Ultrason Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Sıçan Beyin Mikrovaskülatürünün İki Boyutlu Süper Çözünürlüklü Görselleştirilmesi

Burada, sıçanlarda beyin mikrovaskülatürünü görüntülemek için 12.5 μm uzamsal çözünürlüğe ulaşan ultrason lokalizasyon mikroskobu (ULM) için bir protokol açıklıyoruz. Kan akış yönünün ve hızının ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlayarak serebral dolaşım ve vasküler bozukluklarla ilgili çalışmaları ilerletmek için güçlü bir araç sunar.

Serebral mikrovaskülatür, beyin fonksiyonlarını sürdürmek için gerekli olan karmaşık bir damar ağı oluşturur. İnme, Alzheimer hastalığı, gliomlar ve vasküler demans gibi hastalıklar mikrovasküler sistemi derinden bozabilir. Ne yazık ki, mevcut tıbbi görüntüleme yöntemleri bu ölçekte yalnızca dolaylı gözlemler sunmaktadır. Optik mikroskopiden ilham alan ultrason lokalizasyon mikroskobu (ULM), penetrasyon derinliği ve uzamsal çözünürlük arasındaki klasik dengenin üstesinden gelir. Enjekte edilen mikro kabarcıkları (MB'ler) alt dalga boyu hassasiyetiyle lokalize ederek ve izleyerek, mikrometre ölçeğinde vasküler ve hız haritaları oluşturulabilir. Burada, ticari bir ultrason platformu kullanarak sıçanlarda in vivo olarak beyin mikrovaskülatürünün süper çözünürlüklü görüntülenmesi için sağlam bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, mikrovasküler mimariyi yeniden yapılandırarak ve kan akış yönü ve hızı hakkında ayrıntılı bilgi sağlayarak 12,5 μm uzamsal çözünürlüğe ulaşır ve serebral mikrosirkülasyon anlayışımızı büyük ölçüde geliştirir. Protokol, nörovasküler hastalıkların erken teşhisi ve tedavisi için güçlü bir araç sunan sıçan hastalığı modellerine genişletilebilir.

Kılcal damarlar, arteriyoller ve venüllerden oluşan serebral mikrovaskülatür, besin dağıtımını, oksijen değişimini ve atıkların uzaklaştırılmasını kolaylaştırarak beyin fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir ^1,2. Bu ağdaki bozulmalar, inme³, Alzheimer hastalığı⁴, gliomlar⁵ ve vasküler demans⁶ gibi nörolojik bozukluklarda rol oynar ve beyin fizyolojisinde bozulmalara yol açar. Mikrovasküler değişiklikler sıklıkla klinik semptomların başlamasından önce gelir ve bu da onları tanı ve tedavi müdahaleleri için kritik bir hedef haline getirir ^7,8. Hem yapısal hem de fonksiyonel düzeyde vasküler değişikliklerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, araştırma ve tedavi stratejilerini ilerletmenin anahtarıdır.

Bununla birlikte, serebral mikrovasküler sistemin görüntülenmesi, beynin küçük boyutu ve kısmen derin konumu nedeniyle özellikle zordur. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG)⁹ ve bilgisayarlı tomografi (BT)¹⁰ gibi geleneksel görüntüleme yöntemleri, büyük ölçekli vasküler değişiklikleri yakalamak için yeterli olsa da, küçük damarları görselleştirmek için çok kaba olan bir uzamsal çözünürlük (~100 μm) sunar. İki foton mikroskobu¹¹ gibi optik yöntemler, tek tek kılcal damarları görüntülemek için mükemmel uzamsal çözünürlük (1 μm'ye kadar) sağlar, ancak sınırlı görüş alanı ve penetrasyon derinliği (1 mm'den az) tarafından engellenir ve derin beyin bölgelerini görüntüleme yeteneklerini kısıtlar. Ultrason tabanlı bir teknik olan Doppler¹², gerçek zamanlı kan akışı değerlendirmesi sunarken, mikrovasküler detay için yetersiz olan 50-200 μm'lik bir çözünürlükle sınırlı kalır. Genel olarak, şu anda tek bir yöntem, serebral mikrovasküler görüntüleme için gerekli olan yüksek uzamsal çözünürlük ve yeterli beyin penetrasyonu ikili gereksinimini karşılamamaktadır.

Optik mikroskopi ^13,14'ten ilham alan ultrasonik lokalizasyon mikroskobu (ULM), tek tek enjekte edilen mikro kabarcıkların (MB'ler) yerini belirleyerek ve dalga boyu altı çözünürlük¹⁵ ile yer değiştirmelerini izleyerek ince yapıların mikron ölçeğinde görselleştirilmesine olanak tanır. Ultrason görüntülemede penetrasyon ve çözünürlük arasındaki klasik uzlaşmayı atlar¹⁶. Bu çalışma, ULM'yi canlı bir sıçan modelinde uygulamak ve böylece ticari olarak temin edilebilen ultrason platformu aracılığıyla beyin mikrovaskülatürünün süper çözünürlüklü görüntülemesini sağlamak için sağlam bir protokolü detaylandırmaktadır. Protokol sadece mikrovasküler yapının kapsamlı bir rekonstrüksiyonunu sağlamakla kalmaz, aynı zamanda konvansiyonel görüntüleme teknikleri ile mümkün olmayan kan akımının yönü ve hızı hakkında da detaylı bilgi sağlar. Protokol normal sıçanlarda doğrulanmış olmasına rağmen, sıçan hastalığı modellerine genişletilebilir ve farklı patolojik durumlarda özelleştirilmiş çalışmalar için olanaklar sunar.

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan deneyleri Fudan Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay No: 2022JS-004). Protokol, hayvanlara insancıl muamele edilmesini sağlamak için Fudan Üniversitesi'nin hayvan bakımı yönergelerini sıkı bir şekilde takip eder. Deneye başlamadan önce, sıçanlara çevresel iklimlendirme için 1 haftalık bir süre tanınmalı ve bu süre zarfında yeterli yem ve su sağlanmalıdır. Fotoperiyot, normal fizyolojik durumların korunmasını sağlamak için biyolojik ritimlerine uygun olarak dikkatlice düzenlenir. Deneyin sonunda, ötenazi aşırı dozda inhale izofluran kullanılarak gerçekleştirilir.

NOT: Deney düzeneği Şekil 1A-H'de gösterilmiştir.

1. ULM görüntüleme için hayvan hazırlığı

1. Anestezi
   1. 3 L / dk'lık bir akış hızında% 3.5 izofluran ve% 100 oksijen karışımı uygulayarak sıçanda anesteziyi indükleyin. Yaklaşık 4 dakika sonra, hayvanı hazneden çıkarın ve yüzüstü olarak önceden 37 °C'ye ısıtılmış bir görüntüleme platformuna yerleştirin. Anestezi derinliğini, sıçanın arka bacağının sert ayak parmağı tutamında bir geri çekilme refleksinin olmamasıyla onaylayın.
   2. Farenin burnunu anestezi sistemine bağlı bir solunum maskesine yerleştirin. 1,5 L / dak'lık bir akış hızında% 1.5 izofluran ve% 100 oksijen karışımı uygulayarak stabil bir sedasyon sağlayın.
      NOT: Anestezi yöntemleri ve dozajları kesinlikle üreticinin yönergelerine uygundur.
2. Ameliyat öncesi hayvan hazırlığı
   1. Farenin üst kesici dişlerini, alt çeneyi çubuğun altına yerleştirerek kesici çubuğun çentiğine sabitleyin. Sıçanın kafasını stabilize etmek için kulak çubuklarını, kulak kanalının biraz önünde ve üstünde (elle ele geçirilebilir) kemik girintisine yerleştirerek ve tüm kraniyal yüzeyin yatay kalmasını sağlayarak kullanın (Şekil 1A).
   2. Başın farklı kısımlarına az miktarda basınç uygulayarak fiksasyonun stabilitesini nazikçe araştırın. Orijinal konumundan herhangi bir hareket veya kayma olmadığından emin olun.
   3. Görüntüleme platformunun yüksekliğine ince ayar yapın ve engelsiz nefes almayı sağlamak için kesici çubuk çentiğini kaldırarak veya alçaltarak sıçan kafasının açısını titizlikle ayarlayın.
   4. Cerrahi ışıklara uzun süre maruz kalmaktan kaynaklanan hasarı önlemek ve anestezi altında gözleri nemli tutmak için farenin gözlerine eritromisin merhem veya% 30 gliserin solüsyonu uygulayın. Ek olarak, ameliyat sırasında boğulmayı önlemek için farenin dilini ağzın bir tarafına nazikçe çekmek için yuvarlak uçlu cımbız kullanın.
   5. Elde taşınan bir elektrikli kesme makinesi kullanın ve farenin kafasını tüylerin büyüme yönüne karşı (arkadan öne), tipik olarak kulakların arasında, gözlerden boynun başlangıcına kadar tıraş edin (Şekil 1B). Cerrahi kesiye hazırlanmak için traş edilen bölgeyi %1 iyot solüsyonu ile temizleyin.
3. Sıçan kraniyotomisi
   1. Sıçanın kafatasının sagital sütürü boyunca, oksipital kemiğin hemen arkasından başlayarak ve öne doğru yaklaşık 4 cm uzanan bir kesi yapın. Her iki taraftaki cildi geri çekmek için hemostatlar kullanın (Şekil 1C). İsteğe bağlı olarak, daha fazla cerrahi erişim sağlamak için kafatasının üzerindeki cildi tamamen çıkarın, ancak bu enfeksiyon riskini artırabilir.
   2. Periosteumu kafatasından çıkarmak için küçük bir makas kullanın ve sert kemik tabakasını tamamen açığa çıkarın.
   3. Kraniotomiyi, küresel bir matkap ucu ile donatılmış el tipi bir mini kraniyal matkap kullanarak gerçekleştirin (Şekil 1D). Kaba bir matkap ucuyla (2,5 mm çap) başlayın ve matkabı her seferinde 2-3 saniye uygulayarak kemiği aşındırmak için hafifçe vurun. Orta alandan başlayın ve yanlardaki daha kalın alanlara doğru ilerleyin.
      NOT: Kraniyotomi sırasında aşırı kanama kan dolaşımını etkiler ve kortikal alanlarda vasküler rekonstrüksiyon eksikliğine neden olur (Şekil 1H).
   4. Aşırı ısınmayı önlemek için her 2-3 saniyede bir duraklayın ve her 2 dakikada bir, kalıntıları soğutmak ve durulamak için bir şırınga kullanarak delme alanına yaklaşık 1 mL %0.9 NaCl enjekte edin.
   5. Beyaz kemik dokusu artık tutarlı bir şekilde bağlı görünmediğinde, daha ince bir matkap ucuna (1 mm çap) geçin. Merkezi ana kan damarları koyu kahverengi olarak net bir şekilde görünene ve çevresindeki alan pembe görünene ve mikro damarlar hafif kırmızımsı olarak görünene kadar delmeye devam edin (Şekil 1F).
      NOT: Son kraniyotomi aralığı Bregma +3 mm'den Lambda ön-arka ve kafatasının orta hattı boyunca her iki yanda 7 mm'dir (Şekil 1E). Ameliyatı tamamladıktan sonra, veri toplamaya başlamadan önce nispeten stabil fizyolojik koşulları sağlamak için farenin yaklaşık 10 dakika dinlenmesine izin verin.

2. Veri toplamadan önce kurulum

1. Kontrast madde hazırlama ve enjeksiyon
   1. Kontrast maddeyi (59 mg SF₆ gazı ve 25 mg liyofilize toz içeren bir şişe) resmi yönergelere göre 5 mL% 0.9 NaCl içinde çözün. Bir MB süspansiyonu oluşturmak için karışımı kuvvetlice çalkalayın. Süspansiyondaki SF_6'nın son konsantrasyonu 8 μL/mL'dir.
   2. MB süspansiyonunun 0.8 mL'sini 1 mL'lik bir şırıngaya çekin ve 100 μL / dk'da demlenmeye programlanmış bir mikroenjeksiyon pompasına sabitleyin.
   3. Sıçanın kuyruk damarına bağlı bir kateter ile 26 G'lik bir kalıcı iğne yerleştirin (Şekil 1G).
2. Görüntüleme düzleminin seçilmesi
   1. Beyin stereotaksik aletinin manipülatör koluna, bir kelepçe ile donatılmış merkezi frekansı 15.625 MHz olan bir prob monte edin (hareket aralığı: dikey, yatay ve 80 mm'ye kadar ön-arka; okuma hassasiyeti: 0.1 mm).
   2. Ultrason probunu doğrudan açıkta kalan sıçan beyninin üzerine yerleştirin. Optimum sinyal iletimini sağlamak için açıkta kalan beyin yüzeyine kuplaj jeli uygulayın.
   3. Yazılımın ana arayüzünü açın, bu da bir sıçan beyin atlasını motor hareket kontrol programlarıyla entegre eder.
   4. Bregma noktasını başlangıç noktası olarak ayarlayın. Yazılım arayüzü, probun yörüngesinin ve karşılık gelen sıçan beyin dilimi konumunun gerçek zamanlı bir görüntüsünü sağlar. Hedef görüntüleme düzlemini seçin; örneğin, Bregma -1 mm.

3. Veri toplama (Zamanlama ~ 20 dk)

NOT: Verasonics (ultrason sistemi), Vantage sistemi ile kullanım için orijinal MATLAB komut dosyalarını sağlar ve değiştirilmemiştir.

1. Yazılım başlatma
   1. MATLAB 2021a yazılımını başlatın.
   2. MATLAB 2021a'da veri toplama komut dosyasını girin.
   3. Kök dizinde, çalışma zamanı ortamını etkinleştirmek için komut satırı penceresine activate yazın.
2. Parametre konfigürasyonu ve RF sinyallerinin toplanması
   1. İlgilenilen bölgeyi etkili bir şekilde yakalamak için veri toplama başlangıç ve bitiş derinliklerini sırasıyla 5 ve 120 dalga boyunda ayarlayın.
      NOT: Ayarlamalar, görüntüleme düzlemine ve incelenen belirli hayvana göre yapılmalıdır.
   2. Görüntü çözünürlüğünü ve kontrastı artırmak için düzlem dalgası iletim direksiyon açılarını 2,5°'lik artışlarla -5° ila 5° arasında ayarlayın.
      NOT: Bu ayarları belirli görüntüleme gereksinimlerine ve hedef özelliklerine göre ayarlayın.
   3. İlgilenilen bölge için yeterli penetrasyon ve optimum sinyal-gürültü oranı sağlamak için iletim voltajını 20 V'a ayarlayın.
   4. Veri toplamayı başlatmak ve radyo frekansı (RF) sinyallerini .mat dosya biçiminde kaydetmek için Çalıştır düğmesine tıklayın.
      NOT: Sıçanın vücudunda düzgün ve stabil MB dağılımı sağlamak için mikroenjeksiyon pompasını başlattıktan 30 saniye sonra veri toplamaya başlayın.

4. Veri işleme ve analizi (Zamanlama ~ 8 saat)

1. Bilgi işlem
   1. RF verilerini MATLAB 2021a'ya aktarın ve Faz İçi ve Dörtlü (I/Q) veriler oluşturmak için demodüle edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. I/Q verilerinde hüzmeleme için Gecikme ve Toplam (DAS) algoritmasını kullanmak için Çalıştır düğmesine tıklayın (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Toplam 120.000 kare ile 800 Hz bileşik sonrası kare hızı.
2. ULM görüntüleme
   1. Arka plan gürültüsünü ve karmaşayı ortadan kaldırmak için Tekil Değer Ayrıştırması (SVD) uzay-zamansal filtreleme algoritmasını¹⁷ IQ verilerine uygulayın. Her 800 kare bir veri bloğu olarak saklanır ve SVD eşiği [15.800] olarak ayarlanır.
   2. Gauss uydurma algoritmasını¹⁸ kullanarak her MB'nin merkezini bulun.
   3. Konumlarına göre ardışık çerçeveler boyunca MB yörüngelerini izlemek için Kuhn-Munkres algoritmasını kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. MB yörüngelerinin sayısını görüntülemek için sıcak bir renk haritası ve mikro damar sistemi içindeki her bir konumda hesaplanan hızı haritalayarak akış hızını kodlamak için bir jet renk haritası kullanarak MB yörüngelerini 8x yukarı örneklenmiş bir ızgaraya eşleyin.
   5. Yukarı ve aşağı akış yönlerini ayırt etmek için özel bir renk şeması uygulayın ve gelişmiş görselleştirme için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edin.
   6. İki alt görüntü oluşturmak için orijinal MB yörüngelerini rastgele iki gruba ayırın, her birinde bir Fourier dönüşümü gerçekleştirin ve Fourier Halkası Korelasyonunu (FRC) spektrumlarının normalleştirilmiş korelasyonu olarak hesaplayın. Çözünürlüğü, FRC'nin^{eşik 19'un} altına düştüğü uzamsal frekansın tersi olarak tanımlayın.

Şekil 1, sıçanlarda in vivo beyin mikrovasküler ULM görüntüleme için ayrıntılı kurulumu göstermektedir ve her bir eleman deneysel değişkenliği en aza indirmek ve güvenilir süper çözünürlüklü görüntüleme sonuçları için doğru veri toplamayı sağlamak için dikkatlice tasarlanmıştır.

Şekil 2A , Bregma noktasından -1 mm'de konumlandırılmış, 12 mm'ye yaklaşan bir görüntüleme derinliği ile sıçan beynindeki mikrovaskülatür sisteminin ULM ile yeniden yapılandırılmış yapısını göstermektedir. Görüntüleme düzlemi boyunca etkili dilim kalınlığı 0,1 mm ila 0,3 mm arasında değişir. Hem daha sığ hem de daha derin mikro damarlar açıkça görülebilir ve görüntü kalitesi artan derinlikle bozulmaz (Şekil 2B). İlgilenilen bölgelerdeki (ROI) kesikli çizgi boyunca yoğunluk dağılımının maksimum yarısında (FWHM) tam genişliği hesaplayarak, en küçüğü 13 μm olmak üzere çeşitli çaplardaki kaplar tespit edilebilir (Şekil 2C). Çözünürlük değerlendirmesi için Fourier halka korelasyonu (FRC) uygulandığında, sıçan beyni mikrovasküler sistem görüntülemesinin uzamsal çözünürlüğü 12.5 μm olarak ölçülür (Şekil 2D).

Kan akışı bilgisi, fizyolojik tepkileri yansıtmak ve hastalıkları teşhis etmek için çok önemlidir. Şekil 3A , sıçan beyninin enine kesitsel bir dilimindeki kan akış yönlerini göstermektedir, burada mavi, proba doğru akışı ve kırmızı, probdan uzaklaşan akışı gösterir. Buna dayanarak, kortekste aşağı doğru akan küçük arterler ve yukarı doğru akan küçük damarlar gibi belirli beyin bölgeleri ayırt edilebilir²⁰ (Şekil 3B). Şekil 3C , farklı renklerde kodlanmış bir beyin kan akış hızı haritasını göstermektedir ve daha büyük damarlar belirgin şekilde daha yüksek akış hızları göstermektedir. Hızların dağılımı 1 ila 80 mm/s arasında değişir ve ağırlıklı olarak 10-25 mm/s aralığında yoğunlaşır (Şekil 3D), bu da tüm hız aralığının %81.57'sini temsil eder. Bu oran, hız matrisindeki toplam veri noktası sayısına göre 5-25 mm/s aralığındaki hız veri noktalarının sayısı belirlenerek hesaplanır.

Şekil 4, önerilen protokolü kullanan bir glioblastoma sıçan modelinin görüntüleme sonuçlarını sunmaktadır. C6 glioblastoma hücreleri sıçan beynine implante edildi. Şekil 4A , bir glioblastoma sıçan modelinin beynindeki mikrovasküler yapıyı, anormal vasküler dilatasyon ve tümör çevresinde gözlenen yapısal düzensizlikleri göstermektedir. Tümörlü bölgedeki damarlar, sol taraftaki normal alana göre daha fazla kıvrımlılık gösterir. Şekil 4B , tümör bölgesindeki akış modellerinin anlaşılmasına olanak tanıyan kan akış yönü hakkında bilgi sağlar. Şekil 4C , tümör içindeki ve çevresindeki vasküler akıştaki heterojenliği ortaya çıkaran bir kan akış hızı haritasını gösterir.

Şekil 1: Sıçan beyin mikrovaskülatürünün in vivo ULM görüntülemesi için deney kurulum detayları. (A) Sıçanın kafasını stabilize etmek için kullanılan kulak çubuklarının konumu. (B) Sıçanın kafasındaki traşlı alan cerrahi erişim için hazırlanmıştır. (C) Solunum maskesi ile stereotaksik alete yerleştirilen sıçan; Kanama durdurucular her iki taraftaki cildi geri çekmek için kullanılır. (D) Kraniyotomi için kraniyal matkaba monte edilmiş küresel matkap uçları (2,5 mm ve 1 mm). (E) Bregma ve Lambda'ya göre işaretlenmiş kraniyotomi alanı. (F) Kraniyotomi sonrası açıkta kalan sıçan beyni. (G) Sıçanın kuyruk damarına yerleştirilen ve mikroenjeksiyon için bir şırınga pompasına bağlanan kalıcı bir iğne. (H) Aşırı kanamalı sıçan beyin damar sistemi örneği; Beyaz kutu, vasküler rekonstrüksiyonun eksik olduğu bir bölgeyi vurgulamaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sıçan beyninin mikrovasküler yapısının in vivo olarak ULM rekonstrüksiyonunun deneysel sonuçları. (A) Sıçan beyninin Bregma noktasından -1 mm'de mikrovasküler yapısı. (B) Küçük gemilerin morfolojisini vurgulamak için A'da daha sığ ve daha derin yerlerde iki ilgi bölgesinin (ROI) büyütülmüş görüntüleri. (C) B'deki kesikli çizgi boyunca yoğunluk dağılımı, yarı maksimumda (FWHM) tam genişlik kullanılarak ölçülen damar çaplarını gösteren sayısal değerlerle. (D) Fourier halkası tekniği kullanılarak ULM rekonstrüksiyon performansının değerlendirilmesi, 1/2 bit, görüntü kalitesinden ödün vermeden çözünürlüğü standartlaştırmak için seçilmiştir, bu da korelasyonun hala istatistiksel olarak anlamlı bilgileri gösterdiği en yüksek uzamsal frekansı tanımlar. "○", korelasyon eğrisinin kesişme noktasını ve 1/2 bit eşiğini işaret ederek çözünürlük sınırını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Sıçan beyninde in vivo olarak mikrovasküler kan akış yönü ve hızının ULM rekonstrüksiyonunun deneysel sonuçları. (A) Sıçan beynindeki kan akış yönü. Mavi, proba doğru yukarı doğru akışı, kırmızı ise probdan aşağı doğru akışı gösterir. (B) Sıçan beynindeki kortikal bölgelerdeki küçük arterler ve damarlar, kan akışının yönüne göre belirlenir. (C) Sıçan beynindeki kan akış hızı. (D) Sıçan beynindeki kan akışının hız histogramı, 1 mm / s ila 80 mm / s arasındaki dağılımı gösterir. Açık mavi çubuklar 5-25 mm/sn hız aralığını temsil eder. Kırmızı çizgi, tipik hız dağılım profilini gösteren verilere takılan eğriyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sıçan beyni glioblastoma modelinde mikrovasküler yapının ULM rekonstrüksiyonunun deneysel sonuçları in vivo. (A) Sıçan beyninin mikrovasküler yapısı. (B) Sıçan beynindeki kan akış yönü. (C) Sıçan beynindeki kan akış hızı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, in vivo sıçan beyin mikrovaskülatürünün süper çözünürlüklü görüntülemesini gerçekleştirmek için ULM'yi başarıyla kullandı. Diğer görüntüleme modaliteleriyle karşılaştırıldığında, ULM aynı anda hem uzamsal çözünürlüğü hem de penetrasyon derinliğini barındırır. Açıkta kalan sıçan beyni, kafatasından ziyade görüntülendi ve kemik varlığının neden olduğu zayıflama ve bozulmadan kaçınıldı. Merkezi frekansı 15.625 MHz olan bir dönüştürücü altında, 12.5 μm'ye kadar uzamsal çözünürlüğe sahip, yaklaşık 12 mm derinlikteki vasküler yapılar yakalandı. Kan akışının yönü, küçük arterlerin ve damarların belirli bölgelerinin farklılaşmasını kolaylaştırdı. Ek olarak, teknik çok çeşitli akış hızı ölçümlerini (1-80 mm/s) destekler.

Sıçanlarda yapılan kraniyotomi bu protokolde kritik öneme sahiptir. Ameliyat sırasında aşırı kanamayı en aza indirmek esastır. Bir yandan, aşırı kanama kan dolaşımını etkileyebilir, tipik bir tezahür kortikal alanlarda vasküler rekonstrüksiyonun olmamasıdır. Öte yandan, deney hayvanlarında fizyolojik değişikliklere ve hatta ölüme de neden olabilir. Prosedürde kullanılan stereotaktik cihaz, travmayı azaltabilen ve başarı oranını artırabilen otomatik bir kraniotomi programına sahiptir, ancak büyük ölçüde uygulayıcının deneyimine dayanır. Bunun nedeni, sıçan beyninde hasara veya ikincil yaralanmalara neden olmamak için sondaj sahasının konumunun ve derinliğinin hassas bir şekilde belirlenmesinin gerekli olmasıdır. Kraniyotomi her zaman gerekli olmasa da, transkraniyal ULM görüntüleme umut vaat eder ancak sağlam kompanzasyon veya distorsiyon düzeltme algoritmaları gerektirir. Ek olarak, MB'leri istikrarlı bir şekilde uygulamak için bir mikroenjeksiyon pompası kullanılır ve sıçanın vasküler sistemi içinde seyrek ve stabil kalmalarını sağlar. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ULM rekonstrüksiyonlarını kolaylaştırdığı için geleneksel lokalizasyon teknikleri için uygundur. Bununla birlikte, hem veri toplamayı hem de görüntüleme süresini uzatarak ULM görüntülemeyi uzun süreli bir süreç haline getirir. Alternatif bir strateji, görüntü çözünürlüğünü bozulmadan korumak için derin öğrenme^21,22 gibi gelişmiş algoritmaların uygulanmasını gerektiren yüksek yoğunluklu MB enjeksiyonlarının kullanılmasını içerir.

Sıçanlarda fizyolojik stabiliteyi korumak için ekipman üreticisi tarafından önerilen dozu takiben izofluran anestezisi kullanıldı. Bununla birlikte, önceki çalışmalarda belgelendiği gibi, izofluran anestezisinin dolaşım sistemi üzerinde bilinen etkileri vardır ve potansiyel olarak kan basıncı ve kalp atış hızı gibi kardiyovasküler parametreleri etkiler^23,24. Bu değişiklikler, kan akışı dinamiklerinde değişkenliğe neden olabilir ve potansiyel olarak kan akışı ölçümlerinin doğruluğunu etkileyebilir.

Sonuç olarak, bu protokol, küçük hayvan modellerine dayalı prospektif beyin hastalığı araştırmaları için bir referans sağlayarak ULM'nin kapsamlı uygulama potansiyelini göstermektedir. Mikrovasküler düzeyde patofizyolojik değişiklikleri anlamak ve hastalık ilerlemesinin tedavilere yanıtını değerlendirmek için önemli bir değere sahiptir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma kısmen 2023YFC2410903 Hibesi kapsamında Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe 12274092, 12034005), Şanghay Kaşif Programı (Hibe 21TS1400200), Şanghay Uluslararası Bilim ve Teknoloji İşbirliği Programı (Hibe 24490710400) ve Fudan Üniversitesi Bilim için Yapay Zeka Vakfı (Grant FudanX24AI016) tarafından desteklenmiştir.