Sepsisin Neden Olduğu Akut Akciğer Hasarı Olan Farelerde Shikonin'in HIF-1α / VEGF Sinyal Yolu Üzerindeki Etkileri

Protokol, farelerde sepsisin neden olduğu akut akciğer hasarını hafifletmede shikonin'in etkinliğini değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Çalışma, HIF-1α / VEGF yolunu hedef alarak, farklı shikonin dozlarının sağkalım oranlarını, akciğer patolojisini ve inflamatuar belirteçlerin ekspresyonunu nasıl etkilediğini araştırıyor ve potansiyel terapötik faydalarını vurguluyor.

Sepsis sıklıkla yüksek mortalite komplikasyonu olan akut akciğer hasarına (ALI) neden olur. HIF-1α / VEGF yolu sepsiste önemli bir rol oynar ve anti-enflamatuar özelliklere sahip doğal bir bileşik olan shikonin, bu yolu hedefleyerek akciğer hasarını hafifletebilir. Balb / c fareleri rastgele dört gruba ayrıldı: sahte grup, model grubu, düşük doz tedavi grubu ve yüksek doz tedavi grubu. Sahte gruba çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) olmaksızın laparotomi, model gruba ise sepsis ile ilişkili akut akciğer hasarını indüklemek için CLP uygulandı. Modellemeden sonra, düşük doz ve yüksek doz tedavi grupları, 14 gün boyunca günde bir kez sırasıyla 12.5 mg / kg ve 50 mg / kg dozlarında gavaj yoluyla shikonin aldı. Farelerin 7 günlük sağkalım oranı izlendi. Akciğer dokusu patolojisini değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (HE) boyaması kullanıldı, akciğer ıslak/kuru (W/D) ağırlık oranı ölçüldü ve akciğer dokusunda HIF-1α, VEGF, TNF-α ve IL-6 ekspresyonunu tespit etmek için Western blot yapıldı. Shikonin, septik farelerin hayatta kalma oranını önemli ölçüde iyileştirdi ve en büyük etki yüksek doz grubunda gözlendi (p < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, shikonin ile tedavi edilen gruplarda akciğer W / D oranı ve doku hasarı, doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalmıştır. Ek olarak, shikonin, HIF-1α, VEGF, TNF-α ve IL-6'nın ekspresyonunu önemli ölçüde azalttı ve yüksek doz grubu en belirgin azalmayı gösterdi (p < 0.05). Shikonin, septik farelerde akut akciğer hasarını hafifletir, potansiyel olarak HIF-1α ekspresyonunu inhibe ederek ve ilgili enflamatuar faktörlerin üretimini azaltarak.

Sepsis, enfeksiyon tarafından tetiklenen ciddi bir sistemik inflamatuar yanıttır. ¹ Genellikle çoklu organ fonksiyon bozukluğuna yol açar ve durum ilerledikçe yaşamı tehdit edici hale gelebilir. ² Mekanik ventilasyon ve destekleyici bakım gibi tedavilerin kullanılmasına rağmen, sepsis ile ilişkili ALI için mortalite oranları yüksek kalmaktadır ve %30-40'a ^{ulaşmaktadır3}. Bu tedaviler esas olarak altta yatan nedenlerden ziyade semptomları ele alır ve genel etkinliklerini sınırlar. Bu nedenle, akciğer hasarının nedenlerini hedef alan yeni terapötik yaklaşımların tanımlanması, sepsiste hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirebilir.

Son çalışmalar, hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α'yı (HIF-1α) sepsis ile indüklenen ALI ^4,5'in ilerlemesinde kritik bir düzenleyici olarak tanımlamıştır. HIF-1α, sepsis sırasında akciğer dokusunda birikir ve iltihabı ve doku hasarını şiddetlendiren aşağı akış genlerinin ekspresyonunu yönlendirir⁶. Bu süreç, akciğer hasarının kötüleşmesine önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu nedenle, HIF-1α sinyal yolağını hedeflemek, sepsis kaynaklı ALI'de görülen inflamatuar ve hipoksik yanıtları hafifletmek için umut verici bir yaklaşım sunmaktadır.

Daha etkili tedavi arayışında, Geleneksel Çin tıbbı (TCM) değerli bilgiler sağlamıştır ^7,8. Shikonin, Lithospermum erythrorhizon^7'den ekstrakte edilen bir antrakinon bileşiğidir. Kayda değer anti-inflamatuar⁹, antibakteriyel¹⁰ ve anti-tümör etkileri¹¹ gösterir. Shikonin, lipopolisakkaritin (LPS) neden olduğu akciğer hasarını hafifletebilir, bu da akciğer koşullarında potansiyel terapötik rolünü düşündürür¹². Aynı zamanda, bazı çalışmalar, shikonin'in mononükleer makrofaj sistemini düzenleyerek, pro-inflamatuar ve anti-enflamatuar tepkileri dengeleyerek sepsisin neden olduğu oksidatif hasarı hafifletebileceğini de öne sürmüştür. Bununla birlikte, sepsis kaynaklı ALI'de shikonin'in koruyucu etkilerinin arkasındaki mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu, mevcut araştırmalarda kritik bir boşluğu temsil ediyor.

Bu çalışmada, çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP) kullanılarak sepsis ile indüklenen ALI'nin bir fare modelinde shikoninin koruyucu etkilerini araştırmayı amaçladık. CLP teknolojisi, karmaşık sistemik inflamatuar yanıtları ve çoklu organ disfonksiyonunu simüle edebildiği için sepsis araştırmalarında önemli bir rol oynar ve bu da onu yeni tedavi stratejilerinin etkinliğini değerlendirmek için uygun hale getirir. CLP teknolojisi, geleneksel LPS enjeksiyon yöntemlerine kıyasla klinik olarak nispeten daha önemlidir: klinik sepsisin patolojik sürecine daha yakın olan bağırsak mikrobiyota translokasyonunun neden olduğu sistemik inflamatuar yanıtı simüle eder. Derecelendirilebilir ve kontrol edilebilir: ligasyon uzunluğunu ve perforasyon boyutunu ayarlayarak, hastalığın şiddeti kontrol edilebilir ve tüm sepsis çalışması için uygundur. Ek olarak, çoklu organ disfonksiyonu ve sitokin yanıtındaki benzer dinamik değişiklikleri simüle edebilir. HIF-1α / VEGF sinyal yolunu modüle etmede shikonin'in rolünü araştırarak, sepsis ile ilişkili akciğer hasarının altında yatan mekanizmaları ele alan ve potansiyel olarak klinik sonuçları iyileştiren yeni terapötik stratejiler hakkında bilgi vermeyi umuyoruz.

Protokol, Wenzhou Tıp Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden onay aldı. Bu çalışmada erkek C57Bl / 6 fareler (5-6 aylık; 20-25 g) kullanıldı. Ana reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sepsis fare modelinin hazırlanması

1. 25 °C sabit sıcaklık, %50 nem ve 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü altında ev fareleri.
2. 7 günlük bir iklimlendirme döneminden sonra, fareleri rastgele dört gruba ayırın: Sham grubu, Model grubu, Düşük doz tedavi grubu ve Yüksek doz tedavi grubu, her grupta 20 fare.
3. Önceki bir çalışmadan¹³ elde edilen referanslara dayanarak, düşük doz grubunu 14 gün boyunca 12.5 mg / kg purpurin konsantrasyonu ve yüksek doz grubunu 14 gün boyunca 50 mg / kg konsantrasyonla tedavi edin. Sahte cerrahi grubu için, ligasyon veya ponksiyon olmadan laparotomi, çekal traksiyon, redüksiyon ve kapatma yapın ve 14 gün boyunca aynı dozda fizyolojik salin ile tedavi edin. Sepsis grubu için deneysel adımlar aşağıdaki gibidir.
4. Gece boyunca açlık çektikten sonra (suya izin verildi), fareleri işlem boyunca steril koşullar altında sodyum pentobarbital (40-80 mg / kg) ile uyuşturun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
5. Alt ekstremiteleri hemostatik forseps ile hafifçe sıkıştırırken solunum hızının yavaşlaması, kas gerginliğinde azalma ve belirgin bir stres tepkisi olmaması olarak uygun anesteziyi kontrol edin.
6. % 75 etanol, 3x ile dezenfeksiyon yapın. Fare karnının sol orta pozisyonunda yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi, fasyayı ve kasları katmanlar halinde kesin.
7. Her iki elinizde künt uçlu oftalmik forseps kullanarak, karın boşluğunu nazikçe keşfedin, farenin çekumunu bulun ve serbest bırakın ve çekumun ucundan yaklaşık 1 cm mesafede bağlayın.
8. Çekumun ucunu delmek ve bağlamak için 21G'lik bir iğne kullanın, künt uçlu oftalmik forseps kullanarak delinme bölgesinden az miktarda bağırsak içeriğini nazikçe sıkın ve ardından çekuma geri alın.
9. 1 mL% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile deri altı sıvı resüsitasyonu yapın. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren hayvanın, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmediğini not ediyoruz.
10. 7 günlük CLP modellemesinden sonra, ötenazi için aşırı anestezi uygulayın.
    NOT: Purpurinin cilt, solunum yolu ve sindirim sistemi üzerindeki olası tahriş edici etkilerinin yanı sıra suda yaşayan organizmalar, çevre kirliliği üzerindeki yüksek toksisitesi nedeniyle, deney sırasında kişisel koruma kullanın.

2. Hayvan modellerinin değerlendirilmesi

1. Fare hayatta kalma gözlemi
   1. Hayvanlarla ilgili işlemleri yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. İstatistiksel analiz için modellemeden sonra 1 hafta içinde ölüm oranını kaydedin. Bazı fareler ötenaziden önce sepsis olmadan ölürken, CLP model farelerin belirli bir ölüm oranı vardır (Tablo 1).
   2. Akciğer ıslak-kuru ağırlık oranı ölçümü
      1. 24 saatlik modellemeden sonra, fareleri 1.4-1.5 adımlarına göre tekrar uyuşturun.
      2. Farenin klavikula orta hattının sol tarafında yaklaşık 1 cm'lik uzunlamasına bir kesi yapın ve cerrahi makas ve forseps ile göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için deri, fasya ve kas katmanlarını çıkarın.
      3. Sol akciğeri çıkarın ve yüzey sıvısını boşaltın. Islak ağırlığı ölçün ve ardından kuru ağırlığı elde etmek için 80 ° C'lik bir fırında 72 saat sabit bir ağırlığa kurutun.
      4. Akciğer su içeriğini şu şekilde hesaplayın:
         Akciğer su içeriği = (Islak ağırlık - Kuru ağırlık) / Islak ağırlık x %100.
   3. Akciğer dokularının histopatolojik karşılaştırılması
      1. Belirtilen zaman noktalarında, sol akciğeri yukarıda adım 2.2'de açıklandığı gibi toplayın. Akciğeri% 10 nötr formaldehit içinde sabitleyin, parafine gömün ve 5 μm kalınlığında bölümlere ayırın.
      2. Akciğeri her seferinde 5-10 dakika boyunca 2 kez ksilen içinde mumdan arındırın. Gradyan başına 3 dakika boyunca %100, %95, %85 ve %75 ile seri etanol rehidrasyonu gerçekleştirin. 2 dakika damıtılmış suda bekletin.
      3. Yaklaşık 100 mL hematoksilen çözeltisi ile 10 dakika boyayın, ardından yüzen renkleri gidermek için damıtılmış su ile durulayın.
      4. Yaklaşık 70 mL diferansiyasyon solüsyonu ekleyin ve 30 saniye bekletin. Ardından, her seferinde 3-5 dakika olmak üzere 2 kez musluk suyuna batırın.
      5. 2 dakika boyunca damla damla yaklaşık 100 mL eozin boya çözeltisi ekleyin. Fazla boya çözeltisini dökün ve aşağıda açıklandığı gibi hızlı bir şekilde kurutun.
      6. Aşağıda açıklandığı gibi dehidrasyon, şeffaflık ve sızdırmazlık gerçekleştirin.
         1. Numuneleri gradyan etanole batırın: %75, %85, %95 ve %100 etanol (I) her biri 2-3 saniye. % 100 etanol (II) içinde 1 dakika bekletin ve her seferinde 1 dakika boyunca ksilen 2x içinde bekletin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, doku dilimlerinin yüzeyine nötr sakız damlatın ve kabarcık oluşumunu önlemek için mümkün olduğunca eşit şekilde yayın. Kapatın ve 400x'te mikroskop altında gözlemleyin.
      7. Akciğer bölümü başına 10 rastgele alan seçin. Bir patoloğa alveolar ödem, kanama ve nötrofil infiltrasyonu gibi patolojik değişiklikleri 0 (normal) ile 4 (ciddi hasar) arasında puanlamasını isteyin. Değerlendirme için toplam puanı kullanın.
   4. Batı lekeleme
      1. Nükleer protein ekstraksiyon kiti talimatlarına göre akciğer dokusundan nükleer proteinleri çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre BCA yöntemini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
      2. Protein yükleme numunelerini, numune başına 50 μg protein yüklenmiş olarak hazırlayın. SDS-PAGE ayırma jeli (% 10) ve istifleme jeli (% 3) hazırlayın. 45 dakika boyunca 80 V'ta elektroforez gerçekleştirin, ardından numuneler ayırma jeline girdikten sonra proteini 60 dakika boyunca 110 V'ta PVDF membranına aktarın.
      3. Proteinleri bir zara aktarın ve 60 dakika boyunca bloke edin. Birincil antikorlarla (bakınız Malzeme Tablosu, 1:1000) gece boyunca 4 °C'de inkübe edin, ardından ikincil antikor (bakınız Malzeme Tablosu, 1:1000) 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
      4. Membranı TBST ile yıkayın ve görselleştirme için ECL kullanın. Karanlık bir odada, hazırlanan reaktifleri bir PVDF membranına ekleyin ve çalkalama ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. ECL reaktifleri, zar üzerindeki biyomoleküllerle etkileşime girerek, floresan görüntüleme cihazları tarafından kaydedilen güçlü kemilüminesans reaksiyonları üretir.
      5. Bir görüntü analiz sistemi, Bant Niceleme Yöntemi kullanarak protein bantlarının gri tonlama değerini analiz edin (Bant dansitometrisini analiz etmek için kullanılan sistem hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.
   5. İstatistiksel analiz
      1. İstatistiksel analiz için SPSS 26.0 programını kullanın. Birden çok grubun ortalamalarını karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA ve ikili karşılaştırmalar için LSD-t testlerini kullanın. 0,05 < bir p değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Shikonin'in terapötik potansiyelini değerlendirmek için, önce 7 günlük bir süre boyunca septik farelerde sağkalım üzerindeki etkisini değerlendirdik. Shikonin ile tedavi, doza bağlı bir şekilde sağkalım oranlarını iyileştirdi (Şekil 1).

Sepsiste akciğer hasarının yaygın olarak görülmesi göz önüne alındığında, farelerde pulmoner ödemi de değerlendirdik. Pulmoner ödem, akciğer ıslak-kuru ağırlık (W/D) oranı ölçülerek değerlendirildi. W/D oranı, model grubunda sahte gruba göre anlamlı olarak yüksekti (p < 0.05). Shikonin tedavisi bu etkiyi doza bağlı bir şekilde hafifletti. Yüksek doz grubu, düşük doz grubuna göre akciğer ödeminde daha önemli bir azalma göstermiştir (p < 0.05) (Şekil 2).

Shikonin'in akciğer dokusu üzerindeki koruyucu etkisini daha da doğrulamak için histopatolojik analiz yapıldı. Sahte grup normal akciğer yapısı gösterirken, CLP model grubu geniş ödem, kanama ve inflamatuar hücre infiltrasyonu dahil olmak üzere belirgin doku hasarı gösterdi. Azalan W/D oranı ile tutarlı olarak, shikonin tedavisi bu patolojik değişiklikleri doza bağlı bir şekilde hafifletmiştir. Yüksek doz grubundaki fareler, CLP model grubuna kıyasla önemli ölçüde daha az histopatolojik anormallik sergiledi ve patoloji skorları düşük doz grubundakilerden önemli ölçüde daha düşüktü (p < 0.05; Şekil 3).

Hem inflamasyon hem de hipoksi, sepsis kaynaklı akciğer hasarının ana itici güçleri olduğundan, daha sonra bu yollarda yer alan anahtar proteinlerin ekspresyon seviyelerini inceledik. Western blot analizi, CLP model grubunun TNF-αand, IL-6 ve VEGF düzeylerini önemli ölçüde yüksek olduğunu ve bunun inflamatuar bir yanıtı gösterdiğini ortaya koydu (Şekil 4). Ek olarak, HIF-1α ve VEGF, model grubunda yüksek oranda eksprese edildi ve bu da artmış hipoksiyi doğruladı (Şekil 5). Shikonin tedavisi, bu proteinlerin ekspresyonunu doza bağlı bir şekilde önemli ölçüde azalttı, yüksek doz grubu, düşük doz grubuna kıyasla HIF-1α, VEGF, TNF-α ve IL-6'nın daha fazla baskılandığını gösterdi (p < 0.05; Şekil 4 ve Şekil 5). Bu moleküler bulgular, septik farelerde hem hipoksi hem de iltihabı modüle etme yeteneğini vurgulayarak shikonin'in koruyucu rolünü daha da desteklemektedir.

Şekil 1: Farklı septik fare grupları arasındaki sağkalım oranlarının karşılaştırılması. Fareler gruplandırıldı ve ilaç tedavisi ile birlikte CLP'ye tabi tutuldu ve hayatta kalma durumlarını kaydetmek için hayatta kalma eğrileri çizildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Septik farelerde Shikonin'in akciğer W/D oranı üzerindeki etkileri. Fareler gruplandırıldı ve 24 saat boyunca ilaç tedavisi ile birlikte CLP'ye tabi tutuldu, ardından akciğer W / D Oranı kaydedildi. ^AP < SHAM grubuna göre 0.05, ^bp < sepsis grubuna göre 0.05 ve düşük doz tedavi grubuna göre ^CP < 0.05 olarak bulundu. Hata çubukları standart sapmayı gösterirken, birden fazla grubun ortalama değerlerini karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ikili karşılaştırma için LSD-t testi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gruplar arasında akciğer dokusu patolojisindeki mikroskobik değişiklikler. Fareler gruplandırıldı ve 24 saat boyunca ilaç tedavisi ile CLP'ye tabi tutuldu. Akciğer dokusu daha sonra HE boyaması için toplandı. Sol panel, temsili görüntüleri 400x büyütmede görüntüler (ölçek çubuğu = 100 μm). Yaygın ödem, kanama ve inflamatuar hücre infiltrasyonu ok ile gösterildiği gibi model grubunda görülebilir. Sağdaki panel, karşılık gelen histopatolojik skorları sunar. Sahte grupla karşılaştırıldığında, fark anlamlıydı (p 0.05). Hata çubukları standart sapmayı gösterirken, birden fazla grubun ortalama değerlerini karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ikili karşılaştırma için LSD-t testi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farelerin akciğer dokusunda TNF-α ve IL-6'nın protein ekspresyon seviyeleri. Fareler gruplandırıldı ve 24 saat boyunca ilaç tedavisi ile birlikte CLP'ye tabi tutuldu, daha sonra belirtilen proteinlerin ekspresyonu akciğer dokusunda tespit edildi. Sahte grup ile karşılaştırıldığında, model grubunda TNF-α ekspresyonu anlamlı olarak artmıştır (^gp < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, düşük doz tedavi grubunda TNF-α ekspresyonu anlamlı olarak azalmıştır (^hp < 0.05). Düşük doz tedavi grubu ile karşılaştırıldığında, yüksek doz tedavi grubunda TNF-α ekspresyonu azaldı, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (ⁱp > 0.05). Ek olarak, sahte grup ile karşılaştırıldığında, model grubundaki IL-6 ekspresyonu anlamlı derecede artmıştır (^jp < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, düşük doz tedavi grubunda IL-6 ekspresyonu önemli ölçüde azalmıştır (^kp < 0.05). Düşük doz tedavi grubu ile karşılaştırıldığında, yüksek doz tedavi grubunda IL-6 ekspresyonu azaldı, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (^lp > 0.05). Hata çubukları standart sapmayı gösterirken, birden fazla grubun ortalama değerlerini karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ikili karşılaştırma için LSD-t testi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Farelerin akciğer dokusunda HIF-1α ve VEGF'nin protein ekspresyon seviyeleri. Fareler gruplandırıldı ve 24 saat boyunca ilaç tedavisi ile birlikte CLP'ye tabi tutuldu, daha sonra belirtilen proteinlerin ekspresyonu akciğer dokusunda tespit edildi. Sahte grup ile karşılaştırıldığında, model grubunda HIF-1α ekspresyonu anlamlı olarak artmıştır (^mp < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, düşük doz tedavi grubunda HIF-1α ekspresyonu önemli ölçüde azalmıştır (ⁿp < 0.05). Düşük doz tedavi grubu ile karşılaştırıldığında, yüksek doz tedavi grubunda HIF-1α ekspresyonu azaldı, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (^op > 0.05). Ek olarak, sham grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunda VEGF ekspresyonu anlamlı olarak artmıştır (^pp < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, düşük doz tedavi grubunda VEGF ekspresyonu önemli ölçüde azalmıştır (^qp< 0.05). Düşük doz tedavi grubu ile karşılaştırıldığında, yüksek doz tedavi grubunda VEGF ekspresyonu azaldı, ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi ( ^rp > 0.05). Hata çubukları standart sapmayı gösterirken, birden fazla grubun ortalama değerlerini karşılaştırmak için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ikili karşılaştırma için LSD-t testi kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Farelerin hayatta kalma oranı.

Sepsis araştırmaları için altın standart model olan CLP modeli, bu deneyde önemli bir adımdır çünkü CLP, insan sepsisinin karmaşıklığını diğer birçok modelden daha iyi taklit eder. Sepsis ile ilişkili ALI, yüksek mortalite oranları ve mevcut tedavilerin sınırlı etkinliği nedeniyle kritik bir klinik zorluk olmaya devam etmektedir ^14,15. Çalışmamız, ilk kez, shikonin'in bir CLP modeli oluşturarak hem HIF-1α hem de inflamatuar yanıtları modüle ederek septik farelerde sağkalımı önemli ölçüde iyileştirdiğini göstermektedir.

KLP'ye bağlı mortalite, iğne boyutu, bağlanan çekumun uzunluğu ve çekum ponksiyonlarının sayısı gibi çeşitli teknik parametrelere bağlıdır. İğnenin çok ince olması veya iğne sayısının yeterli olmaması sistemik bir sepsis reaksiyonuna neden olmaz. İğne çok kalınsa veya iğnenin kullanılma sayısı çok fazlaysa, fareler ölüme eğilimlidir ve bir sonraki deneye devam edemezler. Bu nedenle, tekrarlanan teknik değişiklikler ve sorun giderme yoluyla, çekumun ucundan yaklaşık 1 cm mesafede ligasyon yaptığımız sonucuna vardık. Çekumun ucunu delmek ve bağlamak için 21G'lik bir iğne kullandık ve çekuma geri sokmadan önce künt uçlu oftalmik forseps kullanarak delinme bölgesinden az miktarda bağırsak içeriğini nazikçe sıktık. CLP'den sonraki 6 saatlik dönemde, farelerin uyuşukluk, yavaş hareket, dik saç, göz salgıları ve ishal gibi sepsis semptomları gösterip göstermediğini gözlemleyin. Gözlemler, sepsis yönetiminde TCM'nin terapötik potansiyeli üzerine yapılan önceki araştırmalarla tutarlı olan yüksek doz shikonin grubunda gözlenen doza bağlı bir sağkalım yararını göstermektedir¹⁶. Shikonin'in sepsis kaynaklı ALI^5,17 için mevcut tedavilere değerli bir yardımcı veya alternatif olarak hizmet etmesi muhtemeldir.

Daha önce de belirttiğimiz gibi, bu model sepsis^18'in patolojik mekanizması için gerçek bir simülasyon platformu sağlayabilir. Çünkü çoklu bakteriyel enfeksiyonlar, dinamik bağışıklık tepkileri, çoklu organ fonksiyon bozukluğu ve daha fazlası dahil olmak üzere insan sepsisinin temel özelliklerini simüle edebilir. Ek olarak, CLP modeli, antibiyotiklerin, immünomodülatörlerin ve adjuvan tedavilerin (C vitamini ve hidrokortizon gibi) etkinliğinin doğrulanması gibi mevcut tedavi yöntemlerinin doğrulanmasını ve iyileştirilmesini optimize ederek dozaj ve uygulama zamanlamasını optimize etmeye yardımcı olabilir. Model aynı zamanda mevcut klinik zorlukların biyolojik temelini, antibiyotik direnci sorunlarını, klinik translasyonel araştırmaların standardizasyonunu, yapay zekayı, büyük veri analizini ve diğer yönleri ortaya çıkarması açısından da büyük önem taşımaktadır.

Bu teknolojinin gelecekteki uygulamaları aşağıdaki hususları içerir. İlk olarak, yeni ilaçların araştırılması ve geliştirilmesi ve gelecekte histon tedavilerinin geliştirilmesini potansiyel olarak yönlendirmek gibi tedavi stratejilerinin doğrulanması. İkinci olarak, PD-1/PD-L1 sinyal yolu inhibitörlerinin uygulanması gibi immünomodülatör tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak gibi immün mekanizmaların ve konakçı tepkilerinin derinlemesine analizi¹⁹. Üçüncüsü, CLP modelleri tarafından üretilen verilerin birleştirilmesi gibi çoklu omik ve yapay zekanın entegrasyonu, makine öğrenimi yoluyla gelecekte sepsis için tahmine dayalı modeller oluşturmak için kullanılabilir. Dördüncüsü, mikrobiyomun araştırılması ve enfeksiyon kontrolü. Gelecekte, bu model dışkı mikrobiyotası nakli ve faj tedavisi gibi yeni anti-enfeksiyon stratejilerinin fizibilitesini araştırmak için kullanılabilir.

CLP modeli, sepsisi indüklemek için iyi bilinen bir yöntem olmasına rağmen, insan sepsisinin karmaşıklığını tam olarak kopyalayamayabilir ve bulgularımızın genelleştirilebilirliğini sınırlayabilir. Gelecekteki çalışmalar daha büyük örneklem boyutlarını içermeli ve bu bulguları doğrulamak için shikonin'in farklı sepsis modellerindeki etkilerini araştırmalıdır. Ayrıca, diğer sinyal yolakları ile potansiyel etkileşimler de dahil olmak üzere, ilgili moleküler mekanizmaların daha derin bir araştırması, shikonin'in tam terapötik potansiyelini anlamak için çok önemli olacaktır.

Sonuç olarak, çalışmamız shikonin'i bir CLP fare modeli aracılığıyla sepsis kaynaklı ALI'nin tedavisi için umut verici bir aday olarak tanımlamaktadır. Shikonin, hem hipoksik hem de enflamatuar yolları hedef alarak sepsis hastaları için klinik sonuçları iyileştirme potansiyeline sahiptir. Bu çalışma sadece sepsis ile ilişkili akciğer hasarının mekanizmalarına yeni bakış açıları sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda geleneksel Çin tıbbının modern terapötik stratejilerdeki potansiyel rolünü de vurguluyor.

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Çalışma, Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi (Y2020976) tarafından desteklenmiştir.