Kilo Düşürme Yöntemi ile Modifiye Edilmiş ve Manyetik Rezonans Görüntüleme ile Kanıtlanmış Komplike Olmayan Hafif Travmatik Beyin Hasarı Modelinin Geliştirilmesi

Burada, akut fazda korunmuş beyin yapısı ve uzun süreli beyin atrofisi ile komplike olmayan hafif travmatik beyin hasarının nörogörüntü sonucunu kopyalayan bir kapalı kafa travması hayvan modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Boylamsal manyetik rezonans görüntüleme, kanıt için kullanılan birincil yöntemdir.

Beyin sarsıntısı olarak bilinen hafif travmatik beyin hasarı (mTBI), dünya çapında beyin yaralanmalarının %85'inden fazlasını oluşturur. Özellikle, akut dönemde rutin klinik görüntülemede negatif bulgular gösteren komplike olmayan mTBH, bu hastalarda erken ve uygun bakımı engellemektedir. Farklı etki parametrelerinin mTBH'yi takiben sonraki nöropsikolojik semptomların ilerlemesini etkileyebileceği ve hatta hızlandırabileceği kabul edilmiştir. Bununla birlikte, sarsıntı sırasındaki etki parametrelerinin sonuçla ilişkisi kapsamlı bir şekilde incelenmemiştir. Bu çalışmada, ağırlık düşürme yaralanması paradigmasından modifiye edilmiş kapalı kafa travması (CHI) olan bir hayvan modeli tanımlanmış ve ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları (n = 20), farklı etki parametrelerine sahip CHI gruplarına rastgele atandı (grup başına n = 4). T2 ağırlıklı görüntüleme ve difüzyon tensör görüntüleme dahil olmak üzere uzunlamasına MR görüntüleme çalışmaları ve modifiye nörolojik şiddet skoru (mNSS) ve ışın yürüme testi gibi sıralı davranışsal değerlendirmeler 50 günlük bir çalışma süresi boyunca gerçekleştirildi. Astrogliozis için immünohistokimyasal boyama, yaralanma sonrası 50. günde yapıldı. Tekrarlayan CHI'yi takiben hayvanlarda, tek yaralanma ve sahte gruba kıyasla daha kötü davranışsal performans gözlenmiştir. Uzunlamasına manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak, yaralanma sonrası 24 saat içinde önemli bir beyin kontüzyonu gözlenmedi. Bununla birlikte, yaralanma sonrası 50. günde kortikal atrofi ve kortikal fraksiyonel anizotropi (FA) değişikliği gösterildi, bu da klinik komplike olmayan mTBI'nın başarılı bir şekilde tekrarlandığını düşündürdü. En önemlisi, mTBI'dan sonra gözlenen nörodavranışsal sonuçlardaki ve görüntü özelliklerindeki değişiklikler, hayvanlarda etki sayısına, yaralanmalar arası aralıklara ve seçilen etki bölgesine bağlıydı. Preklinik MRG ile birleştirilen bu in vivo mTBI modeli, tüm beyin ölçeğinde beyin hasarını keşfetmek için bir araç sağlar. Ayrıca, mTBI'ya duyarlı görüntüleme biyobelirteçlerinin çeşitli etki parametreleri ve şiddet seviyelerinde araştırılmasına da olanak tanır.

Hafif travmatik beyin hasarı (mTBI) öncelikle temas sporları yapan sporcularda, askeri gazilerde ve trafik kazası geçiren kişilerde görülür¹. Rapor edilen tüm kafa yaralanmalarının %85'inden fazlasını oluşturur². mTBH'nin geniş etiyolojisi ve artan küresel insidansı, mTBH'nin geç başlangıçlı nörodejeneratif hastalığın geçici bir çevresel risk faktörü olarak dahil edilmesinin altını çizmektedir³. Komplike olmayan hafif TBH, bilgisayarlı tomografi (BT) veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) taramalarında yapısal anormallik gözlenmeden 13-15 arasında bir Glasgow Koma Skoru (GCS) ile karakterizedir. Komplike olmayan mTBI'li hastaların yaşadığı yaygın semptomlar arasında baş ağrısı, baş dönmesi, mide bulantısı veya kusma ve yorgunluk bulunur. Bununla birlikte, komplike olmayan mTBH'yi takiben sonuçların boylamsal değerlendirmesi, hastalarda yüksek bırakma oranı nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır⁴.

Tekrarlayan mTBI endişeleri, özellikle Ulusal Futbol Ligi (NFL) profesyonel sporcu topluluğu içinde artmış ve daha sonra profesyonel olmayan sporcular arasında farkındalık yaratmıştır⁵. Beyin savunmasızlığının, ilk mTBI'yi takiben artacağı ve sonraki hakaretlerin potansiyel olarak yaralanma sonuçlarını kötüleştireceği varsayılmaktadır. Futbolcuların en büyük bağışlanan beyin kohortundan elde edilen son bulgular, yalnızca kronik travmatik ensefalopati (CTE) şiddetinde önceki futbol katılımını etkilemekle kalmadı, aynı zamanda futbolla ilgili farklı faktörler ile CTE^6'nın riski ve şiddeti arasında bir korelasyon olduğunu da gösterdi. Bu nedenle, beyin sarsıntısı sayısının ve tekrarlayan rejimin yaralanma sonuçları üzerindeki etkisine ilişkin endişe artmaktadır. Klinik öncesi araştırmalar, çeşitli kapalı kafa travması (CHI) modelleri kullanarak tekrarlayan mTBI sonrası nöropatolojik değişiklikleri, nöroinflamatuar kaskad ve nöropsikolojik bozukluğu araştırmıştır ^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Bununla birlikte, akut fazda fonksiyonel bozulma ve kronik fazda beyin atrofisi ile sonuçlanan sporla ilgili tekrarlayan sarsıntılı kafa darbelerini yakından taklit edebilen komplike olmayan mTBI modeli üzerindeki etki parametrelerinin araştırılması iyi incelenmemiştir.

Su moleküllerinin difüzyonunu değerlendiren bir teknik olan difüzyon tensör görüntüleme (DTI), mTBI'nin etkilerini araştıran çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. DTI'den türetilen önemli bir metrik olan fraksiyonel anizotropi (FA), su yayılımı tutarlılığının derecesini ölçer ve aksonların ve sinir lifi demetlerinin yapısal organizasyonu hakkında bilgi sağlar. Beyaz cevherdeki (WM) FA değerlerinin bozulması, çeşitli modellerde mTBI'yi takiben^{önerilmiştir} 8,10,11,15,16,17. Ek olarak, aksonal ve miyelin bütünlüğünü gösteren eksenel difüzyon (AD) ve radyal difüzyon (RD), klinik öncesi çalışmalarda mTBI'dan sonra değişti 10,15,16,18,19,20. Bununla birlikte, önceki çalışmalar arasında DTI bulgularındaki tutarsızlıklar, mTBI şiddetindeki değişiklikler, etki parametrelerindeki farklılıklar, çeşitli mTBI modelleri ve tutarsız yaralanma sonrası takip zaman noktalarından kaynaklanmaktadır⁹.

Bu nedenle, mevcut protokol belgesi, tek ve tekrarlayan mTBI'nın kümülatif etkilerini değerlendirmek için tasarlanmış bir mTBI hayvan modeli oluşturmayı amaçlamaktadır. Yaralanma sonrası dinamik değişiklikleri yakalamak ve farklı etki parametrelerinin etkilerini keşfetmek için hayvan refahı, davranışsal sonuçlar, DTI parametreleri ve kortikal hacim değerlendirmeleri dahil olmak üzere kapsamlı ve boylamsal değerlendirmeler dahil ettik. Hem akut fonksiyonel bozukluğu hem de uzun vadeli mikroyapısal değişiklikleri göstererek, bu model, önceki hayvan çalışmalarında tam olarak ele alınmayan komplike olmayan mTBI'nın temel özelliklerini etkili bir şekilde çoğaltır. Burada, modifiye edilmiş bir kapalı kafa ağırlık düşürme yöntemi ^8,11 kullanarak karmaşık olmayan bir mTBI modeli geliştirmek ve mTBI'yi takiben boylamsal değerlendirme yapmak için ayrıntılı bir protokol sağladık.

Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Araştırmaları Rehberi (Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu) ve Hayvan Araştırmaları: İn Vivo Deneylerin Raporlanması kılavuzlarının tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Yang Ming Chiao Tung Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Yirmi hayvan rastgele 5 gruba ayrıldı (grup başına n = 4): (i) sensorimotor kortekste tek darbe (SMCx/tek), (ii) 1 saatlik aralıklarla SMCx'te çift darbe (SMCx/2 vuruş/1 saat), (iii) 10 dakikalık aralıklarla SMCx'te çift darbe (SMCx/2 vuruş/10 dakika), (iv) 1 saatlik aralıklarla merkezi beyinde çift darbe (Merkez/2 vuruş/1 saat), ve (v) uzunlamasına sonuç değerlendirmesi için sadece ameliyatla ancak doğrudan kafaya çarpmayan sahte grup (Şekil 1). Dikkat çekici bir şekilde, bu çalışma için seçilen yaralanmalar arası aralıklar (1 saate karşı 10 dakikalık aralıklar), temas sporları yapan sporcuların yaşadığı tek bir sezonda bin defaya kadar çıkabilen tekrarlayan alt sarsıntı etkilerini ^{8,10,11,13,21} taklit edecek şekilde tasarlanmıştır ^22,23.

1. Kapalı kafa travmasının (CHI) indüksiyonu

NOT: 10 ila 12 haftalık ve 250 g'ın üzerinde ağırlığa sahip yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan 12/12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında barındırılır.

1. Fareyi küçük bir indüksiyon odasına yerleştirin ve izofluran (% 5) ve tıbbi hava (2.5-3 L / dak) karışımı ile uyuşturun. Bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermeyene kadar fareyi hazneden çıkarın.
2. Fareyi ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.
   NOT: Farelerin vücut ısısını korumak için ameliyat sırasında ısıtma yastığını açın.
3. Fareyi stereotaksik bir çerçeveye getirin ve bir diş çubuğu ile sabitleyin. Ameliyat sırasında bakım için 1.5-2 L / dk akış hızında tıbbi hava ile bağlı burun konisini kullanarak% 2'de izofluran uygulayın.
4. Kulak çubuklarını yerleştirin. Farenin stereotaksik çerçeve üzerinde ortalandığından ve simetrik olduğundan emin olun.
   NOT: Tüm cerrahi prosedürler aseptik koşullar altında yapılmalıdır. Aletler ameliyattan önce bir buhar otoklav kullanılarak sterilize edildi ve uçları işlem sırasında ek olarak bir boncuk sterilizatörü ile sterilize edildi. Kontaminasyonu önlemek için hayvanın üzerine cerrahi bir örtü yerleştirildi. Cerrah saçlarını örtmek için bir şapka, yüzlerini kapatmak için bir maske taktı ve işlem sırasında bir laboratuvar önlüğü ve cerrahi eldivenlerle donatıldı²⁴.
5. Hayvanın solunum hızını, kalp atış hızını, kan oksijen seviyesini ve vücut ısısını izlemek için nabız oksimetresinin sensörünü hayvanın arka pençesine takın.
6. 1 mL / kg vücut ağırlığı lidokain (20 mg / mL) subkutan olarak analjezik olarak farenin boynuna enjekte edin.
7. Hayvanın kafasına tüy dökücü krem sürün ve 3 dakika bekleyin. Kremayı %70 izopropil alkollü çubuklarla silin.
8. İyotla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak traşlı alanı birkaç kez temizleyin. % 70 etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak iyot kalıntısını çıkarın.
9. Kafatasının yüzeyine erişmek için steril cerrahi bıçak kullanarak traş edilmiş deride yaklaşık 2-2,5 cm uzunluğunda bir orta hat kesisi oluşturun.
10. Kafatasını ortaya çıkarmak için pamuklu bir ped kullanarak kemik üzerindeki dokuyu çıkarın. Kafatası yüzeyini %0,9 tuzlu suya batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak temizleyin, ardından kuru bir pamuklu bezle temizleyin.
    NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma hem de lambda artık kolayca tanımlanabilir.
11. Koordinata dayalı etki alanını daha fazla bulmak için bregma'yı referans noktası olarak belirleyin.
    NOT: Bu protokolde, CHI indüksiyonu için iki koordinat seti kullanılır: (-2.5,-2.0) (2.5 mm lateral 2.0 mm bregmaya posterior) sensorimotor korteksin (SMCx) üstünde ve (0,-3.0) merkezi beynin üstünde (merkezi).
12. Kafatası yüzeyinde seçilen koordinatları belirleyin ve diş çimentosu kullanarak belirlenen alanın üzerine dairesel bir paslanmaz çelik kask (10 mm çapında ve 1 mm kalınlığında) yapıştırın. Isıtma yastığını ve nabız oksimetresini çıkarın.
13. Stereotaktik cihazı ve fareyi kaldırma masası üzerinde (14 cm uzunluk, 8 cm genişlik ve 6.15 cm derinlik) CHI çarpma tertibatının altına hareket ettirin.
14. Bir köpük sünger (19 cm uzunluğunda, 10 cm genişliğinde ve 4 cm derinliğinde, 18 kg/^m3 yoğunluğunda) kullanarak sıçanın gövdesini yükseltin.
15. Fareyi stereotaksik çerçevenin kulak çubuklarından çıkarın. Fareyi, burun konisine bağlı diş çubuğunun üzerinde sabit tutun ve% 2 izofluran verin. Baş ve gövdenin rostral-kaudal yönde düz bir şekilde hizalandığından emin olun.
16. CHI çarpma tertibatı ile kask arasında boşluk kalmamasını sağlamak için kaldırma tablasını ayarlayın. Çarpışmadan 5 s önce izofluranı kapatın.
    NOT: Beyin hasarına bağlı düzeltme refleksini belirtmek için, izofluranın geçici olarak kesilmesi gerçekleştirildi²⁵.
17. 600 g pirinci 1 m yükseklikten paslanmaz çelik bir borudan (paslanmaz pirinç ağırlıklardan oluşan bir sütunu temizlemek için iç çapı 20 mm olan 1 m yükseklik) metal kaskı hedefleyen yuvarlak uçlu güvenli çarpma tertibatına bırakın.
    NOT: Sahte gruptaki hayvanlar, pirinç damla farenin kafasındaki kask ile temas etmeden serbest bırakıldığı için bir darbe yaşamadı.
18. Kaldırma tablasını indirin. Fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın ve fareyi bir ısıtma yastığı üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
19. Hayvanın sırtüstü pozisyondan yüzüstü pozisyona^{geçmeye çalıştığı zaman olan doğrultma} refleksinin zamanını kaydedin ^26,27.
    NOT: Tekrarlayan CHI'ye maruz kalan hayvanlar, 2^{. darbeden} 3 dakika önce tekrar uyuşturuldu. SMCx/double/10 dk grubundaki hayvanlar için zamanında yüzüstü pozisyona geri dönmeyen hayvanlar için, karşılık gelen düzeltme refleksi süresi 420 s olarak kaydedildi.
20. Doğrultma refleks kaydından sonra, adım 1.1'i kullanarak fareyi tekrar izofluran ile uyuşturun.
21. Adım 1.2'yi kullanarak fareyi stereotaksik çerçeve ile hareketsiz hale getirin.
    NOT: Kaskın stalll'ın üzerindeki stabilitesini onayladıktan sonra, 1.13^{. darbeyi} gerçekleştirmek için 1.17-2 adımlarını tekrar tekrarlayın.
22. Kaskı çıkarın. Kafatasının üstündeki tüm bağ dokusunu ve çimentoyu çıkarın.
23. Kafatasını diş çimentosu ile örtün ve kurumasını bekleyin. Cımbız sırtını kullanarak diş çimentosunun sert ve sert olduğunu kontrol edin.
    NOT: Ameliyat sonrası kafatası ve kafa derisi arasındaki kafatası-hava veya kafatası-kan arayüzlerinin neden olduğu duyarlılık artefaktlarını ortadan kaldırmak için diş çimentosu kafatasının üstüne uygulandı.
24. 4-5 bağımsız düğüm ile 4-0 naylon cerrahi dikişler kullanarak kesiyi kapatın.
    NOT: Yara yaklaşık 2-2,5 cm uzunluğundadır. Cerrahi dikişlerin kılcal hareket olmadığından ve ipek veya naylon malzemeden yapıldığından emin olun. Hayvanın çizilmesiyle yaranın açılmasını önlemek için kesiği tek bir düğüm kullanarak dikmeyin.
25. Enfeksiyonları önlemek için ameliyat bölgesine topikal antibiyotikler (Dermanest krem) uygulayın.
26. Ameliyat sonrası analjezikler olarak 1 mL / kg vücut ağırlığı carprofen (50 mg / mL) deri altına enjekte edin.
27. Fareyi, bilincini geri kazanana kadar bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese koyun. Sıçan dik oturduğunda, onu ev kafesine geri koyun.
28. Ameliyattan sonra art arda 3 gün boyunca analjezik olarak her gün hayvana 200 mL su ile karıştırılmış 5 mL asetaminofen (24 mg / mL) oral yoldan uygulayın.

2. Manyetik rezonans görüntüleme (MRI)

NOT: T2 ağırlıklı görüntü ve difüzyon-tensör görüntüleme, CHI öncesi ve yaralanmadan 1 ve 50 gün sonra sıralı bir PET/MR 7T sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1). CHI işleminden önceki 1 hafta içinde bir başlangıç MRG yapıldı. CHI'den sonraki 1. ve 50. günlerdeki değerlendirmeler için davranışsal değerlendirmeler sabah yapıldı ve ardından aynı gün öğleden sonra MRG taramaları yapıldı.

1. Sıçatanı, izofluran (% 5) ve tıbbi hava (2.5-3 L / dak) karışımı ile doldurulmuş küçük bir indüksiyon odasında uyuşturun.
2. Sıçan bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermediğinde, baş önce yüzüstü pozisyonda hayvan beşiğine transfer ederken anesteziyi geçici olarak askıya alın.
3. Sıçanı, görüntü alımı sırasında bakım için 1,5-2 L/dk akış hızında tıbbi hava ile %2 izofluran sağlayan bir burun konisi ile bağlantılı baş tutucuya yerleştirin.
4. Tarama sırasında hareket etmesini önlemek için kafayı küçük bir bant parçasıyla sabitleyin.
   NOT: Kafa derisinin çıkarılmasına bağlı manyetik duyarlılık artefaktlarını önlemek için CHI'den sonraki ilk gün farenin kafasına biraz diş macunu uygulayın^28,29.
5. Solunumu izlemek için farenin göğüs kafesinin altına bir baskı pedi yerleştirin. Kalp atış hızını izlemek için oksimetre klipslerini arka bacakta bantlayın.
6. Rektal sıcaklığı ölçmek için rektal probu yerleştirin. Vücut ısısını korumak için deney sırasında fareyi dolaşan ılık su ve doku sargısı ile bir ısıtma battaniyesi ile örtün.
   NOT: Deney boyunca kalp atış hızı, solunum hızı ve rektal sıcaklık dahil olmak üzere fizyolojik durumları izleyin. Taramadan önce, yaşamsal belirti monitörünün kalitesinden emin olmak için farenin tüm fizyolojik sinyallerini kontrol edin.
7. Hassas hizalama için kafanın merkezini işaretlemek için PET/MR tarayıcının lazer konumlandırma sistemini kullanın.
8. Motorlu hayvan taşıma sistemini kullanarak hayvanı, başın merkezi tarayıcının izo merkezi ile aynı hizaya gelene kadar otomatik olarak MRI deliğine taşıyın.
   NOT: PET/MR sistemine entegre edilmiş motorlu hayvan taşıma sistemi, hayvanların doğru şekilde konumlandırılmasını sağlar ve görüntüleme modaliteleri arasında geçiş yaparken iş akışını kolaylaştırır.
9. MRI dizisi elde edin.
   1. İlk yerelleştirmeyi ve genel ayarlamayı gerçekleştirin.
   2. Orta sagital dilimi kullanın ve 8^{. dilimi} önden komissür deküsyonu ile hizalayın.
      NOT: Korpus kallozumun uzun eksenine göre yaklaşık 15°'lik bir açıya karşılık gelen, anterior komissür ile serebellumun tabanını birleştiren çizgi tarafından tanımlanan yatay düzleme dik olarak konumlandırılmıştır. Orta sagital dilim için T2-RARE taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: tekrarlama süresi (TR) = 2500 ms, yankı süresi (TE) = 44 ms, görüş alanı (FOV) = 3,5 cm, matris boyutu = 256 256, dilim kalınlığı = 1 mm, dilim sayısı = 1, RARE faktörü = 8, bant genişliği = 75 kHz, ortalama sayısı = 1, edinme süresi = 1 dakika 20 sn.
   3. Anatomik referans için T2 ağırlıklı görüntüler elde etmek için yağ bastırma ve beynin altında bir doygunluk bandı ile gevşeme artırma (RARE) ile hızlı alım kullanın (Şekil 2).
      NOT: T2-RARE taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: tekrarlama süresi (TR) = 3600 ms, yankı süresi (TE) = 40 ms, görüş alanı (FOV) = 2 cm, matris boyutu = 256 256, dilim kalınlığı = 1 mm, dilim sayısı = 16, RARE faktörü = 8, bant genişliği = 75 kHz, ortalama sayısı = 8, edinme süresi = 7 dakika 40 sn.
   4. Difüzyon tensör görüntüleri elde etmek için 4 atışlı bir spin-echo EPI kullanın (Şekil 2).
      NOT: DTI taramasının temel parametreleri aşağıdaki gibidir: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, görüş alanı (FOV) = 2 cm, matris boyutu = 96 96, kalınlık = 1 mm, dilim sayısı = 16, darbe süresi (δ) = 5 ms, iki darbe arasındaki süre (Δ) = 15 ms, B0 sayısı = 5, yön sayısı = 30, b-değeri = 1000 s/^mm3, bant genişliği =150 kHz, ortalama sayısı = 4, edinme süresi = 14 dakika.
   5. Tarama protokolünü tamamlayın. Hayvan beşiğini mıknatıstan dışarı kaydırın. Hayvanı beşikten çıkarın.
   6. Vücut ısısını korumak için fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan temiz bir kafese aktarın. Bilincini geri kazandıktan sonra fareyi ev kafesine geri koyun.
10. Görüntü önişleme
    NOT: Veri işleme ve analiz için MRtrix3, İstatistiksel Parametrik Haritalama (SPM) yazılımı ve özel MATLAB komut dosyalarını kullanın.
    1. MRtrix3 komutunu (dwidenoise)³⁰ kullanarak DTI görüntülerinin gürültüsünü giderin.
    2. MRtrix komutunu (mrdegibbs)³⁰ kullanarak Gibb'in çınlayan artefaktlarını DTI görüntülerinden kaldırın.
    3. SPM işlevlerini (spm_coreg.m ve spm_powell.m) kullanarak uzunlamasına taramalarda tek bir konunun T2 ağırlıklı görüntülerine DTI görüntülerini birlikte kaydedin.
    4. Beyin bölgesini dilim dilim manuel olarak şekillendirerek ve ardından Otsu'nun yöntemi³¹ (özel MATLAB komut dosyası thr_otsu2.m) tarafından belirlenen hesaplanan eşiğin altındaki yoğunluğa sahip pikselleri kaldırarak T2 ağırlıklı görüntülerde kafatası sıyırma işlemi gerçekleştirin.
    5. SPM fonksiyonlarını (spm_coreg.m ve spm_powell.m) kullanarak aynı deney grubundaki hayvanlar arasında denekler arası ortak kayıt gerçekleştirin. Beyin maskesini ilgili DTI görüntülerine uygulayın.
       NOT: Kafatası sıyırma, bilgisayarın işlem süresini azaltmak için yapılır.
    6. DTI'ye (özel MATLAB komut dosyası, tensormap.m) dayalı tensör haritalarını hesaplayın.
    7. FA haritalarını hesapla (özel MATLAB komut dosyası, calFA.m)
       NOT: Tüm özel MATLAB komut dosyaları aşağıdaki veritabanı (https://doi-org.bdigitaluss.remotexs.co/10.57770/9ZESXD) aracılığıyla kullanılabilir.
11. Görüntü analizi-FA
    1. CHI koordinatının altındaki üç ardışık görüntü dilimi için korteks ve korpus kallozumda (CC) ilgi bölgeleri (ROI'ler) çizin.
       NOT: Tüm ROI'ler, deney gruplarına kör olan 2 deneyimli araştırmacı tarafından manuel olarak çizilmiş ve büyük hatalar için görsel olarak incelenmiştir.
    2. ROI'lerden FA değerini çıkarın ve ortalamasını alın.
       NOT: Korteksin altındaki korpus kallozum için, kısmi hacim etkilerini ortadan kaldırmak için seçilen ROI'de FA < 0.35 değerlerine sahip pikseller hariç tutulmuştur. Korteks için, ROI'de FA < 0.35 değerlerine sahip tüm pikseller analiz için işe alındı.
12. Görüntü analizi-Hacim
    1. Bregma -7 ila +3 mm'de 11 ardışık görüntü dilimi için kortikal bölgeleri kapsayan ROI'leri manuel olarak çizin.
       NOT: Tüm ROI'ler, deney gruplarına kör olan 2 deneyimli araştırmacı tarafından manuel olarak çizilmiştir.
    2. Dilimler arasındaki ROI'lerin toplam piksellerini toplayın ve dilim kalınlığını (1 mm) çarparak bunları hacme dönüştürün.
    3. CHI'den sonraki kortikal hacmi, her hayvanın CHI'sinden önceki karşılık gelen hacimle normalleştirin.
       NOT: Sunumdan önce hayvanlar arasında beyin hacmindeki bireysel farklılıkları ortadan kaldırmak için verileri normalleştirin.

3. Davranış değerlendirmesi

NOT: Davranışsal deneyler, CHI'den önce ve ayrıca CHI'den 1 ve 50 gün sonra ışın yürüme dengesi testi ve mNSS kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1). Toplanan verilerin doğruluğunu, tutarlılığını ve nesnelliğini sağlamak için tüm değerlendirmeler en az iki gözlemci tarafından gerçekleştirildi.

1. Işın yürüyüş dengesi testi
   1. Video kamerayı açın ve zamanlayıcıyı başlatın.
   2. Fareleri denge kirişinin bir ucuna yerleştirin (3 cm derinliğinde, 3 cm genişliğinde, 80 cm uzunluğunda ve yerden 60 cm yukarıda).
   3. Sıçan bir gidiş-dönüş yolculuğunu tamamladığında, düştüğünde veya 3 dakikadan fazla donduğunda zamanlayıcıyı durdurun.
      1. Deney sırasında, mNSS ^11,32,33,34 kullanarak değerlendirme için hayvan durumunu gözlemleyin. Değerlendirme için şu standartları izleyin:
      2. Sıçan, kiriş üzerinde sabit bir duruşla dengeyi koruyorsa, 0 puanı atayın.
      3. Sıçan kirişin kenarını kavrarsa, 1 puan verin.
      4. Sıçan kirişten bir uzuv uzakta düşerse, 2 puan verin.
      5. Sıçan iki uzuv kapalıyken düşerse veya kiriş üzerinde dönerse (>60 s), 3 puan verin.
      6. Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (>40 sn), 4 puan verin.
      7. Sıçan kiriş üzerinde dengede durmaya çalışır ancak düşerse (>20 sn), 5 puan verin.
      8. Sıçan kirişi dengelemeye veya asmaya çalışmazsa ve 20 saniye içinde düşerse, 6 puan verin.
      9. Sıçan görevi tamamlayamazsa, en fazla 3 dakika sürdüğünü düşünün ve 6 puan verin.
   4. Test günlerini belirli zaman noktalarında planlayın.
      NOT: CHI'den önce iki deneme için ışın yürüyüşünü tamamlamayan sıçanları, sonraki cerrahi ve takip davranışsal değerlendirmesinden hariç tutun.
2. Modifiye nörolojik şiddet skoru (mNSS)
   NOT: mNSS değerlendirmesi, motor testleri, duyusal testleri, refleks yokluğunu, anormal hareketleri, ışın dengesini ve günlük olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilen ^{yerde yürümeyi 32,33} içerir.
   1. Motor testleri yapın.
      1. Fareyi kuyruğun tabanından kaldırın ve uygun fleksiyon ve ekstansiyonu değerlendirmek için uzuvlarının reflekslerini yaklaşık 15 saniye gözlemleyin.
      2. Ön bacakta normal fleksiyon gözlenirse, 0 puanı atayın. Fleksiyon gözlenmezse, 1 puan atayın.
      3. Arka bacakta normal fleksiyon gözlenirse, 0 puanı atayın. Fleksiyon gözlenmezse, 1 puan atayın.
      4. Fareyi kuyruğundan kaldırdıktan sonra kafa 30 saniye içinde dikey eksene >10° hareket ederse, 0 puanı atayın. Değilse, 1 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   2. Uzuv yerleştirme testleri yapın.
      NOT: Yerleştirme testi, duyusal (görsel, dokunsal duyum ve propriyosepsiyon) ve motor fonksiyon arasındaki koordinasyonu değerlendirmek için yapılır.
      1. Fareyi yavaşça masanın yüzeyine doğru indirin. Sıçanların pençelerinin yüzeye ulaşıp ulaşmadığını ve gerilip gerilmediğini gözlemleyin.
      2. Sıçanlar her iki uzuv gergin ve ileri doğru yüzeye ulaştıysa, 0 puan verin. Gecikme varsa veya yanıt yoksa, 1 puanı atayın.
      3. Fareyi yüzeye yerleştirin ve pençeyi masanın kenarına doğru çekin. Pençesinin masanın yüzeyinde normal bir konuma dönüp dönmediğini gözlemleyin.
      4. Anında ve normal yerleştirme yanıtları gözlenirse, 0 puanını atayın. Gecikmeli yerleştirme yanıtları gözlemlenirse, 1 puan atayın. Yanıt yoksa, 2 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   3. Gözlemleyin, yokluğu ve anormal hareketleri yansıtın.
      1. Bir pamuklu çubuğun pamuk ucuyla işitsel meatusa dokunurken kulak kepçesi refleksini değerlendirmek için baş sallamalarını gözlemleyin.
      2. Normal bir refleks gözlenirse, 0 puan verin. Herhangi bir refleks gözlenmezse, 1 puan verin.
      3. Kornea refleksinin varlığını, pamuklu bir çubuğun pamuk ucuyla korneaya dokunarak değerlendirin.
      4. Normal bir yanıt ortaya çıkarsa, 0 puanını atayın. Göz kırpma yanıtı alınmazsa, 1 puan atayın.
      5. Ellerinizi kısa ve güçlü bir şekilde çırpın. İrkilme refleksinin varlığını gözlemleyin.
      6. Bir refleks gözlenirse, 0 puan verin. Herhangi bir refleks gözlenmezse, 1 puan verin.
      7. Sıçanın nöbet, miyoklonus veya miyodiston olup olmadığını gözlemleyin.
      8. Bunlardan herhangi biri meydana gelirse, 1 puan atayın.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 4 puan verilecektir.
   4. Daha önce açıklandığı gibi ışın dengesi testini gerçekleştirin (adım 3.1).
      NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 6 puan verilecektir.
   5. Yerde yürüme testi yapın.
      1. Açık alan arenasını hazırlayın (75 cm uzunluk, 50 cm genişlik ve 40 cm derinlik). Temiz olduğundan ve önceki koku ipuçlarından arınmış olduğundan emin olun.
      2. Açık alan arenasının ortasına bir fare yerleştirin ve farenin arenada nasıl yürüdüğünü gözlemleyin.
      3. Sıçan düzenli bir yürüyüş yaparsa, 0 puan verin.
      4. Sıçan düz yürüyemiyorsa, 1 puan verin.
      5. Sıçan yere koyduktan sonra paretik tarafa düşerse, 3 puan verin.
         NOT: Sınavın bu oturumunda en fazla 3 puan verilecektir.
   6. Tüm puanları toplayın; Mümkün olan maksimum puan 18'dir.
      NOT: Daha yüksek puan, daha kötü bir sonucu gösterir.

4. İmmünohistoloji

1. Transkardiyak perfüzyon gerçekleştirin³⁵.
   NOT: Transkardiyak perfüzyon, CHI'den 50 gün sonra MRG taramasından sonra gerçekleştirilir (Şekil 1).
   1. Fareyi küçük bir indüksiyon odasına yerleştirin ve bir pençe veya kuyruk tutamına yanıt vermeyene kadar izofluran (% 5) ile uyuşturun.
   2. Derin anestezi için intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 50 mg / kg vücut ağırlığı zoletil (50 mg / mL) ve 10 mg / kg vücut ağırlığı Xylazine (Roumpun, 23.32 mg / mL) uygulayın.
   3. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
   4. Makas kullanarak göğüs kafesinin altında yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda enine bir kesi yapın.
   5. Diyaframı bulun ve kalbi ortaya çıkarmak için kesin.
   6. Pulmoner arteri klemplemek için hemostatik forseps kullanın ve ardından sağ atriyumda yaklaşık 0,5-1 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
   7. İğneyi infüzyon pompasına bağlı boru hattına bağlayın.
   8. İğneyi sol ventriküle yerleştirin.
   9. Kan temizlenene kadar hayvanı transkardiyak perfüzyon (40 mL / dak) ile 500 mL% 0.9 salin ile durulayın.
   10. Fiksasyon için hayvanı 500 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile transkardiyak perfüzyon (40 mL / dak) yoluyla perfüze edin.
   11. Farenin kafasını çıkarın ve beyin dokusunu kafatasından dikkatlice soyun.
   12. Beyni, fiksasyon sonrası için 48 saat boyunca şişede yaklaşık 20 mL% 4 PFA'da koruyun.
2. Doku işleme ve IHC boyama^{gerçekleştirin 36,37}.
   NOT: İmmünoperoksidaz ikincil tespit sistemi kitini kullanarak formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitleri üzerinde immünohistokimyasal boyama gerçekleştirin.
   1. Formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü doku kesitleri kullanın.
   2. Deparafinizasyon yapın ve endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için slaytları% 3 H₂O₂ ile tedavi edin. 90 ° C'de sitrat tamponu kullanarak antijen alımını gerçekleştirin.
   3. İmmünoperoksidaz ikincil tespit sistemi kitini kullanarak immünohistokimyasal boyama yapın.
      NOT: Boyama işlemleri, üreticinin tavsiyelerine göre gerçekleştirilir.
   4. Örnekleri lekelemek için hematoksilen kullanın.
   5. Numuneleri bir antifade reaktifi ile monte edin.
   6. İmmünohistokimyasal boyama için anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) antikorları kullanın.
   7. Bir ışık mikroskobu slayt tarayıcısı kullanarak ROI'lerin görüntülerini elde edin (Şekil 6).

5. Davranış ve görüntü sonuçlarının istatistiksel analizi

NOT: Bu çalışmada SPSS programında istatistiksel analiz yapılmış; Bununla birlikte, istatistiksel analiz diğer istatistiksel araç kutularında da gerçekleştirilebilir.

1. Verileri geniş biçimde bir SPSS *.sav dosyasına yükleyin.
2. Gruplar arasında zaman içinde davranışsal (normalleştirilmiş ağırlık, mNSS ve ışın yürüyüş süresi) ve görüntü sonuçlarını (korteks ve CC'deki FA değerleri) karşılaştırmak için tekrarlanan varyans analizi (ANOVA) yapın.
   1. Tekrarlanan Ölçüler > Genel Doğrusal Model > Analiz Et'e tıklayın.
   2. Özne İçi Faktör Adı kutusuna bir ad atayın (örneğin, zaman) ve Düzey Sayısı kutusuna '3' koyun (farklı takip zaman noktalarına sahip üç düzey). Tekrarlanan Ölçümler Faktör(ler)i Tanımla iletişim kutusundaki Ölçü Adı kutusuna (ör. mNSS) bir ad atayın.
   3. Test edilmesi gereken Denek İçi Değişkenleri (CHI öncesi, D1 ve D50 sonrasında elde edilen veriler) yükleyin ve Tekrarlanan Ölçümler iletişim kutusunda denekler arası faktörü (örneğin, farklı etki parametrelerine sahip hayvan grupları) belirtin.
   4. Gözlemlenen Ortalamalar iletişim kutusu için post hoc çoklu karşılaştırmalarda Faktör(ler) (örneğin, hayvan grupları) için Post Hoc Test olarak Bonferroni'yi seçin.
      NOT: Çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için, zaman içindeki karşılaştırmalar için tip I hata, Bonferroni düzeltmeleri (0.05/3) kullanılarak ayarlanmıştır. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 (SPSS düzeltilmiş) olarak tanımlandı.
3. Gruplar arasında doğrultma refleksini ve kortikal hacim değişimini karşılaştırmak için tek yönlü bir ANOVA analizi yapın.
   1. Analiz et > Araçları karşılaştır > tek yönlü ANOVA'ya tıklayın.
   2. Bağımlı Listedeki değişkenleri (düzeltme refleksi ve kortikal hacim değişikliği) ve grupları Tek Yönlü ANOVA iletişim kutusunda Faktör olarak yükleyin.
   3. Tek Yönlü ANOVA: Tek Yönlü Çoklu Karşılaştırmalar iletişim kutusunda post hoc test olarak Bonferroni'yi seçin.
      NOT: Çoklu karşılaştırmaları düzeltmek için, gruplar arasındaki karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmeleri (0.05/5) kullanılarak tip I hata düzeltildi. İstatistiksel anlamlılık p < 0.05 (SPSS düzeltilmiş) olarak tanımlandı.

Şekil 2, SMCx'te sahte ve tekrarlayan CHI ile temsili hayvandan alınan uzunlamasına MRG'leri göstermektedir. CHI'den 1 ve 50 gün sonra T2 ağırlıklı görüntülerde önemli bir kafatası kırığı veya beyin kontüzyonu bulunmadı. CHI'den 1 ve 50 gün sonra FA haritalarında WM'de belirgin bir ödem veya deformasyon bulunmadı. Bu çalışmada CHI'ye maruz kalan tüm hayvanlar, 50 günlük tüm deney süresi boyunca hayatta kaldı ve CHI modelinin düşük mortalite (%0-5)⁷ olduğunu gösterdi.

Beyin hasarını hemen takiben bilinç bozukluğunun derecesi, hayvanların kendi kendini düzeltme eğilimi olan doğrultma refleksinin kaybı ile değerlendirildi. SMCx'teki sahte ve tek CHI ile karşılaştırıldığında, tekrarlayan CHI sonrası hayvanlarda doğrultma refleksini yeniden kazanma süresi artmıştır (Şekil 3A). CHI'yi takip eden hayvanların genel refahı, normalleştirilmiş vücut ağırlığı ve mNSS'deki değişiklik ile yansıtılmıştır. Gruplar arasında CHI sonrası anlamlı bir kilo kaybı gözlenmedi (Şekil 3B). Tek bir CHI'yi takiben 50. günde daha yüksek bir mNSS skoru bulunurken, tekrarlayan CHI'den sonraki 1. günde mNSS skorunda önemli bir artış gözlendi ve ciddiyet ve etki bölgesinden bağımsız olarak 50. güne kadar yüksek kaldı (Şekil 3C). Merkezi beyinde tekrarlayan CHI tarafından indüklenen yüksek mNSS, 50. günde azaldı ve SMCx'teki karşılık gelen CHI'den önemli ölçüde daha düşüktü. CHI sonrası sıçanlarda denge ve koordineli motor fonksiyon, ışın yürüme testi ile değerlendirildi. Tekrarlayan CHI'den sonra 1. günde ışın yürüyüş süresinde önemli bir artış gözlendi ve ciddiyet ve etki bölgesinden bağımsız olarak 50. güne kadar yüksek tutuldu (Şekil 3D). Merkezi beyinde tekrarlayan CHI tarafından indüklenen uzun ışın yürüyüş süresi, 50. günde azaldı ve SMCx'teki karşılık gelen CHI'den önemli ölçüde daha kısaydı.

CHI sonrası 50 gün içinde kortikal hacimde önemli bir azalma gözlendi (Şekil 4A). 50. gündeki kortikal hacimler, başlangıç hacminden sırasıyla% 99.63 ±% 2.15,% 95.98 ±% 1.65,% 92.2±6 ve% 2.22 ve% 90.28 ±% 1.17 idi. 50. gündeki kortikal hacim, merkezi beyinde 1 saatlik aralıkla tekrarlayan CHI sonrası başlangıç hacminden% 91.54 ±% 1.98 idi. Sahte grup ile karşılaştırıldığında, CHI sonrası önemli bir kortikal kayıp gözlendi. Tek CHI grubu ile karşılaştırıldığında, tekrarlayan CHI sonrası önemli bir kortikal kayıp gözlendi. 1 saatlik ve 10 dakikalık aralıklarla tekrarlayan CHI sonrası Bregma -4 ila +0 ve Bregma -5 ila +1'deki dilimlerde kortikal hacimde önemli bir azalma gözlendi, sırasıyla (Şekil 4C). Farklı etki bölgelerine sahip CHI hayvanları arasında karşılaştırıldığında, merkezi beyinde CHI'den sonra sadece Bregma 0'daki dilimde önemli ölçüde daha küçük bir kortikal hacim bulundu. Önceki¹¹ ve mevcut çalışmalarda önemli kortikal atrofi bildirilmiş olsa da, hassas hacimsel analiz için ideal olarak 3D olarak elde edilen yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip T2 ağırlıklı görüntüler önerilmektedir. Ek olarak, atlas tabanlı bir diffeomorfik kayıt yaklaşımı³⁸ uygulayan gelecekteki çalışmalar, hafif beyin hasarı ile ilişkili bölgesel beyin değişikliklerini daha iyi ele alabilir.

Uzunlamasına MRG taramaları sırasında kortikal FA değerleri, CHI sonrası geçici mikroyapısal değişiklikleri göstermek için hesaplandı. SMCx'te tek bir CHI'den sonra, etki bölgesinin altında önemli bir FA değişikliği gözlenmedi. SMCx'te tekrarlayan CHI'den sonra, kortekste 50. günde taban çizgisine ve 1 saatlik aralıklarla tekrarlayan CHI sonrası 1 güne kıyasla ipsi-lezyonel kortikal FA'da önemli bir artış gözlenmiştir (Şekil 5A). Ek olarak, 10 dakikalık aralıklarla tekrarlayan CHI'den 1 gün sonra ipsi-lezyonel kortekste FA'da önemli bir azalma gösterilmiştir, bu da 1 saatlik aralıklarla tek ve tekrarlayan CHI'den sonra önemli ölçüde daha düşüktür. SMCx'teki CHI, merkezi beynin korteksinde FA'da önemli değişikliklere neden olmadı (Şekil 5B). Merkezi beyinde tekrarlayan CHI'den sonra, merkezi beynin altındaki kortekste 50. günde taban çizgisi ve 1. güne kıyasla önemli bir kortikal FA artışı gözlendi (Şekil 5B).

SMCx'te tek CHI'den sonra, ipsi-lezyonel SMCx'in altındaki CC'de FA'da önemli bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 5A). SMCx'te tekrarlayan CHI'den sonra, kortekste 50. günde taban çizgisine kıyasla ve tekrarlayan CHI sonrası 1 gün ile 1 saatlik aralıklarla karşılaştırıldığında, CC'de ipsi-lezyonel FA'da önemli bir azalma gözlenmiştir (Şekil 5A). 1. günde ipsi-lezyonel CC'de FA'nın azalması ve daha sonra 50. günde iyileşmesi, 10 dakikalık aralıklarla tekrarlayan CHI sonrası gözlendi. İpsi-lezyonel CC'de, 10 dakikalık aralıklarla tekrarlayan CHI'yi takiben, 1. günde 1 saatlik aralıklarla tekrarlayan CHI ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede düşük FA değeri gösterildi; 50. günde anlamlı derecede yüksek FA değeri, 1 saatlik aralıklarla sahte, tek ve tekrarlayan CHI ile karşılaştırıldığında gösterilmiştir. Merkezi beyinde tekrarlayan CHI'den sonra, ipsi-lezyonel SMCx'in altındaki CC'de FA'da önemli bir artış gözlendi, SMCx'teki CHI ile karşılaştırıldığında 1. günde ve sham grubuna kıyasla 50. günde gözlendi (Şekil 5A).

CHI sonrası nöroinflamasyon, yaralanma sonrası 50. günde GFAP ekspresyonu ile değerlendirildi. İmmün boyamadan elde edilen sonuçlar, astrositlerin ciddiyeti ve etki bölgesinden bağımsız olarak CHI sonrası ipsilezional SMCx'te biriktiğini göstermiştir (Şekil 6).

Şekil 1: Deney tasarımının şeması. Kapalı kafa travmasının başlatılması ve her değerlendirme için ilgili zaman çizelgesi dahil olmak üzere temel adımları gösteren şemalar. CHI öncesi MRG taramaları ve davranışsal değerlendirmeler ameliyattan önceki 7 gün içinde yapıldı. Doğrultma refleksini yeniden kazanma süresi, bilinç bozukluğunun derecesi olarak değerlendirildi. Boylamsal MRG ve davranışsal veriler CHI sonrası 1 ve 50 gün sonra toplandı. Tüm deneylerin tamamlanmasının ardından sıçanlar sakrifiye edildi, ardından immünohistoloji yapıldı. Kısaltma: SMCx/single = sensorimotor kortekste tek darbe; SMCx/2 vuruş/1 saat = 1 saatlik aralıklarla SMCx'te çift darbe; SMCx/2 vuruş/10 dk = 10 dakikalık aralıklarla SMCx'te çift darbe; Merkez/2 vuruş/1 saat = 1 saatlik aralıklarla merkezi beyinde çift darbe. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CHI'yi takiben temsili MR görüntüleri. Temsili hayvandan sahte ve SMCx'te çift CHI'den önce ve sonra 1. ve 50. günlerde T2 ağırlıklı görüntüler (üst sıra) ve FA haritaları (alt sıra) 10 dakikalık aralıklarla SMCx'te. Deneysel CHI'den sonra T2 ağırlıklı görüntülerde fokal kontüzyon yok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Farklı etki parametreleri ile CHI sonrası davranışsal eksiklikler. (A) Son darbeden sonra doğrultma refleksini yeniden kazanma zamanı. SMCx'te tekrarlayan CHI'den sonra düzeltme refleksi süresi artmıştır. (B) Gruplar arasında CHI sonrası normalleştirilmiş vücut ağırlığında (CHI öncesi taban çizgisine normalleştirilmiş) anlamlı bir fark yoktur. Tekrarlayan CHI'den sonra (C) mNSS ve (D) Işın yürüme süresinde bir artış gözlendi. SMCx'te CHI sonrası mNSS ve ışın yürüme süresi yüksek kalırken, 50. günde merkezi beyinde CHI sonrası iyileştiler. Düzeltme refleksi süresi için Bonferroni post hoc testi ile tek yönlü ANOVA; normalleştirilmiş ağırlık, mNSS ve Işın uyandırma süresi için Bonferroni post hoc testi ile tekrarlanan ANOVA: *, p < zaman noktaları arasında .017; +, p < .05'e karşı sahte; #, p < .05'e karşı SMCx/tek; §, p < .05 vs. SMCx/2 isabet/1 saat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı etki parametreleri ile CHI sonrası 50 günde kortikal atrofi. (A) Orta sagital görüntüde dilim hizalaması. Mavi çizgi, anterior komissürü ve beyinciğin tabanını birbirine bağlayan yatay düzlemi gösterir; Kesikli bline çizgisi, korpus kallozumun uzun eksenini gösterir. (B) Kortikal hacmin ölçümü için temsili görüntü dilimlerinde T2 ağırlıklı görüntülerin üzerine yerleştirilmiş açıklayıcı kortikal ROI'ler (kırmızı). (C) CHI sonrası kortikal hacmin değişimi, Bregma -7 ila +3 mm'deki farklı dilimler arasındaki başlangıç hacminin yüzdesi olarak temsil edildi. CHI sonrası 50 gün içinde kortikal hacimde bir azalma gösterilmiştir ve etki parametresine bağlıdır. Veriler std ± ortalamalar olarak ifade edilir. Bonferroni post hoc testi ile tek yönlü ANOVA: +, p < .05'e karşı sahte; #, p < .05'e karşı SMCx/tek; §, p < .05'e karşı SMCx/2 isabet/1 saat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Farklı etki parametreleri ile CHI sonrası FA'daki uzunlamasına değişiklikler. Otomatik olarak segmentlere ayrılan ROI'ler, (A) SMCx ve (B) merkezi beyindeki çarpma bölgesinin derinliklerinde korteks (yeşil) ve korpus kallozum (CC) (kırmızı) 'dır. İç kısım, çarpma bölgesinin altındaki dilimle birlikte 3D beyin görüntüsünü gösterir. Kİ öncesi ve sonrası 1. ve 50. günlerde elde edilen FA değerlerinin boylamsal takibi ortalama ± std olarak sunuldu. Tekrarlanan CHI sonrası FA'daki değişiklik belirgindi ve etki parametresine bağlıydı. Bonferroni post hoc testi ile tekrarlanan ANOVA: *, zaman noktaları arasında p < .05; +, p < .05'e karşı sahte; #, p < .05'e karşı SMCx/tek; §, p < .05 vs. SMCx/2 isabet/1 saat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Çarpma bölgesinin altındaki kortekste yaralanmadan 50 gün sonra CHI kaynaklı nöroinflamasyon. GFAP boyama ile çarpma bölgesinin altındaki serebral korteksin temsili görüntüleri. CHI'den sonra kortekste astrositlerin (oklar) birikimi gözlendi. Ölçek çubuğu = 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, tek ve tekrarlayan yaralanmaların kümülatif etkilerini ve farklı beyin bölgeleri üzerindeki etkilerin sonuçlarını değerlendirmek için komplike olmayan hafif travmatik beyin hasarının (mTBI) bir hayvan modelini oluşturmayı amaçladı. Kapalı kafa ağırlık düşürme yaralanması paradigmasından uyarlanan kapalı kafa travması (CHI) modeli, sporcular ve kask koruması olan bireyler tarafından yaygın olarak yaşanan sarsıntıları taklit etmek için tasarlanmıştır. Bu model, odak beyin hasarını en aza indirirken, darbe sayısı, yaralanmalar arası aralıklar ve etki bölgeleri dahil olmak üzere temel etki parametrelerinin hassas bir şekilde manipüle edilmesini sağlar. Buradaki bulgular, bu parametrelerin davranışsal sonuçların ilerlemesini ve fraksiyonel anizotropi (FA) değerlerini önemli ölçüde etkilediğini göstermiştir. Özellikle, kronik travmatik ensefalopatinin (CTE) ayırt edici bir özelliği olan önemli kortikal atrofi, darbe yükü veya konumundan bağımsız olarak kronik faz sırasında gözlenmiştir. Bu deneysel model, önceki hayvan modellerindeki boşlukları ele alan, komplike olmayan mTBI'yi takiben fonksiyonel ve mikroyapısal değişikliklerin uzunlamasına çalışmaları için sağlam bir çerçeve sağlar.

Temas sporları veya motosiklet kazaları gibi klinik senaryolarda gözlemlenen mTBI'yi çoğaltmak için, çeşitli hayvan modellerinde çeşitli kemirgen kask tasarımları uygulanmıştır⁷. Kapalı kafatasına veya kafaya gelen darbe, açıkta kalan beyin yüzeyini hedefleyenlere kıyasla genellikle daha hafif ve daha yaygın beyin hasarı ile sonuçlanır^15,39. Bununla birlikte, büyük ölçüde çarpma yeri konumunun⁴⁰ tutarsızlığı nedeniyle, takılı kasklar kullanılırken hayvanlar arasında sonuçta büyük bir değişkenlik gözlendiği kabul edilmiştir. Bu çalışmadaki CHI modeli, Marmarou'nun ağırlık düşürme modelinden modifiye edildi, burada kafatası^41'in üzerine metal bir disk yerleştirildi. Kafatası kırığı riskini azaltmak için daha ince bir disk (1 mm) kullanarak ve sabit bir çarpma ucu entegre ederek orijinal metodolojiyi daha da geliştirdik. Önceki mikro bilgisayarlı tomografi (BT) sonuçlarımız, CHI^11'den sonra fark edilebilir mikro kırıkların olmadığını doğruladı. Çimentolu diske doğru yönlendirilmiş sabit bir darbe ucu kullanmanın bir başka avantajı, çarpma bölgesi üzerinde hassas kontrolü kolaylaştırması ve çarpma bölgesinin deneysel sonuçlar üzerindeki etkisini sistemik olarak araştırmamıza izin vermesidir. Dikkat çekici bir şekilde, mevcut modeldeki kafa derisi insizyonu ve anestezi, özellikle akut fazda ek bağışıklık ve enflamatuar tepkilere neden olabilir. Uyanık ve kafa derisi bozulmamış hayvanların kullanılması, bu etkilerin hafifletilmesine yardımcı olabilir ve klinik sarsıntılı beyin hasarı vakalarına çevrilebilirliği artırabilir¹⁰.

CHI'nin davranışsal ve görüntü sonucu üzerindeki kümülatif etkisi, önemli ölçüde daha yüksek mNSS skorları, ışın yürüyüşü görevlerini tamamlamak için daha uzun süre (Şekil 3), daha küçük kortikal hacim (Şekil 4B) ve FA değerlerinde değişiklik (Şekil 5A) ile gösterilmiştir. Ayrıca, yaralanma sonrası 1. günde korteks ve CC'de önemli ölçüde daha düşük FA değerleri (Şekil 5A) ve 50. günde azalmış kortikal hacim (Şekil 4B), 1 saatlik aralıklarla 10 dakikalık aralıklarla tekrarlayan CHI'ye maruz kalan hayvanlarda gösterilmiştir, bu da daha kısa yaralanmalar arası aralıklarla daha kötü sonuçlar olduğunu düşündürmektedir. Tekrarlayan yaralanma 1 saatlik aralıklarla gerçekleştirildiğinde, SMCx üzerinde darbeleri olan hayvanlar, merkezi beyin üzerindeki etkilere kıyasla daha yüksek mNSS skorları (Şekil 3C) ve daha uzun ışın yürüme süreleri (Şekil 3D) sergiledi, bu da CHI sonuçlarının etki bölgesine bağlı olduğunu gösterir. FA'daki değişikliğe ek olarak, CHI sonrası WM^10,11,19'da AD'de bir azalma ve GM ^10,16,18'de bir RD artışı önerilmiştir. DTI parametrelerinin tüm spektrumunun kapsamlı bir analizini içeren gelecekteki araştırmalar, farklı etki parametrelerinin CHI'nin ilerlemesini ve sonuçlarını nasıl etkilediğine dair daha derin bilgiler sağlayabilir. Önerilen model, ergen sıçanlara ve farelere de uygulanabilir. Bununla birlikte, damlaların yüksekliği ve ağırlığı ile kask boyutu da dahil olmak üzere daha fazla ayarlama, önceden keşif ve doğrulamayı garanti eder.

Kendiliğinden yeniden yön bulma ve ayakları üzerinde durma yeteneği ile karakterize edilen doğuştan gelen bir hayvan davranışı olan doğrultma refleksi, insanlarda bilinç kaybını (LOC) değerlendirmek için vekil bir indeks görevi görür⁴². CHI sonrası doğrultma refleksini yeniden kazanmak için geçen süreyi belgelemek için, CHI indüksiyonu sırasında enjekte edilebilir anestezikler yerine inhale anestezikler kullanılmalıdır. Ayrıca, CHI'den hemen önce izofluranın geçici olarak kesilmesi gereklidir²⁵. Genel bozulmayı belirtmek için TBI sonrası vücut ağırlığındaki değişikliklerin izlenmesi önerilir⁴³. CHI'den sonra normalleştirilmiş vücut ağırlığında önemli bir değişiklik olmaması, burada açıklanan modelde beyin hasarının hafifliğini gösterir. Modifiye NSS ve ışın yürüme süresi, beyin hasarından sonra genel iyilik halini ve vestibülomotor fonksiyonu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır⁴⁴. Davranışsal değerlendirme ve MRG deneylerinin CHI sonrası aynı gün yapıldığı göz önüne alındığında, anestezinin ölçülen davranış sonuçlarına müdahalesini önlemek için tüm takip değerlendirmeleri için MRG taramalarından önce davranış testleri yapılmıştır (Şekil 1). Ek olarak, zayıf motor koordinasyonu sergileyen ve potansiyel olarak mNSS skorunu da artıran hayvanlar, CHI öncesi teste dayalı olarak dışlanmalıdır. Sonuçlarımız, önceki çalışma ile uyumlu olarak, tekrarlayan CHI^11'i takiben anlamlı olarak daha yüksek mNSS skorları ve uzamış ışın yürüme süresi gösterdi. Ayrıca, mNSS skorlarının ve ışın yürüme süresinin, özellikle yaralanma sonrası 50. günde, CHI'nin etki bölgesine bağlı olduğunu gösterdik.

Zaman içinde makro ve orta ölçekli beyin yapılarının değerlendirilmesini kolaylaştıran boylamsal MRG, komplike olmayan mTBI'nın özelliklerini çoğaltmada burada sunulan CHI modelinin doğruluğunu doğrulamak için çok önemli bir araçtır. Görüntü alımı sırasında, özellikle CHI'den sonraki 1. günde, hayvanın sıcaklığı, solunum hızı ve kalp atış hızı gibi fizyolojik parametreler iyi izlenmelidir. Sonuç olarak, fizyolojik stabiliteyi korumak için izofluran konsantrasyonu zaman içinde dikkatlice ayarlanmalıdır. Mevcut çalışmada DTI görüntü elde etmek için dört çekimli EPI kullanılırken, nispeten kısa tarama süresi nedeniyle hareket artefaktlarını azaltmak için tek çekimli EPI de kullanılabilir. Klinik öncesi MRG'nin görüntü işleme ve analizi çok önemlidir, çünkü çalışmaların çoğu hala bireysel araştırma ekipleri tarafından geliştirilen özel yapım analiz boru hatlarına dayanmaktadır⁴⁵. Mevcut çalışmada Matlab gibi özelleştirilmiş algoritmaya erişilemiyorsa, hacim ölçümü ve sinyal yoğunluğu çıkarımı, sırasıyla T2 ağırlıklı görüntülere ve FA haritalarına dayalı bilimsel görüntüler için açık kaynaklı bir yazılım olan ImageJ kullanılarak gerçekleştirilebilir. Birden fazla zaman noktasında elde edilen MRI görüntülerinin doğru analizi için, önce denekler arası ortak kayıt yapılmalıdır. Aynı doğum sonrası yaşlarda bile beyin hacmindeki denekler arası farklılıklar göz önüne alındığında, yaralanma sonrası beyin hacminin her denek için başlangıç hacmine normalleştirilmesi, CHI^46'nın neden olduğu kortikal atrofiyi tanımlamak için gereklidir. FA analizi için, kısmi hacim etkilerini ortadan kaldırmak için bitişik gri madde (GM) ve WM'yi ayırma eşiği gerçekleştirilmelidir. FA değerlerinin manyetik alan kuvveti⁴⁷ ve DTI^48'de kullanılan difüzyon gradyanlarının sayısından etkilendiğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, mevcut çalışmada FA eşiğinin ayarlanması, farklı protokoller veya MR tarayıcıları kullanılarak elde edilen DTI görüntüleri için genel olarak geçerli olmayabilir.

mTBI, özellikle komplike olmayan mTBI, akut fazda geleneksel nörogörüntü ile genellikle görünmez olduğundan, araştırma çabaları, sonraki yaralanma sonrası semptomlar hakkında prognostik bilgi yakalamak ve sağlamak için etkili ve gelişmiş görüntü belirteçlerini belirlemeye odaklanmıştır^49,50. Klinik mTBI vakalarının heterojenliği, verilerde daha fazla karmaşıklık ve tutarsızlık ekler. Bu karmaşık olmayan mTBI modelinde, ölçülebilir davranışsal eksikliklerin yanı sıra görüntülemede önemli mikro ve makro yapısal değişiklikler gözlemledik ve yaralanma sonrası potansiyel nörogörüntüleme biyobelirteçlerini uzunlamasına izlemek için bir platform sağladık. Özellikle, CHI modelinde hem görüntüleme hem de fonksiyonel sonuçlardaki etki parametresine bağlı değişiklikler, yaralanma şiddeti ve etki parametrelerine duyarlı nörogörüntüleme biyobelirteçlerinin tanımlanma olasılığını düşündürmektedir. Spesifik DTI metrikleri ile astrogliozis⁸ arasındaki korelasyonları gösteren önceki bulgularla tutarlı olarak, çeşitli görüntü özellikleri, mikroskobik değişiklikler ve fonksiyonel sonuçlar arasındaki ilişkiyi inceleyen gelecekteki çalışmalar, mTBH'yi takiben altta yatan hücresel değişiklikler ve semptom prognozu için umut verici non-invaziv biyobelirteçler oluşturabilir.

Bu çalışmada bazı sınırlılıkların göz önünde bulundurulması gerekmiştir. İlk olarak, her bir etki parametresi grubu için numune boyutu nispeten küçüktür (grup başına n = 4) ve test edilen etki parametrelerinin aralığı sınırlıdır. Örneklem büyüklüğünün küçük olmasına rağmen, CHI grupları arasında davranışsal ölçüm, FA değerleri ve kortikal hacim açısından anlamlı farklılıklar gözlemledik. Farklı etki parametreleri ^8,11 kullanan önceki çalışmalarla birlikte ele alındığında, sonuçlarımız, test edilecek daha geniş bir parametre yelpazesine sahip büyük numunelerde daha fazla çalışmayı desteklemektedir. İkincisi, çoğu TBI hayvan çalışmasında olduğu gibi ^7,9, mevcut deneylerde sadece erkek sıçanlar kullanılmıştır. Son araştırmalar, farelerde tekrarlayan CHI'yi takiben WM'deki DTI metriklerindeki değişikliklerde cinsiyet farklılıkları olduğunu bildirmiş ve beyin hasarını takiben cinsiyete özgü tepkileri vurgulamıştır¹⁰. Hem erkek hem de dişi hayvanları içeren gelecekteki çalışmalar, cinsiyetler arasındaki CHI etki parametrelerine farklı tepkiyi araştıracaktır. Son olarak, CHI sonrası ve farklı CHI grupları arasında FA değişiklikleri gözlenirken, difüzyon sinyali ön işlemesi daha da rafine edilebilir. Girdap akımı düzeltmesi, manyetik alan önyargı düzeltmesi vb. gibi daha karmaşık tekniklerin çok kabuklu difüzyon görüntüsü¹⁷ ile birlikte birleştirilmesi, mTBI tarafından indüklenen mikroyapısal hasarı tespit etmek için DTI sinyallerinin hassasiyetini daha da artırabilir.

Mevcut protokolle, CHI sonrası akut fazda önemli davranışsal eksikliğin yanı sıra korunmuş beyin yapısını gösterdik. Sonraki analiz, kronik fazda kayda değer kortikal beyin hacmi kaybı ve değişmiş FA değerlerini ortaya çıkardı. Daha da önemlisi, davranışsal ve nörogörüntü sonuçları, etki sayısı, yaralanmalar arası aralık ve etki bölgesi dahil olmak üzere CHI'yi indüklemek için kullanılan etki parametrelerine bağlıydı. Esas olarak beyindeki davranışsal sonuçlara veya nöroinflamasyona odaklanan yayınlanmış mTBI modelleriyle karşılaştırıldığında, bu çalışma CHI sonrası sistemik ve tüm beyin değerlendirmesini kapsayan kapsamlı bir yaklaşım kullanmıştır. Uzunlamasına MRG kullanılarak yapılan incelemede, CHI modeli akut fazda korunmuş yapısal bütünlük sundu, ancak kronik fazda belirgin kortikal atrofi gösterdi ve bu da komplike olmayan mTBI'nın başarılı bir şekilde replikasyonunu düşündürdü. Çalışmanın önemi, çeşitli etki parametrelerinin mTBI'dan sonra beyni nasıl değiştirdiğini araştırmak ve bu klinik olarak sessiz yaralanma için geçici görüntü biyobelirteçleri geliştirmek mümkün olmasıdır.

Yazarların ifşa edecek herhangi bir potansiyel çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Tayvan Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden (NSTC) (NSTC 113-2314-B-A49-047) bir araştırma hibesi ile desteklenmiştir.