ellerde, ast4 haftalık bir yaşta rocyte kültürlerde in vivo olgun astrositlerde özelliklere sahiptir. Primer astrosit kültürleri kullanarak biz kanla proteini fibrinojen astrosit aktivasyon 17 indükler nasıl moleküler mekanizmayı belirlemede olabilir. Çalışmalarımız fibrinojen latent TGF-β bir taşıyıcı olduğunu ortaya koydu. Aktif TGF-β oluşumu ve astrositler 17,26 de TGF-β/Smad sinyalizasyon yolunun aktivasyonuna yol açan fibrinojen ile birincil astrositlerin tedavisi. Bu sonuçlar, in vivo olarak fibrinojen enjeksiyonları kullanılarak teyit edilmiştir. Ayrıca, astrositler astrosit klima orta hasat ve diğer hücre türleri için bu şartlı ortam uygulanarak analiz edilebilir maddelerin salgılanması ile diğer hücre tipleri kontrol eder. Biz daha önce akson uzantısı nasıl etkilediğini klimalı orta fibrinojen-işlenmiş astrositlerde fonksiyonel bir deneyde analiz etmek astrosit klimalı ortam kullanılmıştır. Reaktif astrositler ekspres ve salgılarakson uzantısı 16 inhibe CSPG ailenin proteinleri,. Fibrinojen işlenmiş astrosit Nitekim, klimalı ortamda anlamlı nörit uzunluğu ve akson uzantısı 17 gösteren hücrelerin yüzdesi de azalmıştır. Çeşitli uygulamalarda yönetilebilirlik büyük vivo soruşturması tamamlanana çünkü bu protokolü açıklanan kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültürü, astrosit biyoloji araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Bununla birlikte, elde edilen astrositler in vitro kültürlenmiştir ve bir çok astrosit özelliklerini yansıtmaktadır iken, aynı zamanda in vivo astrositlerde farklı edilmiştir akılda tutulmalıdır. Bu nedenle, 35 veya antikor-tabanlı FACS izolasyon 36 immunopanning tarafından doğrudan seçim ve astrositler izolasyonu diğer yöntemleri daha astrositlerde temel özelliklerini araştırmak için yeni yollar temsil eder.

Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) bir çok bol hücre tipi vardır. İnsanda korteksin 1 nöron başına 1,4 astrositler vardır oysa nöronlara astrositlerde oranı, fareler ve sıçanların kortekste 01:03 olduğunu. Astrosit fonksiyonu ilgi son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Astrositlerde bir anahtar işlevi nöronlar 2,3 yapısal ve metabolik destek sağlayarak onların rolüdür. Astrositlerin Yeni keşfedilen rolleri işlevleri geniş bir yelpazesini kapsar. Bu gelişim 4-6 esnasında gelişen aksonlar ve bazı nöroblast göç rehberlik, sinaptik iletim fonksiyonları, nöral devreleri 7-9 ile sinaps gücü ve bilgi işleme, kan-beyin bariyeri roller (BBB) ​​oluşumu 10 ve bütünlük 11-13 içerir serebrovasküler tonu 14 ve düzenlenmesi. Astrositlerde bir diğer önemli özelliği yaralanma onların yanıttır. Patolojik koşullar altında, astrocytes reaktif hale gelir ve daha fazla ara filaman glial fibriler asidik protein (GFAP) ve inhibitör ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri 15,16 ekspresyonunu upregüle. Reaktif astrositler kondroitin sülfat proteoglikan (CSPG) ailesinin astrosit salgılanan ECM proteinleri çoğunlukla oluşan bir glial skar oluşması, sağlıklı doku hasarı sitesi ayırmak, bu önemli faktörler MSS yaralanması 15-17 sonrasında aksonal rejenerasyon inhibe ederler. Astrositler geç embriyogenez ve erken postnatal ömrü boyunca radyal glial (RG) hücrelerden kaynaklanır. Astrosit belirtim oluştu sonra astrosit habercileri son konumlarına göç, onlar terminal farklılaşma süreci başlar nerede. İn vivo olarak, astrositler bunların tipik morfoloji 18,19 ile gösterildiği gibi üç ila dört hafta doğumdan sonra olgun görünmektedir. RG hücre subpopülasyonu subventricular dilimi astrositler (tip B hücreleri) dönüştürmek. Both, RG ve B tipi hücrelerin sırasıyla, geliştirme sırasında ve yetişkin astrosit benzeri nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) olarak işlev. Astrositler, RG ve B tipi hücreler gibi de bu belirteçler sadece özellikle yetişkin astrositler etiketlemek için kullanılamaz belirten astrosit özgü glutamat taşıyıcısı (GLAST), beyin lipid-bağlayıcı protein (BLBP) ve GFAP ifade. Sağlıklı beyin, RG ve böyle kendini yenilemek için kapasite olarak B tipi hücreler sergi kök hücre potansiyeli bölmek değil yetişkin parankimal astrositler, aksine. Astrosit düzensizliği Alzheimer hastalığı 20,21, 22, Huntington hastalığı, Parkinson hastalığı 23, Rett sendromu, 24 ve 25 Alexander hastalığı da dahil olmak üzere, çeşitli patolojiler kapsamına dahil edilmiştir. Ayrıca, astrositler astrosit aktivasyonu ve astrositik glial skar 16,26 yol MSS tüm hakaretlerini tepki. Aşağıdaki beyin tr oluşturan astrositik glial skarauma veya spinal kord yaralanması nöronal rejenerasyon 15 engelleyen ana engel olarak düşünülmektedir. Hücrelerin saflaştırılmış popülasyonları ayırmak ve korumak için güvenilir yöntemler geliştirilmesi sinir sisteminin anlayışımıza önemli olmuştur. McCarthy ve de Vellis tarafından öncülük çalışmaları yenidoğan sıçan doku 27&#39;den astrositlerde neredeyse saf kültürleri hazırlamak için bugüne kadar araştırmacılar sağlar. Much fare kortikal astrositler izole etmek için biraz değiştirilmiş bir formu burada sunulan bu yöntemle, astrosit biyoloji öğrendi olmuştur. Vivo çalışmalar, astrositler yanı sıra klimalı ortamda elde edilen in vitro kültür açıklanan kullanarak tamamlayan, daha astrosit işlevleri içgörüler kazanmak için değerli araçlardır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Çalışma solüsyonu Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Astrosit kültür besiyeri </td></tr><tr><td> DMEM, yüksek glukoz </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> Isı inaktive FBS, </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 10082-147 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 10 </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15140-122 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Beyin dokusu kazmak için Çözümestion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> % 2.5 tripsin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15090-046 </td><td> Nihai konsantrasyon:% 0.25 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Diğer </td></tr><tr><td> % 70 (hacim / hacim) etanol </td><td> Roth </td><td> 9065.2 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-D-Lizin </td><td> Millipore </td><td> A-003-E </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Su </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td><td> hücre kültürü notu </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> hücre kültürü notu </td></tr><tr><td> 0.05% deneyinpsin-EDTA </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 mikron Steril filtre </td><td> Sartorius </td><td> 16555 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 cm petri </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Falcon tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon tüp </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 doku kültürü şişesi </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> Forseps, ince </td><td> Dumont </td><td> 2-1032, 2-1033 </td><td> # 3c; # 5 </td></tr><tr><td> Forseps, düz meme </td><td> KLS Martin </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13 cm cerrahi makas </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stereomikroskopta </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> Stereomikroskopta + Kamera </td><td> Leica </td><td></td><td> MZ16F; DFC320 </td></tr><tr><td> Mikroskop + Kamera </td><td> Zeiss; Canon </td><td></td><td> Primo Vert; PowerShot A650 IS </td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> Orbital Çalkalayıcı </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKE 4450-1CE </td><td> Maxq 4450 </td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> JULABO </td><td></td><td> SW20; 37 ° C </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of mouse cortical astrocytes

Astrositler memeli beyin içinde bol bir hücre tipi, henüz çok moleküler ve işlevsel özellikleri öğrendik gerekmektedir. Astrosit in vitro hücre kültürü sistemlerinde detaylı olarak bu glial hücrelerin biyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılabilir. Bu video protokol fare yavrular karışık kortikal hücrelerin izolasyonu ve kültürü ile saf astrositler edinme gösterir. Yöntem, canlı nöronların ve astrositlerin yokluğunda, oligodendrosit ve mikroglia, kültür içinde merkezi sinir sistemi üç ana glial hücre popülasyonları, ayrılmasına dayanır. Kültürün ilk günlerinde Örnek görüntüleri karışık bir hücre popülasyonunun varlığına göstermek ve astrositler konfluent haline ve mikroglia ve oligodendrosit ayrılmalıdır zaman timepoint göstermektedir. Ayrıca, saflık ve iyi kurulmuş için immünohistokimyasal boyamalar kullanarak kültürlü astrositlerde astrositik morfolojisi göstermek veYeni astrosit belirteçler nitelendirdi. Bu kültür sistemi kolaylıkla astrosit biyolojinin çeşitli yönlerini araştırmak için saf fare astrosit ve astrosit-şartlı ortam elde etmek için de kullanılabilir.

Tam fare beyin (Şekil 1A), serebellum ve olfaktor (Şekil 1B) kaldırılması gerekir izolasyonu üzerine. Korteksleri fare beyin sapı (Şekil 1C) ve bireysel korteks (Şekil 1D &#39;) arasında menenjlerin soyulmuş özenle (Şekil 1E) kaldırılır. Meninksler meningeal arter sistemi ve meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültür kirlenmesine eksik kaldırma sonuçları ortada. Mikst kortikal hücre süspansiyonu kaplama sonra, bazı astrositler zaten 24 saat (Şekil 2A) içindeki kültürü şişesi iliştirin. Kültür ortamı glial hücre hayatta kalma ve büyüme yanadır Ancak, hücre kültür yüzey maddesi, ilk olarak 3 ile 5 gün (Şekil 2A-C) için hücre artıkları ve ölen nöronların içerir. Bir kez astrositler konfluent ve mikroglia astrocyt çıplak oturmakE tabakası, genellikle karma kortikal hücrelerin izolasyonu sonrası 7. günde, astrositler (Şekil 2B) sallayarak mikroglia ve OPCs ayrılmalıdır. Ilk split hücreler 2 gün sonra astrosit morfoloji göstermektedir. Bu noktada astrosit yoğunluğu düşüktür ve astrositler hacimli vardır (Şekil 2E, siyah oklar bir hücre işaretleyebilirsiniz). Bu noktada beklenen verim T75 doku kültürü şişesi başına yaklaşık 4-6 x10 5 hücreleri ile düşüktür. Ancak, hücreleri hala çoğalırlar ve bu timepoint kültür olgun. Astrositler genelde izole astrositlerin fenotipi, bir olgun sağlamak için 28 (Şekil 2F) ile 21. günde deneyler için kullanılır. Bu noktada beklenen verim T75 doku kültürü şişesi başına 1.5-2 hakkında x10 6 hücre olduğunu. Astrosit kültür saflığı elektron mikroskobu morfolojik çalışmalarda, hücre işaretleyici ifade ve farmakolojik yanıt 27 ile karakterize edilmiştir. Bir kirlenmesistrocyte kültürü mikroglia (IBA-1) ve OPC (O4) için işaretleyici kullanılarak incelenebilir. Elde astrosit kültür saflığı ve vade GFAP proteinine karşı bir antikor kullanılarak immünohistokimyasal inceleme ile muayene edilmelidir. Bu, hücrelerin büyük bir kısmını bir yoğun, filamentli sinyali (Şekil 3) göstermektedir beklenmektedir. Kortikal astrositlerin Bizim izolasyonu ve kültürü yöntemi protein GFAP (Şekil 3) karşı bir antikor kullanılarak saptandı den daha büyük ve% 98 bir saflık astrosit ile sonuçlanmıştır. Prosedürü başarılı olursa, kontamine hücreler nadirdir (&lt;% 2) ve sırasıyla IBA-1 ve O4 kullanılarak lekeli olabilir mikroglia ve OPCs içerir. Bu tür AQUAPORIN-4, BLBP, S100B ve GLAST gibi diğer astrosit işaretleri, ve arzu edildiği takdirde, daha ileri analizinde de kullanılabilir. GFAP ek olarak, bu belirteçler her 28 günlük astrosit kültürleri ile ifade edildi. Astrosit nüfus saflaştırılmış Yeni gen ekspresyon profili yeni potansiyel ast ortayaayrıca bu gibi izole edilmiş kortikal astrositler (Şekil 3) büyük kısmının ile ifade edilir folat metabolik enzim ALDH1L1 30,31, rocyte gibi belirteçler,. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig1.jpg" /> Şekil 1. Postnatal (P3) fare korteksin Diseksiyonu. A) Tüm beyin. Olfaktor ve serebellumun alınmasından sonra B) Beyin. Beyin korteksinin plaka benzeri yapı soyulması ile korteksleri C) İzolasyon. D, meninksler (siyah oklar meningeal arterlerin belirtiniz) ile ventral ve dorsal sitesinden D &#39;) Cortex. E) Cortex meninksler olmadan. Ölçek çubuğu, 1.5 mm. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50079/50079fig2.jpg" /> Şekil 2. Izolasyonu sonrası farklı zaman noktalarında izole karışık kortikal hücreler ve saf astrosit kültür Morfolojik bakış.Mikst kortikal hücrelerin sonra kaplama A) 1 gün. İlk astrositlerde balonun altına (siyah oklar) bağlı ve ölmekte olan nöronların süpernatantta vardır. B) 3 gün karışık kortikal hücre sonra kaplama. Astrosit tabaka (siyah oklar) şekillendirme olduğunu. Nöronlar neredeyse bulunmaz. C) 5 gün karışık kortikal hücre sonra kaplama. İlk mikroglia ve astrosit tabakanın üstüne OPCs (siyah oklar). D) 7 gün mikst kortikal hücrelerin sonra kaplama. Astrosit tabakası tamamen konfluent olduğunu. E) bölme sonra güçlü titreme ve 2 gün ile mikroglia ve OPCs çıkardıktan sonra, ekteki hücreler düşük yoğunluklu (oklar tek bir hücreyi işaret) ile astrosit morfolojisi göstermektedir. F) astrosit katmanı 2 hafta ilk split sonra yüksek yoğunluklu gösterir. Ölçek çubuğu, 10 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig3.jpg" /> Şekil 3,. Primer astrosit kültür Saflık. Birincil fare astrosit cul immünbelirteçler GFAP, GLAST, S100B, AQUAPORIN-4, ALDH1L1 ve BLBP (tüm yeşil) ile tures saf primer astrosit kültürü ortaya çıkardı. Çekirdekler 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanmış. Ölçek çubuğu: 10 mikron.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

isolation-and-culture-of-mouse-cortical-astrocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

91.5K Görüntüleme.  University of Freiburg. Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Video: Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelleme Astrositom Patogenez<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Nörobilim

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em&gt; In-Vitro</em&gt; İskemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Yetişkin Fare Omuriliğinden Astrositlerin ve Mikroglia'nın Verimli Ekstraksiyonu

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Yazar Spotlight: Yetişkin Fare Omuriliğinden Glial Hücrelerin İzolasyonu 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
...

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Modelleme Astrositom Patogenez

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Mikroglia'nın Yetişkin Bir Fare Beyninin Korteksinden İzolasyonu