Shikonin 对脓毒症所致急性肺损伤小鼠 HIF-1α/VEGF 信号通路的影响

该方案旨在评估 shikonin 在缓解小鼠脓毒症引起的急性肺损伤方面的有效性。通过靶向 HIF-1α/VEGF 通路，该研究调查了不同剂量的 shikonin 如何影响存活率、肺部病理和炎症标志物的表达，突出了其潜在的治疗益处。

脓毒症通常会导致急性肺损伤 （ALI），这是一种高死亡率并发症。HIF-1α/VEGF 通路在脓毒症中起关键作用，而 shikonin 是一种具有抗炎特性的天然化合物，可能通过靶向该通路来减轻肺损伤。将 Balb/c 小鼠随机分为 4 组：假手术组、模型组、低剂量治疗组、高剂量治疗组。假手术组行剖腹手术无盲肠结扎穿刺术 （CLP），模型组行 CLP 诱导脓毒症相关急性肺损伤。建模后，低剂量和高剂量治疗组分别以 12.5 mg/kg 和 50 mg/kg 的剂量管饲法接受紫草素，每天一次，持续 14 天。监测小鼠的 7 天生存率。苏木精和伊红 （HE） 染色评估肺组织病理，测量肺湿/干 （W/D） 重量比，Western blot 检测肺组织中 HIF-1α 、 VEGF 、 TNF-α 和 IL-6 的表达。Shikonin 显着提高了败血症小鼠的存活率，在高剂量组中观察到的效果最大 （p < 0.05）。与模型组相比，紫草素治疗组的肺 W/D 比值和组织损伤以剂量依赖性方式显著降低。此外，紫草素显着下调 HIF-1α 、 VEGF 、 TNF-α 和 IL-6 的表达，其中高剂量组的表达降低最明显 （p < 0.05）。Shikonin 可能通过抑制 HIF-1α 的表达和减少相关炎症因子的产生来减轻脓毒症小鼠的急性肺损伤。

脓毒症是由感染引发的严重全身炎症反应。¹ 它通常会导致多器官功能障碍，并且随着病情的发展可能会危及生命。² 尽管使用了机械通气和支持性护理等疗法，脓毒症相关 ALI 的死亡率仍然很高，达到 30%-40%³。这些治疗主要针对症状而不是根本原因，从而限制了它们的整体效果。因此，确定针对肺损伤原因的新治疗方法可以显着改善脓毒症患者的预后。

最近的研究发现，缺氧诱导因子-1α （HIF-1α） 是脓毒症诱导的 ALI 进展的关键调节因子 ^4,5。脓毒症期间，HIF-1α 在肺组织中积累，驱动下游基因的表达，从而加剧炎症和组织损伤⁶。这个过程显着导致肺损伤恶化。因此，靶向 HIF-1α 信号通路为减轻脓毒症诱导的 ALI 中的炎症和低氧反应提供了一种有前途的方法。

在寻找更有效的治疗方法的过程中，中医 （TCM） 提供了宝贵的见解 ^7,8。Shikonin 是从 Lithospermum erythrorhizon⁷ 中提取的蒽醌化合物。它显示出显着的抗炎⁹ 、抗菌¹⁰ 和抗肿瘤作用¹¹。Shikonin 可以减轻脂多糖 （LPS） 诱导的肺损伤，表明其在肺部疾病中具有潜在的治疗作用¹²。同时，一些研究还提出，紫草素可能通过调节单核巨噬细胞系统，平衡促炎和抗炎反应来减轻脓毒症引起的氧化损伤。然而，紫草素在脓毒症诱导的 ALI 中保护作用背后的机制尚不完全清楚。这代表了当前研究中的一个关键差距。

在这项研究中，我们旨在探索 shikonin 在使用盲肠结扎和穿刺 （CLP） 的脓毒症诱导的 ALI 小鼠模型中的保护作用。CLP 技术在脓毒症研究中发挥着重要作用，因为它可以模拟复杂的全身炎症反应和多器官功能障碍，使其适用于评估新治疗策略的有效性。与传统的 LPS 注射方法相比，CLP 技术相对更具临床相关性：它模拟肠道菌群易位引起的全身炎症反应，这更接近临床脓毒症的病理过程。可分级控制：通过调整结扎长度和穿孔大小，可控制病情的严重程度，适用于脓毒症的整个研究。此外，它可以模拟多器官功能障碍和细胞因子反应的类似动态变化。通过研究紫草素在调节 HIF-1α/VEGF 信号通路中的作用，我们希望为解决脓毒症相关肺损伤潜在机制的新治疗策略提供见解，从而可能改善临床结果。

该方案获得了温州医科大学实验动物中心的批准。本研究使用雄性 C57Bl/6 小鼠 （5-6 个月大;20-25 g）。材料 表中列出了主要试剂和所用设备的详细信息。

1. 脓毒症小鼠模型的制备

1. 在 25 °C 的恒定温度、50% 湿度和 12 小时的光照/黑暗循环下，家鼠。
2. 7 天适应期后，将小鼠随机分为四组：假手术组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组，每组 20 只小鼠。
3. 根据先前研究¹³ 的参考文献，用浓度为 12.5 mg/kg 的紫嘌呤治疗低剂量组 14 天，用浓度为 50 mg/kg 的高剂量组治疗 14 天。假手术组进行剖腹手术、盲肠牵引、复位和闭合，无需结扎或穿刺，用相同剂量的生理盐水治疗 14 天。脓毒症组的实验步骤如下。
4. 禁食过夜后（允许加水），在整个过程中在无菌条件下用戊巴比妥钠 （40-80 mg/kg） 麻醉小鼠。在眼睛上涂抹兽医药膏，以防止麻醉时干燥。
5. 检查适当的麻醉是否减慢呼吸频率，肌肉紧张降低，以及用止血钳轻轻夹住下肢时没有明显的压力反应。
6. 用 75% 乙醇 3 倍进行消毒。在小鼠腹部的左中位置做一个约 1 cm 的纵向切口，分层切开皮肤、筋膜和肌肉，露出腹腔。
7. 用双手钝头眼镊，轻轻探查腹腔，找到并释放小鼠的盲肠，在距盲肠末端约 1 cm 处结扎。
8. 用 21G 针刺扎盲肠末端，用钝头眼镊子从穿刺部位轻轻挤出少量肠内容物，然后将其取出到盲肠中。
9. 用 1 mL 0.9% 氯化钠溶液进行皮下液体复苏。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。我们注意到，接受手术的动物在完全康复之前不会被送回其他动物的陪伴处。
10. CLP 建模 7 天后，对安乐死进行过度麻醉。
    注意：由于紫嘌呤可能对皮肤、呼吸道和消化道有刺激作用，并且对水生生物毒性大，环境污染大，实验期间请做好个人防护。

2. 动物模型的评估

1. 小鼠生存观察
   1. 如上所述进行动物处理。记录建模后 1 周内的死亡率以进行统计分析。一些小鼠在安乐死前没有脓毒症就死亡，而 CLP 模型小鼠有一定的死亡率（表 1）。
   2. 肺湿干重比测量
      1. 建模 24 小时后，按照步骤 1.4-1.5 再次麻醉小鼠。
      2. 在小鼠锁骨中线左侧做一个约 1 cm 的纵向切口，用手术剪刀和镊子去除皮肤、筋膜和肌肉层，露出胸腔。
      3. 取出左肺并排出表面液。测量湿重，然后在 80 °C 烘箱中干燥 72 小时至恒重，以获得干重。
      4. 计算肺含水量为：
         肺含水量 = （湿重 - 干重） / 湿重 x 100%。
   3. 肺组织的组织病理学比较
      1. 在指定的时间点，按照上述步骤 2.2 中的说明收集左肺。将肺固定在 10% 中性甲醛中，将其嵌入石蜡中，并以 5 μm 的厚度切片。
      2. 用二甲苯脱蜡肺 2 次，每次 5-10 分钟。以 100%、95%、85% 和 75% 的浓度进行系列乙醇再水化，每个梯度持续 3 分钟。在蒸馏水中浸泡 2 分钟。
      3. 用大约 100 mL 苏木精溶液染色 10 分钟，然后用蒸馏水冲洗以去除任何漂浮的颜色。
      4. 加入约 70 mL 的分化溶液并浸泡 30 秒。然后，在自来水中浸泡 2 次，每次 3-5 分钟。
      5. 滴加约 100 mL 伊红染料溶液 2 分钟。倒出多余的染料溶液并按下所述快速脱水。
      6. 如下所述执行脱水、透明和密封。
         1. 将样品浸泡在梯度乙醇中：75%、85%、95% 和 100% 乙醇 （I） 各 2-3 秒。在 100% 乙醇 （II） 中浸泡 1 分钟，每次在二甲苯中浸泡 2 次 1 分钟。使用吸管或滴管将中性口香糖滴在组织切片的表面，并尽可能均匀地涂抹，以避免形成气泡。密封并在 400 倍显微镜下观察。
      7. 每个肺切片选择 10 个随机视野。请病理学家对病理变化进行评分，例如肺泡水肿、出血和中性粒细胞浸润，从 0（正常）到 4（严重损伤）。使用总分进行评估。
   4. Western 印迹
      1. 根据核蛋白提取试剂盒说明从肺组织中提取核蛋白，并按照制造商的说明使用 BCA 方法测量蛋白质浓度。
      2. 制备蛋白质上样样品，每个样品上样 50 μg 蛋白质。制备 SDS-PAGE 分离凝胶 （10%） 和浓缩凝胶 （3%）。在 80 V 下进行电泳 45 分钟，然后在样品进入分离凝胶后，在 110 V 下将蛋白质转移到 PVDF 膜上 60 分钟。
      3. 将蛋白质转移到膜上并封闭 60 分钟。与一抗（参见 材料表，1：1000）在 4 °C 下孵育过夜，然后二抗（参见 材料表， 1：1000）在 37 °C 下孵育 2 小时。
      4. 用 TBST 洗涤膜并使用 ECL 进行可视化。在暗室中，将制备的试剂添加到 PVDF 膜上，并进行振荡和荧光成像。ECL 试剂与膜上的生物分子相互作用，产生强化学发光反应，这些反应由荧光成像仪器记录下来。
      5. 使用图像分析系统，条带定量法分析蛋白质条带的灰度值（有关用于分析条带密度测定的系统的详细信息，请参阅 NIH 图像）。
   5. 统计分析
      1. 使用 SPSS 26.0 进行统计分析。使用单因素方差分析比较多个组的均值，并使用 LSD-t 检验进行成对比较。将 p 值< 0.05 视为统计显著性。

为了评估 shikonin 的治疗潜力，我们首先评估了它在 7 天内对脓毒症小鼠生存的影响。shikonin 治疗以剂量依赖性方式提高了存活率（图 1）。

鉴于脓毒症中肺损伤的广泛发生，我们还评估了小鼠的肺水肿。通过测量肺湿重干重 （W/D） 比值来评估肺水肿。与假手术组相比，模型组的 W/D 比显着升高 （p < 0.05）。Shikonin 治疗以剂量依赖性方式减轻了这种影响。高剂量组比低剂量组表现出更显着的肺水肿减轻 （p < 0.05）（图 2）。

为了进一步验证 shikonin 对肺组织的保护作用，进行了组织病理学分析。假手术组肺结构正常，CLP 模型组组织损伤明显，包括广泛水肿、出血和炎性细胞浸润。与降低的 W/D 比率一致，紫草素治疗以剂量依赖性方式减轻了这些病理变化。与 CLP 模型组相比，高剂量组小鼠的组织病理学异常显著减少，病理评分显著低于低剂量组 （p < 0.05; 图 3）。

由于炎症和缺氧都是脓毒症诱导的肺损伤的主要驱动因素，因此我们接下来检查了这些通路中涉及的关键蛋白的表达水平。Western blot 分析显示，CLP 模型组的 TNF-α 和 IL-6 、 VEGF 水平显著升高，表明存在炎症反应（图 4）。此外，HIF-1α 和 VEGF 在模型组中高表达，证实缺氧增加（图 5）。Shikonin 治疗以剂量依赖性方式显着降低这些蛋白质的表达，与低剂量组相比，高剂量组显示出对 HIF-1α、VEGF、TNF-α 和 IL-6 的更大抑制 （p < 0.05; 图 4 和 图 5）。这些分子发现进一步支持了 shikonin 的保护作用，突出了它调节脓毒症小鼠缺氧和炎症的能力。

图 1：不同败血症小鼠组之间的存活率比较。 对小鼠进行分组并接受 CLP 和药物治疗，并绘制生存曲线以记录其生存状态。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：Shikonin 对败血小鼠肺 W/D 比值的影响。对小鼠进行分组，进行 CLP 和药物治疗 24 h，然后记录肺 W/D 比值。^AP < 0.05 与假手术组相比，^BP <败血症组 0.05，C P < 0.05 与低剂量治疗组相比。误差线显示标准差，单因素方差分析比较多组均值，LSD-t 检验成对比较。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：各组肺组织病理学的微观变化。 对小鼠进行分组并接受 CLP 药物治疗 24 小时。然后收获肺组织用于 HE 染色。左面板以 400 倍放大倍率（比例尺 = 100 μm）显示代表性图像。如箭头所示，在模型组中可见广泛的水肿、出血和炎性细胞浸润。右侧面板显示相应的组织病理学评分。与假手术组相比，差异显著 （p 0.05）。误差线显示标准差，单因素方差分析比较多组均值，LSD-t 检验成对比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：小鼠肺组织中 TNF-α 和 IL-6 的蛋白表达水平。 将小鼠分组并进行 CLP 和药物治疗 24 小时，然后在肺组织中检测指示蛋白的表达。与假手术组相比，模型组 TNF-α 表达显著升高 （^gp < 0.05）。与模型组相比，低剂量治疗组 TNF-α 表达显著降低 （^hp < 0.05）。与低剂量治疗组相比，高剂量治疗组 TNF-α 的表达降低，但差异无统计学意义 （ⁱp > 0.05）。此外，与假手术组相比，模型组 IL-6 的表达显著增加 （^jp < 0.05）。与模型组相比，低剂量治疗组 IL-6 表达显著降低 （^kp < 0.05）。与低剂量治疗组相比，高剂量治疗组 IL-6 的表达降低，但差异无统计学意义 （^lp > 0.05）。误差线显示标准差，单因素方差分析比较多组均值，LSD-t 检验成对比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：小鼠肺组织中 HIF-1α 和 VEGF 的蛋白表达水平。 将小鼠分组并进行 CLP 和药物治疗 24 小时，然后在肺组织中检测指示蛋白的表达。与假手术组相比，模型组 HIF-1α 的表达显著升高 （^mp < 0.05）。与模型组相比，低剂量治疗组 HIF-1α 的表达显著降低 （ⁿp < 0.05）。与低剂量治疗组相比，高剂量治疗组 HIF-1α 的表达降低，但差异无统计学意义 （^op > 0.05）。此外，与假手术组相比，模型组 VEGF 的表达显著增加 （^pp < 0.05）。与模型组相比，低剂量治疗组 VEGF 表达显著降低 （^qp < 0.05）。与低剂量治疗组相比，高剂量治疗组 VEGF 的表达降低，但差异无统计学意义 （^rp > 0.05）。误差线显示标准差，单因素方差分析比较多组均值，LSD-t 检验成对比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：小鼠的存活率。

作为脓毒症研究的金标准模型，CLP 模型是该实验的关键步骤，因为 CLP 比许多其他模型更能模拟人类脓毒症的复杂性。脓毒症相关 ALI 仍然是一个关键的临床挑战，因为它的死亡率高且当前治疗的有效性有限^14,15。我们的研究首次证明，紫草素通过创建 CLP 模型调节 HIF-1α 和炎症反应，显著提高脓毒症小鼠的存活率。

CLP 诱导的死亡率取决于几个技术参数，例如针头大小、结扎的盲肠长度和盲肠穿刺的次数。如果针头太细或针数不够，不会引起全身性败血症反应。如果针头太粗或使用针头的次数过多，小鼠容易死亡，无法进行下一次实验。因此，通过反复的技术修改和故障排除，我们得出结论，我们在距盲肠末端约 1 cm 的距离处进行了结扎。我们用 21G 针刺穿并结扎盲肠末端，用钝头眼镊子从穿刺部位轻轻挤出少量肠内容物，然后将其重新引入盲肠。在 CLP 术后 6 h 期间，观察小鼠是否出现嗜睡、运动缓慢、毛发勃起、眼分泌物和腹泻等败血症症状。观察结果表明，在高剂量紫草素组中观察到剂量依赖性生存获益，这与之前关于中医在脓毒症管理中的治疗潜力的研究一致¹⁶。Shikonin 极有可能作为当前脓毒症诱导的 ALI 疗法的有价值的辅助或替代疗法 ^5,17。

正如我们前面提到的，该模型可以为脓毒症¹⁸ 的病理机制提供一个真实的模拟平台。因为它可以模拟人类脓毒症的关键特征，包括多种细菌感染、动态免疫反应、多器官功能障碍等。此外，CLP 模型可以优化现有治疗方法的验证和改进，例如验证抗生素、免疫调节剂和辅助疗法（如维生素 C 和氢化可的松）的疗效，有助于优化剂量和给药时间。该模型在揭示现有临床挑战的生物学基础、抗生素耐药性问题、临床转化研究标准化、人工智能、大数据分析等方面也具有重要意义。

该技术的未来应用包括以下几个方面。首先，新药的研发和治疗策略的验证，例如未来可能推动组蛋白疗法的发展。其次，深入分析免疫机制和宿主反应，例如协助开发免疫调节疗法，例如 PD-1/PD-L1 信号通路抑制剂的应用¹⁹。第三，多组学和人工智能的整合，例如结合 CLP 模型生成的数据，可用于通过机器学习构建未来脓毒症的预测模型。第四，微生物组和感染控制的探索。未来，该模型可用于探索新的抗感染策略的可行性，例如粪便微生物群移植和噬菌体疗法。

尽管 CLP 模型是一种成熟的诱发脓毒症的方法，但它可能无法完全复制人类脓毒症的复杂性，从而限制了我们研究结果的普遍性。未来的研究应包括更大的样本量，并探索 shikonin 在不同脓毒症模型中的影响，以验证这些发现。此外，更深入地探索所涉及的分子机制，包括与其他信号通路的潜在相互作用，对于理解 shikonin 的全部治疗潜力至关重要。

总之，我们的研究通过 CLP 小鼠模型确定 shikonin 是治疗脓毒症诱导的 ALI 的有前途的候选者。通过靶向缺氧和炎症途径，shikonin 有可能改善脓毒症患者的临床结果。这项工作不仅为脓毒症相关肺损伤的机制提供了新的见解，还强调了传统中医在现代治疗策略中的潜在作用。

作者声明他们没有利益争夺。

该研究得到了温州市科技项目 （Y2020976） 的支持。