Développement d’un modèle simple de traumatisme craniocérébral léger modifié par la méthode de chute de poids et mis en évidence par imagerie par résonance magnétique

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle animal de traumatisme crânien fermé reproduisant le résultat de la neuroimage d’une lésion cérébrale traumatique légère non compliquée avec la structure cérébrale préservée dans la phase aiguë et l’atrophie cérébrale à long terme. L’imagerie par résonance magnétique longitudinale est la principale méthode utilisée pour la preuve.

Les lésions cérébrales traumatiques légères (TCL), connues sous le nom de commotions cérébrales, représentent plus de 85 % des lésions cérébrales dans le monde. Plus précisément, les traumatismes crâniens légers non compliqués qui montrent des résultats négatifs à l’imagerie clinique de routine en phase aiguë entravent les soins précoces et appropriés chez ces patients. Il a été reconnu que différents paramètres d’impact peuvent affecter et même accélérer la progression des symptômes neuropsychologiques ultérieurs après un TCL. Cependant, l’association des paramètres d’impact pendant la commotion cérébrale avec l’issue n’a pas été examinée en profondeur. Dans la présente étude, un modèle animal avec un traumatisme crânien fermé (CHI) modifié à partir du paradigme de la perte de poids a été décrit et démontré en détail. Des rats Sprague-Dawley mâles adultes (n = 20) ont été répartis au hasard dans des groupes d’IRC avec différents paramètres d’impact (n = 4 par groupe). Des études d’imagerie IRM longitudinales, y compris l’imagerie pondérée en T2 et l’imagerie du tenseur de diffusion, ainsi que des évaluations comportementales séquentielles, telles que le score de gravité neurologique modifié (mNSS) et le test de marche en faisceau, ont été menées sur une période d’étude de 50 jours. Une coloration immunohistochimique pour l’astrogliose a été réalisée le 50e jour après la blessure. Une moins bonne performance comportementale a été observée chez les animaux après un CHI répétitif par rapport au groupe de blessure unique et de simulacre. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) longitudinale a permis d’observer une contusion cérébrale significative 24 heures après la blessure. Néanmoins, une atrophie corticale et une altération de l’anisotropie fractionnelle corticale (AF) ont été démontrées au 50e jour après la blessure, suggérant la réplication réussie d’un TCL clinique non compliqué. Plus important encore, les changements dans les résultats neurocomportementaux et les caractéristiques de l’image observés après un TCL dépendaient du nombre d’impacts, des intervalles entre les blessures et du site d’impact choisi chez les animaux. Ce modèle de TCLm in vivo , combiné à l’IRM préclinique, offre un moyen d’explorer les lésions cérébrales à l’échelle du cerveau entier. Il permet également d’étudier des biomarqueurs d’imagerie sensibles aux TCL à travers différents paramètres d’impact et niveaux de gravité.

Les traumatismes craniocéphaliques légers (TCL) sont principalement observés chez les athlètes pratiquant des sports de contact, les anciens combattants et les personnes impliquées dans des accidents de la route¹. Il représente plus de 85 % de tous les traumatismes crâniens signalés². La vaste étiologie du TCL et son incidence mondiale croissante soulignent l’inclusion du TCL comme facteur de risque environnemental provisoire de la maladie neurodégénérative tardive³. Un traumatisme crânien léger non compliqué se caractérise par un score de coma de Glasgow (GCS) de 13-15, sans anomalie structurelle observée dans la tomodensitométrie (TDM) ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Les symptômes courants ressentis par les patients atteints d’un TCL non compliqué comprennent des maux de tête, des étourdissements, des nausées ou des vomissements et de la fatigue. Cependant, l’évaluation longitudinale des résultats après un TCL non compliqué présente des défis considérables en raison du taux élevé d’abandon chez les patients⁴.

Les préoccupations concernant les traumatismes crâniens légers répétitifs ont augmenté, en particulier au sein de la communauté des athlètes professionnels de la National Football League (NFL), ce qui a permis de sensibiliser les athlètes non professionnels⁵. On présume que la vulnérabilité cérébrale augmente après le TCL initial, les insultes ultérieures pouvant exacerber les conséquences des blessures. Des résultats récents de la plus grande cohorte de joueurs de football ayant fait don de cerveaux ont non seulement impliqué une participation antérieure au football dans la gravité de l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC), mais ont également suggéré une corrélation entre différents facteurs liés au football et le risque et la gravité de l’ETC⁶. Par conséquent, l’influence du nombre de commotions cérébrales et du régime répétitif sur les conséquences des blessures suscite de plus en plus d’inquiétudes. La recherche préclinique a exploré les changements neuropathologiques, la cascade neuroinflammatoire et les troubles neuropsychologiques après un traumatisme crânien répétitif en utilisant divers modèles de traumatismes crâniens fermés (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . Cependant, l’étude des paramètres d’impact sur le modèle de TCL non compliqué, qui peut imiter étroitement les chocs répétitifs à la tête liés au sport entraînant une déficience fonctionnelle dans la phase aiguë et une atrophie cérébrale dans la phase chronique, n’a pas été bien examinée.

L’imagerie du tenseur de diffusion (DTI), une technique d’évaluation de la diffusion des molécules d’eau, a été couramment utilisée dans les études portant sur les effets des TCL. L’anisotropie fractionnelle (AF), une mesure clé dérivée du DTI, quantifie le degré de cohérence de la diffusivité de l’eau et fournit des informations sur l’organisation structurelle des axones et des faisceaux de fibres nerveuses. La perturbation des valeurs de FA dans la substance blanche (WM) a été proposée à la suite d’un TCL dans divers modèles 8,10,11,15,16,17. De plus, la diffusivité axiale (DA) et la diffusivité radiale (DR), indiquant l’intégrité axonale et myéline, ont changé après un TCL dans les études précliniques 10,15,16,18,19,20. Cependant, les divergences entre les résultats de l’ITD et ceux des études antérieures sont probablement dues à des variations dans la gravité des TCL, à des différences dans les paramètres d’impact, à la diversité des modèles de TCL et à des points temporels de suivi post-blessure^{incohérents 9}.

Le présent document de protocole vise donc à établir un modèle animal de TCLm conçu pour évaluer les effets cumulatifs des TCL uniques et répétitifs. Nous avons intégré des évaluations complètes et longitudinales, y compris des évaluations du bien-être animal, des résultats comportementaux, des paramètres DTI et du volume cortical, afin de saisir les changements dynamiques post-blessure et d’explorer les effets de différents paramètres d’impact. En démontrant à la fois une déficience fonctionnelle aiguë et des changements microstructurels à long terme, ce modèle reproduit efficacement les principales caractéristiques des traumatismes crâniens légers non compliqués qui n’ont pas été entièrement abordées dans les études animales précédentes. Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour développer un modèle simple de TCL à l’aide d’une méthode modifiée de chute de poids à tête fermée ^8,11 et effectuer une évaluation longitudinale après un TCL.

L’étude a été réalisée conformément aux recommandations des National Institutes of Health Guidelines for Animal Research (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) et des lignes directrices Animal Research : Reporting In Vivo Experiments. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale Yang Ming Chiao Tung. Vingt animaux ont été répartis aléatoirement en 5 groupes (n = 4 par groupe) : (i) impact simple au niveau du cortex sensorimoteur (SMCx/simple), (ii) double impact au SMCx avec l’intervalle de 1 h (SMCx/2 coups/1 h), (iii) double impact au SMCx avec l’intervalle de 10 min (SMCx/2 coups/10 min), (iv) double impact au cerveau central avec l’intervalle de 1 h (Central/2 coups/1 h), et (v) le groupe placebo avec chirurgie seulement, mais sans impact direct à la tête, pour l’évaluation longitudinale des résultats (figure 1). Il convient de noter que les intervalles entre les blessures sélectionnés pour cette étude (intervalles de 1 h par rapport à 10 minutes) ont été conçus pour imiter les impacts sous-commotionnels répétitifs 8,10,11,13,21, qui peuvent être jusqu’à mille fois au cours d’une même saison, subis par les athlètes pratiquant des sports de contact ^22,23.

1. Induction d’un traumatisme crânien fermé (CHI)

REMARQUE : Les rats Sprague-Dawley mâles adultes âgés de 10 à 12 semaines et pesant plus de 250 g sont logés sous un cycle lumière/obscurité de 12/12 h avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.

1. Placez le rat dans une petite chambre d’induction et anesthésiez-le avec un mélange d’isoflurane (5 %) et d’air médical (2,5-3 L/min). Retirez le rat de la chambre jusqu’à ce qu’il ne réponde plus à un pincement de la patte ou de la queue.
2. Placez le rat sur le coussin chauffant.
   REMARQUE : Allumez le coussin chauffant pendant la chirurgie pour maintenir la température corporelle des rats.
3. Amenez le rat sur un cadre stéréotaxique et fixez-le avec une barre dentée. Administrer l’isoflurane à 2 % à l’aide du cône nasal connecté avec de l’air médical à un débit de 1,5 à 2 L/min pour l’entretien pendant la chirurgie.
4. Positionnez les barres d’oreille. Assurez-vous que le rat est centré et symétrique sur le cadre stéréotaxique.
   REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales doivent être effectuées dans des conditions aseptiques. Les instruments ont été stérilisés avant l’opération à l’aide d’un autoclave à vapeur, et leurs pointes ont été stérilisées avec un stérilisateur à billes pendant la procédure. Pour éviter toute contamination, un champ chirurgical a été placé sur l’animal. Le chirurgien portait un bonnet pour couvrir leurs cheveux, un masque pour couvrir leur visage, et était équipé d’une blouse de laboratoire et de gants chirurgicaux pendant la procédure^24.
5. Placez le capteur de l’oxymètre de pouls sur la patte arrière de l’animal pour surveiller la fréquence respiratoire, la fréquence cardiaque, le niveau d’oxygène dans le sang et la température corporelle de l’animal.
6. Injecter 1 mL/kg de poids corporel de lidocaïne (20 mg/mL) par voie sous-cutanée dans le cou du rat comme analgésique.
7. Appliquez la crème dépilatoire sur la tête de l’animal et attendez 3 min. Essuyez la crème avec des tampons d’alcool isopropylique à 70 %.
8. Nettoyez plusieurs fois la zone rasée à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé d’iode. Éliminez les résidus d’iode à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %.
9. Créez une incision médiane d’environ 2 à 2,5 cm de longueur dans la peau rasée à l’aide d’une lame chirurgicale stérile pour accéder à la surface du crâne.
10. Retirez le tissu de l’os à l’aide d’un coton pour exposer le crâne. Nettoyez la surface du crâne à l’aide d’un coton-tige imbibé de solution saline à 0,9 %, puis nettoyez-le avec un coton sec.
    REMARQUE : Les sutures du crâne et le bregma et le lambda peuvent maintenant être facilement identifiés.
11. Identifiez le bregma comme point de référence pour déterminer plus précisément la zone d’impact en fonction de la coordonnée.
    REMARQUE : Dans ce protocole, deux ensembles de coordonnées sont utilisés pour l’induction du CHI : (-2,5,--2,0) (2,5 mm latéraux 2,0 mm postérieurs au bregma) au-dessus du cortex sensorimoteur (SMCx), ainsi que (0,-3,0) au-dessus du cerveau central (central).
12. Identifiez les coordonnées choisies à la surface du crâne et collez un casque circulaire en acier inoxydable (10 mm de diamètre et 1 mm d’épaisseur) sur la zone désignée à l’aide de ciment dentaire. Retirez le coussin chauffant et l’oxymètre de pouls.
13. Déplacez l’appareil stéréotaxique et le rat sur la table élévatrice (14 cm de longueur, 8 cm de largeur et 6,15 cm de profondeur) sous l’impacteur CHI.
14. Surélevez le corps du rat à l’aide d’une éponge en mousse (19 cm de longueur, 10 cm de largeur et 4 cm de profondeur, avec une densité de 18 kg/m³).
15. Retirez le rat des barres d’oreille du cadre stéréotaxique. Gardez le rat immobile sur la barre dentée reliée au cône nasal, délivrant 2 % d’isoflurane. Assurez-vous que la tête et le corps sont alignés au niveau de la direction rostrale-caudale.
16. Ajustez la table élévatrice pour éviter tout espace entre l’impacteur CHI et le casque. Éteignez l’isoflurane 5 s juste avant l’impact.
    REMARQUE : Pour spécifier le réflexe de redressement dû à une lésion cérébrale, l’arrêt temporaire de l’isoflurane a été effectué²⁵.
17. Larguez un laiton de 600 g d’une hauteur de 1 m à travers un tube en acier inoxydable (1 m de hauteur avec un diamètre intérieur de 20 mm pour dégager une colonne de poids en laiton inoxydable) jusqu’à l’impacteur sécurisé avec une pointe ronde visant le casque métallique.
    REMARQUE : Les animaux du groupe placebo n’ont pas subi d’impact, car la goutte de laiton a été libérée sans entrer en contact avec le casque sur la tête du rat.
18. Abaissez la table élévatrice. Retirez le rat du cadre stéréotaxique et placez-le en position couchée sur un coussin chauffant.
19. Enregistrez le moment du réflexe de redressement, c’est-à-dire le moment où l’animal tente de passer de la position couchée à la position couchée à la position couchée^26,27.
    REMARQUE : Les animaux soumis au CHI répétitif ont été anesthésiés à nouveau 3 min avant le 2ème^impact. Pour les animaux du groupe SMCx/double/10 min qui ne sont pas retournés à temps en position couchée, le temps correspondant du réflexe de redressement a été enregistré comme étant de 420 s.
20. Après l’enregistrement du réflexe de redressement, anesthésie à nouveau le rat avec de l’isoflurane en utilisant l’étape 1.1.
21. Immobilisez le rat avec le cadre stéréotaxique à l’aide de l’étape 1.2.
    REMARQUE : Après avoir confirmé la stabilité du casque sur le dessus du stull, répétez à nouveau les étapes 1.13-1.17 pour effectuer le^{2ème impact.}
22. Retirez le casque. Retirez tout le tissu conjonctif et le ciment sur le dessus du crâne.
23. Couvrez le crâne avec le ciment dentaire et laissez-le sécher. Vérifiez que le ciment dentaire est rigide et dur à l’aide de la pince à épiler.
    REMARQUE : Le ciment dentaire a été appliqué sur le crâne pour éliminer les artefacts de sensibilité causés par les interfaces crâne-air ou crâne-sang entre le crâne et le cuir chevelu après la chirurgie.
24. Fermez l’incision à l’aide de sutures chirurgicales en nylon 4-0 avec 4-5 nœuds indépendants.
    REMARQUE : La plaie mesure environ 2 à 2,5 cm de longueur. Assurez-vous que les sutures chirurgicales n’ont pas d’action capillaire et qu’elles sont faites de soie ou de nylon. Ne suturez pas l’incision à l’aide d’un seul nœud pour éviter l’ouverture de la plaie par le grattage de l’animal.
25. Appliquez des antibiotiques topiques (crème Dermanest) sur le site chirurgical pour prévenir les infections.
26. Injecter 1 mL/kg de poids corporel de carprofène (50 mg/mL) par voie sous-cutanée dans le cou comme analgésique post-opératoire.
27. Placez le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Une fois que le rat est assis droit, remettez-le dans la cage de la maison.
28. Administrer par voie orale 5 mL d’acétaminophène (24 mg/mL) mélangé à 200 mL d’eau à l’animal tous les jours comme analgésique pendant 3 jours consécutifs après la chirurgie.

2. Imagerie par résonance magnétique (IRM)

REMARQUE : L’image pondérée en T2 et l’imagerie du tenseur de diffusion sont réalisées à l’aide d’un système séquentiel TEP/IRM 7T avant le CHI, ainsi que 1 et 50 jours après la blessure (Figure 1). Une IRM de base a été réalisée dans la semaine précédant l’intervention CHI. Pour les évaluations à 1 et 50 jours après le CHI, les évaluations comportementales ont été effectuées le matin, suivies d’IRM l’après-midi le même jour.

1. Anesthésier le rat dans une petite chambre d’induction remplie d’un mélange d’isoflurane (5 %) et d’air médical (2,5-3 L/min).
2. Une fois que le rat ne répond plus à un pincement de la patte ou de la queue, suspendez temporairement l’anesthésie lors du transfert vers le berceau de l’animal en position couchée tête première.
3. Positionnez le rat dans le support de tête relié à un cône nasal, délivrant 2 % d’isoflurane avec de l’air médical à un débit de 1,5 à 2 L/min pour la maintenance pendant l’acquisition de l’image.
4. Fixez la tête avec un petit morceau de ruban adhésif pour éviter tout mouvement pendant le balayage.
   REMARQUE : Appliquez un peu de dentifrice sur la tête du rat le premier jour post-CHI pour prévenir les artefacts de susceptibilité magnétique dus à l’ablation du cuir chevelu^28,29.
5. Placez un coussin de pression sous le thorax du rat pour surveiller la respiration. Collez les clips de l’oxymètre sur le membre arrière pour surveiller la fréquence cardiaque.
6. Insérez la sonde rectale pour mesurer la température rectale. Couvrez le rat avec une couverture chauffante avec de l’eau chaude en circulation et un enveloppement de tissu pendant l’expérience pour maintenir la température corporelle.
   REMARQUE : Tout au long de l’expérience, surveillez les conditions physiologiques, y compris la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la température rectale. Avant le balayage, vérifiez tous les signaux physiologiques du rat pour vous assurer de la qualité du moniteur de signes vitaux.
7. Utilisez le système de positionnement laser du scanner TEP/IRM pour marquer le centre de la tête afin un alignement précis.
8. Déplacez automatiquement l’animal dans l’alésage de l’IRM à l’aide du système de transport motorisé d’animaux jusqu’à ce que le centre de la tête s’aligne avec l’isocentre du scanner.
   REMARQUE : Le système de transport d’animaux motorisé intégré au système TEP/IRM assure un positionnement précis des animaux et rationalise le flux de travail lors de la transition entre les modalités d’imagerie.
9. Obtenez la séquence IRM.
   1. Effectuez la localisation initiale et le réglage global.
   2. Utilisez la tranche sagittale du milieu et alignez la 8^ème tranche à partir de la tranche antérieure avec la décussation de la commissure antérieure.
      REMARQUE : Les tranches coronales sont positionnées perpendiculairement au plan horizontal défini par la ligne reliant la commissure antérieure et la base du cervelet, correspondant à un angle d’environ 15° par rapport à l’axe long du corps calleux. Les paramètres clés du balayage T2-RARE pour la tranche sagittale moyenne sont les suivants : temps de répétition (TR) = 2500 ms, temps d’écho (TE) = 44 ms, champ de vision (FOV) = 3,5 cm, taille de la matrice = 256 256, épaisseur de la tranche = 1 mm, nombre de tranches = 1, facteur RARE = 8, bande passante = 75 kHz, nombre de moyennes = 1, temps d’acquisition = 1 min 20 s.
   3. Utilisez l’acquisition rapide avec amélioration de la relaxation (RARE) avec suppression de la graisse et une bande de saturation sous le cerveau pour obtenir des images pondérées en T2 pour référence anatomique (Figure 2).
      REMARQUE : Les paramètres clés du balayage T2-RARE sont les suivants : temps de répétition (TR) = 3600 ms, temps d’écho (TE) = 40 ms, champ de vision (FOV) = 2 cm, taille de la matrice = 256 256, épaisseur de la tranche = 1 mm, nombre de tranches = 16, facteur RARE = 8, bande passante = 75 kHz, nombre de moyennes = 8, temps d’acquisition = 7 min 40 s.
   4. Utilisez un EPI à écho de spin à 4 prises pour acquérir des images du tenseur de diffusion (Figure 2).
      REMARQUE : Les paramètres clés du balayage DTI sont les suivants : TR = 3000 ms, TE = 28 ms, champ de vision (FOV) = 2 cm, taille de la matrice = 96 96, épaisseur = 1 mm, nombre de coupes = 16, durée de l’impulsion (δ) = 5 ms, temps entre les deux impulsions (Δ) = 15 ms, nombre de B0 = 5, nombre de directions = 30, Valeur b = 1000 s/mm³, bande passante = 150 kHz, nombre de moyennes = 4, temps d’acquisition = 14 min.
   5. Terminez le protocole d’analyse. Faites glisser le berceau de l’animal hors de l’aimant. Retirez l’animal du berceau.
   6. Transférez le rat dans une cage propre avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir sa température corporelle. Remettez le rat dans sa cage d’origine une fois qu’il a repris conscience.
10. Prétraitement de l’image
    REMARQUE : utilisez MRtrix3, le logiciel de cartographie paramétrique statistique (SPM) et des scripts MATLAB personnalisés pour le traitement et l’analyse des données.
    1. Débruitez les images DTI à l’aide de la commande MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. Supprimez les artefacts de sonnerie de Gibb des images DTI à l’aide de la commande MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. Co-enregistrez les images DTI avec les images pondérées T2 du sujet unique sur des balayages longitudinaux à l’aide des fonctions SPM (spm_coreg.m et spm_powell.m).
    4. Effectuez un décapage du crâne sur des images pondérées en T2 en contournant manuellement la zone du cerveau tranche par tranche, puis en supprimant les pixels dont l’intensité est inférieure au seuil calculé déterminé par la méthode³¹ d’Otsu (script MATLAB personnalisé thr_otsu2.m).
    5. Effectuer des co-enregistrements inter-sujets entre animaux d’un même groupe expérimental à l’aide des fonctions SPM (spm_coreg.m et spm_powell.m). Appliquez le masque cérébral aux images DTI correspondantes.
       REMARQUE : Le décapage du crâne est effectué pour réduire le temps de traitement de l’ordinateur.
    6. Calculez des cartes tensorielles basées sur DTI (script MATLAB personnalisé, tensormap.m).
    7. Calcul de cartes FA (script MATLAB personnalisé, calFA.m)
       REMARQUE : tous les scripts MATLAB personnalisés sont disponibles via la base de données suivante (https://doi-org.bdigitaluss.remotexs.co/10.57770/9ZESXD).
11. Analyse d’images-FA
    1. Dessinez des régions d’intérêt (ROI) dans le cortex et le corps calleux (CC) pour les trois tranches d’image consécutives sous la coordonnée de CHI.
       REMARQUE : Tous les retours d’enquête ont été dessinés manuellement et inspectés visuellement pour détecter les erreurs grossières par 2 chercheurs expérimentés qui ont ignoré les groupes expérimentaux.
    2. Extrayez et faites la moyenne de la valeur FA des ROI.
       REMARQUE : Pour le corps calleux situé sous le cortex, les pixels dont les valeurs sont < 0,35 ont été exclus de la zone d’intérêt sélectionnée afin d’éliminer les effets de volume partiel. Pour le cortex, tous les pixels avec des valeurs de FA < 0,35 dans le ROI ont été recrutés pour l’analyse.
12. Analyse d’image-Volume
    1. Dessinez manuellement des zones d’intérêt couvrant les régions corticales pour 11 coupes d’image consécutives à Bregma -7 à +3 mm.
       REMARQUE : Tous les retours d’enquête ont été dessinés manuellement par 2 chercheurs expérimentés à l’insu des groupes expérimentaux.
    2. Additionnez le nombre total de pixels des zones d’intérêt sur les tranches et transformez-les en volume en multipliant l’épaisseur de la tranche (1 mm).
    3. Normaliser le volume cortical après le CHI avec le volume correspondant avant CHI de chaque animal.
       REMARQUE : Normalisez les données pour éliminer les différences individuelles de volume cérébral entre les animaux avant la présentation.

3. Évaluation du comportement

REMARQUE : Les expériences comportementales sont réalisées à l’aide du test d’équilibre de la marche de faisceau et du mNSS avant le CHI, ainsi que sur 1 et 50 jours après le CHI (Figure 1). Toute l’évaluation a été effectuée par au moins deux observateurs afin d’assurer l’exactitude, la cohérence et l’objectivité des données recueillies.

1. Test d’équilibre de la marche sur la poutre
   1. Allumez la caméra vidéo et démarrez la minuterie.
   2. Placez les rats à une extrémité de la poutre d’équilibre (3 cm de profondeur, 3 cm de largeur, 80 cm de longueur et 60 cm au-dessus du sol).
   3. Arrêtez le chronomètre une fois que le rat a terminé un aller-retour, tombe ou se fige pendant 3 minutes.
      1. Au cours de l’expérience, observez l’état de l’animal pour l’évaluation à l’aide de mNSS 11,32,33,34. Suivez ces normes d’évaluation :
      2. Si le rat maintient l’équilibre avec une posture stable sur la poutre, attribuez un score de 0.
      3. Si le rat saisit le côté de la poutre, attribuez une note de 1.
      4. Si le rat tombe avec un membre de la poutre, attribuez-lui une note de 2.
      5. Si le rat tombe avec deux membres hors de la poutre ou tourne sur la poutre (>60 s), attribuez-lui une note de 3.
      6. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (>40 s), attribuez-lui une note de 4.
      7. Si le rat tente de se tenir en équilibre sur la poutre mais tombe (>20 s), attribuez-lui une note de 5.
      8. Si le rat n’essaie pas de se tenir en équilibre ou de s’accrocher à la poutre et tombe dans les 20 s, attribuez une note de 6.
      9. Si le rat ne parvient pas à terminer la tâche, considérez qu’il a pris le temps maximum de 3 minutes et attribuez-lui un score de 6.
   4. Planifiez des journées de test à des moments précis.
      REMARQUE : Excluez les rats qui n’ont pas terminé l’aller-retour en faisceau pour deux essais avant l’CHI de la chirurgie subséquente et de l’évaluation comportementale de suivi.
2. Score de gravité neurologique modifié (mNSS)
   REMARQUE : L’évaluation mNSS comprend des tests moteurs, des tests sensoriels, l’absence de réflexe, des mouvements anormaux, l’équilibre de la poutre et la marche au sol ^32,33, qui a été rapidement effectuée quotidiennement.
   1. Effectuer des tests de moteur.
      1. Soulevez le rat par la base de la queue et observez les réflexes de ses membres pendant environ 15 secondes pour évaluer la flexion et l’extension appropriées.
      2. Si une flexion normale est observée dans le membre antérieur, attribuez un score de 0. Si aucune flexion n’est observée, attribuez un score de 1.
      3. Si une flexion normale est observée dans les membres postérieurs, attribuez un score de 0. Si aucune flexion n’est observée, attribuez un score de 1.
      4. Si la tête se déplace de >10° par rapport à l’axe vertical dans les 30 s qui suivent le soulèvement du rat par la queue, attribuez un score de 0. Si ce n’est pas le cas, attribuez une note de 1.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   2. Effectuez des tests de mise en place des membres.
      REMARQUE : Le test de mise en place est effectué pour évaluer la coordination entre la fonction sensorielle (visuelle, sensation tactile et proprioception) et la fonction motrice.
      1. Abaissez lentement le rat vers la surface de la table. Observez si les pattes des rats ont atteint et se sont étirées vers la surface.
      2. Si les rats ont atteint la surface avec les deux membres tendus et vers l’avant, attribuez un score de 0. S’il y a un retard ou s’il n’y a pas de réponse, attribuez un score de 1.
      3. Placez le rat sur la surface et tirez la patte contre le bord de la table. Observez si sa patte revient à une position normale sur la surface de la table.
      4. Si des réponses de placement immédiates et normales sont observées, attribuez une note de 0. Si des réponses de placement différé sont observées, attribuez une note de 1. S’il n’y a pas de réponse, attribuez une note de 2.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   3. Observer l’absence réfléchie et les mouvements anormaux.
      1. Observez les secousses de la tête pour évaluer le réflexe du pavillon lorsque vous touchez le méat auditif avec l’extrémité en coton d’un coton-tige.
      2. Si un réflexe normal est observé, attribuez un score de 0. Si aucun réflexe n’est observé, attribuez une note de 1.
      3. Évaluez la présence du réflexe cornéen en touchant la cornée avec l’extrémité en coton d’un coton-tige.
      4. Si une réponse normale est obtenue, attribuez un score de 0. Si aucune réponse de clignement des yeux n’est déclenchée, attribuez un score de 1.
      5. Faites un claquement court et fort des mains. Observez la présence du réflexe de sursaut.
      6. Si un réflexe est observé, attribuez un score de 0. Si aucun réflexe n’est observé, attribuez une note de 1.
      7. Observez si le rat a des convulsions, une myoclonie ou une myodystonie.
      8. Si l’un d’entre eux se produit, attribuez une note de 1.
         REMARQUE : Un maximum de 4 scores seront attribués dans cette session du test.
   4. Effectuez le test d’équilibre de la poutre comme décrit précédemment (étape 3.1).
      REMARQUE : Un maximum de 6 scores sera attribué dans cette session du test.
   5. Effectuez le test de marche sur le sol.
      1. Préparez l’arène en plein champ (75 cm de longueur, 50 cm de largeur et 40 cm de profondeur). Assurez-vous qu’il est propre et exempt de tout signe d’odeur antérieur.
      2. Placez un rat au centre de l’arène en plein champ et observez comment le rat se promène dans l’arène.
      3. Si le rat effectue une promenade régulière, attribuez un score de 0.
      4. Si le rat ne peut pas marcher droit, attribuez un score de 1.
      5. Si le rat tombe du côté parétique après l’avoir posé sur le sol, attribuez un score de 3.
         REMARQUE : Un maximum de 3 scores sera attribué dans cette session du test.
   6. Additionnez tous les scores ; Le score maximum possible est de 18.
      REMARQUE : Le score le plus élevé indique un résultat moins bon.

4. Immunohistologie

1. Effectuer une perfusion transcardiaque³⁵.
   REMARQUE : La perfusion transcardiaque est effectuée après l’IRM 50 jours après l’CHI (Figure 1).
   1. Placez le rat dans une petite chambre d’induction et anesthésiez-le avec de l’isoflurane (5 %) jusqu’à ce qu’il ne réponde plus à un pincement de la patte ou de la queue.
   2. Administrer 50 mg/kg de poids corporel de zoletil (50 mg/mL) et 10 mg/kg de poids corporel de xylazine (Roumpun, 23,32 mg/mL) par injection intrapéritonéale pour une anesthésie profonde.
   3. Placez le rat en position couchée.
   4. Faites une incision transversale d’environ 4 à 5 cm de longueur sous le thorax à l’aide de ciseaux.
   5. Localisez le diaphragme et coupez-le pour exposer le cœur.
   6. À l’aide d’une pince hémostatique, clampez l’artère pulmonaire, puis faites une incision d’environ 0,5 à 1 cm de longueur dans l’oreillette droite.
   7. Connectez l’aiguille à la canalisation fixée à la pompe à perfusion.
   8. Insérez l’aiguille dans le ventricule gauche.
   9. Rincer l’animal par perfusion transcardiaque (40 mL/min) avec 500 mL de solution saline à 0,9 % jusqu’à ce que le sang soit éliminé.
   10. Perfuser l’animal par perfusion transcardiaque (40 mL/min) avec 500 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour la fixation.
   11. Retirez la tête du rat et retirez soigneusement le tissu cérébral du crâne.
   12. Conservez le cerveau dans environ 20 ml de PFA à 4 % dans la bouteille pendant 48 h pour la post-fixation.
2. Effectuer le traitement des tissus et la coloration IHC^36,37.
   REMARQUE : Effectuez une coloration immunohistochimique sur des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine à l’aide du kit du système de détection secondaire de l’immunoperoxydase.
   1. Utilisez des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine.
   2. Effectuer la déparaffinisation et traiter les lames avec 3 %_{de H2}O₂ pour bloquer l’activité de la peroxydase endogène. Effectuer le prélèvement de l’antigène à l’aide d’un tampon de citrate à 90 °C.
   3. Effectuer une coloration immunohistochimique à l’aide du kit du système de détection secondaire de l’immunoperoxydase.
      REMARQUE : Les procédures de coloration sont effectuées conformément aux recommandations du fabricant.
   4. Utilisez de l’hématoxyline pour contre-colorer les échantillons.
   5. Montez les échantillons avec un réactif anti-décoloration.
   6. Utilisez des anticorps anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour la coloration immunohistochimique.
   7. Acquérez les images des zones d’intérêt à l’aide d’un scanner de lames de microscope optique (Figure 6).

5. Analyse statistique des résultats du comportement et de l’image

REMARQUE : Dans la présente étude, une analyse statistique a été effectuée dans SPSS ; Cependant, l’analyse statistique peut être effectuée dans d’autres boîtes à outils statistiques.

1. Chargez les données au format large dans un fichier SPSS *.sav.
2. Effectuer une analyse de variance à mesures répétées (ANOVA) pour comparer les résultats comportementaux (poids normalisé, mNSS et durée de la marche en faisceau) et d’image (valeurs FA dans le cortex et CC) au fil du temps entre les groupes.
   1. Cliquez sur Analyser > modèle linéaire général > mesures répétées.
   2. Attribuez un nom dans la case Nom du facteur intra-sujet (par exemple, temps) et mettez « 3 » dans la case Nombre de niveaux (trois niveaux avec des points de suivi différents). Attribuez un nom dans la zone Nom de la mesure (par exemple, mNSS) dans la boîte de dialogue Définition du ou des facteurs de mesure répétée.
   3. Chargez les variables intra-sujet (données acquises avant J1, J1 et J50 après le CHI) qui doivent être testées et spécifiez le facteur inter-sujets (par exemple, des groupes d’animaux avec des paramètres d’impact différents) dans la boîte de dialogue Mesures répétées .
   4. Sélectionnez Bonferroni comme test a posteriori pour le(s) facteur(s) (par exemple, les groupes d’animaux) dans la boîte de dialogue Comparaisons multiples post-hoc pour les moyennes observées .
      REMARQUE : Pour corriger les comparaisons multiples, l’erreur de type I a été ajustée à l’aide des corrections de Bonferroni (0,05/3) pour les comparaisons au fil du temps. La signification statistique a été définie comme p < 0,05 (ajusté par le SPSS).
3. Effectuez une analyse ANOVA à sens unique pour comparer le réflexe de redressement et la variation du volume cortical entre les groupes.
   1. Cliquez sur Analyser > comparer les moyennes > ANOVA à un facteur.
   2. Chargez les variables (réflexe de redressement et changement du volume cortical) dans la liste dépendante et les groupes en tant que facteur dans la boîte de dialogue ANOVA à un facteur .
   3. Sélectionnez Bonferroni en tant que test a posteriori dans la boîte de dialogue ANOVA à un facteur : comparaisons multiples a posteriori .
      REMARQUE : Pour corriger les comparaisons multiples, l’erreur de type I a été ajustée à l’aide des corrections de Bonferroni (0,05/5) pour les comparaisons entre les groupes. La signification statistique a été définie comme p < 0,05 (ajusté par le SPSS).

La figure 2 montre les IRM longitudinales d’animaux représentatifs présentant un CHI simulé et répétitif au SMCx. Aucune fracture du crâne significative ou contusion cérébrale n’a été observée sur les images pondérées en T2 1 et 50 jours après le CHI. Aucun œdème ou déformation significatif de la MW n’a été trouvé dans les cartes FA 1 et 50 jours après l’CHI. Tous les animaux soumis à l’CHI dans cette étude ont survécu pendant toute la durée expérimentale de 50 jours, démontrant une faible mortalité (0-5 %)⁷ du modèle CHI.

Le degré d’altération de la conscience immédiatement après une lésion cérébrale a été évalué par la perte du réflexe de redressement, la propension intrinsèque à s’auto-corriger sa position, chez les animaux. Par rapport au CHI simulé et unique à SMCx, le temps nécessaire pour retrouver le réflexe de redressement a augmenté chez les animaux après un CHI répétitif (Figure 3A). Le bien-être général des animaux après l’ICM s’est reflété dans la modification du poids corporel normalisé et du mNSS. Aucune perte de poids significative n’a été observée après l’ICS entre les groupes (Figure 3B). Alors qu’un score mNSS plus élevé a été observé au jour 50 après un seul CHI, une augmentation significative du score mNSS a été observée au jour 1 après un CHI répétitif et s’est maintenue à un niveau élevé jusqu’au jour 50, quelle que soit la gravité et le site d’impact (figure 3C). L’élévation du mNSS induite par le CHI répétitif au niveau du cerveau central a diminué au jour 50, ce qui est significativement inférieur au CHI correspondant au SMCx. L’équilibre et la fonction motrice coordonnée chez le rat après CHI ont été évalués par le test de marche sur faisceau. Une augmentation significative de la durée de la marche sur la poutre a été observée le jour 1 après un CHI répétitif et maintenue élevée jusqu’au 50e jour, quelle que soit la gravité et le site d’impact (Figure 3D). La durée de la marche allongée induite par le CHI répétitif au niveau du cerveau central a diminué au jour 50, significativement plus courte que le CHI correspondant au SMCx.

Une diminution significative du volume cortical a été observée 50 jours après l’CHI (Figure 4A). Les volumes corticaux au jour 50 étaient de 99,63 % ± 2,15 %, de 95,98 % ± de 1,65 %, de 92,26 % ± de 2,22 % et de 90,28 % ± 1,17 % par rapport au volume de base, respectivement, dans le simulacre et après un ICM unique et répétitif avec les intervalles de 1 h et 10 minutes à SMCx (figure 4B). Le volume cortical au jour 50 était de 91,54 % ± de 1,98 % par rapport au volume de base après un CHI répétitif avec un intervalle de 1 h au niveau du cerveau central. Par rapport au groupe placebo, une perte corticale significative a été observée après un CHI. Par rapport au groupe CHI unique, une perte corticale significative a été observée après un CHI répétitif. Une réduction substantielle du volume cortical a été observée dans les coupes à Bregma -4 à +0 et Bregma -5 à +1 après un CHI répétitif avec les intervalles de 1 h et 10 minutes, respectivement (figure 4C). Comparé entre les animaux CHI avec des sites d’impact différents, un volume cortical significativement plus petit n’a été trouvé que dans la tranche à Bregma 0 après CHI au cerveau central. Bien qu’une atrophie corticale significative ait été signalée dans les^études précédentes et actuelles, des images pondérées en T2 à haute résolution spatiale, idéalement acquises en 3D, sont suggérées pour une analyse volumétrique précise. De plus, des études futures appliquant une approche d’enregistrement difféomorphique basée sur l’atlas³⁸ pourraient mieux aborder les changements cérébraux régionaux associés aux lésions cérébrales légères.

Les valeurs corticales d’AF pendant les IRM longitudinales ont été calculées pour indiquer les changements microstructurels provisoires après CHI. Après un seul CHI à SMCx, aucun changement significatif d’AF n’a été observé sous le site d’impact. Après une CHI répétitive au SMCx, une augmentation significative de l’AF corticale ipsi-lésionnelle a été observée dans le cortex au jour 50 par rapport au départ et 1 jour après le CHI répétitif avec l’intervalle de 1 heure (Figure 5A). De plus, une réduction significative de l’AF dans le cortex ipsi-lésionnel a été mise en évidence sur 1 jour après un CHI répétitif avec l’intervalle de 10 minutes, ce qui est significativement plus faible que celui après un CHI unique et répétitif avec l’intervalle de 1 heure. L’ICM au SMCx n’a pas induit de changements significatifs de l’AF dans le cortex du cerveau central (Figure 5B). Après un CHI répétitif au niveau du cerveau central, une augmentation significative de l’AF corticale sous le cerveau central a été observée dans le cortex au jour 50 par rapport au départ et au jour 1 (Figure 5B).

Après une ICM unique au SMCx, aucun changement significatif de l’AF n’a été observé dans le CC sous le SMCx ipsi-lésionnel (Figure 5A). Après une CHI répétitive au SMCx, une diminution significative de l’AF ipsi-lésionnelle dans la CC a été observée dans le cortex au jour 50 par rapport à l’inclusion et 1 jour après l’ICI répétitive avec l’intervalle de 1 h (Figure 5A). Une réduction de l’AF dans la CC ipsi-lésionnelle au jour 1, puis récupérée au jour 50, a été observée après une ICM répétitive avec un intervalle de 10 minutes. Dans la CC ipsi-lésionnelle, après un CHI répétitif avec l’intervalle de 10 minutes, une valeur d’AF significativement plus faible au jour 1 a été observée par rapport à l’IC répétitif avec l’intervalle de 1 h ; une valeur d’AF significativement plus élevée au jour 50 a été montrée par rapport à un ICM fictif, unique et répétitif avec l’intervalle de 1 heure. Après un CHI répétitif au niveau du cerveau central, une augmentation significative de l’AF dans le CC sous le SMCx ipsi-lésionnel a été observée au jour 1 par rapport au CHI au SMCx et au jour 50 par rapport au groupe placebo (Figure 5A).

La neuroinflammation après CHI a été évaluée par l’expression de GFAP au jour 50 après la blessure. Les résultats de l’immunocoloration ont démontré que les astrocytes s’accumulaient dans le SMCx ipsilesionnel après CHI, quelle que soit la gravité et le site d’impact (Figure 6).

Figure 1 : Schéma de la conception expérimentale. Schémas montrant les étapes clés, y compris l’induction des traumatismes crâniens fermés et le calendrier correspondant pour chaque évaluation. Des IRM et des évaluations comportementales avant l’CHI ont été effectuées dans les 7 jours précédant l’opération. Le temps nécessaire pour retrouver le réflexe de redressement a été évalué en fonction du degré d’altération de la conscience. Des données longitudinales d’IRM et de comportement ont été recueillies 1 et 50 jours après l’ICH. Les rats ont été sacrifiés à la fin de toutes les expériences, suivis d’une immunohistologie. Abréviation : SMCx/single = impact unique au niveau du cortex sensorimoteur ; SMCx/2 coups/1 h = double impact à SMCx avec l’intervalle de 1 h ; SMCx/2 coups/10 min = double impacts au SMCx avec l’intervalle de 10 minutes ; Central/2 coups/1 h = doubles impacts au cerveau central avec l’intervalle de 1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images RM représentatives après CHI. Les images pondérées en T2 (rangée du haut) et les cartes de l’AF (rangée du bas) de l’animal représentatif avant et au jour 1 et 50 après le simulacre et le double CHI au SMCx avec l’intervalle de 10 minutes. Pas de contusion focale sur les images pondérées en T2 après CHI expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Déficits comportementaux après CHI avec différents paramètres d’impact. (A) Le temps pour retrouver le réflexe de redressement après le dernier impact. Le temps du réflexe de redressement a augmenté après un CHI répétitif au SMCx. (B) Aucune différence significative dans le poids corporel normalisé après CHI (normalisé à la ligne de base pré-CHI) entre les groupes. Une augmentation de la durée de la mNSS (C) et de la durée de la marche en faisceau (D) a été observée après un CHI répétitif. Alors que la durée du mNSS et de la marche par faisceau est restée élevée après le CHI au SMCx, ils se sont rétablis après le CHI au niveau du cerveau central au jour 50. ANOVA à un facteur avec test post hoc de Bonferroni pour le temps du réflexe de redressement ; ANOVA répétée avec test post hoc de Bonferroni pour le poids normalisé, le mNSS et la durée de réveil du faisceau : *, p < 0,017 entre les points temporels ; +, p < 0,05 contre le simulacre ; #, p < 0,05 par rapport à SMCx/simple ; §, p < .05 vs. SMCx/2 coups sûrs/1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Atrophie corticale à 50 jours post-CHI avec différents paramètres d’impact. (A) Alignement des tranches sur l’image sagittale moyenne. La ligne bleue indique le plan horizontal reliant la commissure antérieure et la base du cervelet ; La ligne pointillée indique l’axe long du corps calleux. (B) Zones d’intérêt corticales illustratives (rouge) superposées sur des images pondérées en T2 dans les tranches d’images représentatives pour la mesure du volume cortical. (C) La variation du volume cortical après CHI a été représentée comme le pourcentage du volume de base entre différentes coupes à Bregma -7 à +3 mm. Une diminution du volume cortical 50 jours après l’CHI a été démontrée et dépendait des paramètres d’impact. Les données sont exprimées en moyens ± std. ANOVA à un facteur avec test post hoc de Bonferroni : +, p < 0,05 vs. simulacre ; #, p < 0,05 par rapport à SMCx/simple ; §, p < .05 contre SMCx/2 coups/1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Changements longitudinaux de l’AF après CHI avec différents paramètres d’impact. Les ROI segmentés automatiquement sont le cortex (vert) et le corps calleux (CC) (rouge) profondément jusqu’au site d’impact au niveau (A) SMCx et (B) du cerveau central. L’encart montre l’image 3D du cerveau avec la tranche sous le site de l’impact. Le suivi longitudinal des valeurs d’AF acquises avant et 1 et 50 jours après l’CHI a été présenté en moyenne ± std. L’altération de l’AF après des ICM répétés était importante et dépendait des paramètres d’impact. ANOVA répétée avec test post hoc de Bonferroni : *, p < 0,05 entre les points temporels ; +, p < 0,05 contre le simulacre ; #, p < 0,05 par rapport à SMCx/simple ; §, p < .05 contre SMCx/2 coups/1 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Neuroinflammation induite par le CHI 50 jours après la blessure dans le cortex sous le site d’impact. Images représentatives du cortex cérébral sous le site d’impact avec coloration GFAP. L’accumulation d’astrocytes (flèches) dans le cortex a été observée après CHI. Barre d’échelle = 40 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette étude visait à établir un modèle animal de traumatisme craniocérébral léger (TCLm) non compliqué afin d’évaluer les effets cumulatifs des lésions uniques et répétitives, ainsi que les résultats des impacts sur différentes régions du cerveau. Le modèle de blessure à la tête fermée (CHI), adapté du paradigme de la blessure à tête fermée et à la chute de poids, a été conçu pour imiter les commotions cérébrales couramment vécues par les athlètes et les personnes portant un casque. Ce modèle minimise les lésions cérébrales focales tout en permettant la manipulation précise des paramètres d’impact clés, y compris le nombre d’impacts, les intervalles entre les blessures et les régions d’impact. Les résultats ont démontré que ces paramètres influençaient significativement la progression des résultats comportementaux et des valeurs d’anisotropie fractionnaire (FA). Notamment, une atrophie corticale substantielle, une caractéristique caractéristique de l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC), a été observée pendant la phase chronique, indépendamment de la charge d’impact ou de l’emplacement. Ce modèle expérimental fournit un cadre solide pour les études longitudinales des changements fonctionnels et microstructurels à la suite d’un TCL non compliqué, comblant ainsi les lacunes des modèles animaux précédents.

Pour reproduire les TCL observés dans des scénarios cliniques tels que les sports de contact ou les accidents de moto, divers modèles de casques pour rongeurs ont été mis en œuvre dans divers modèles d’animaux⁷. L’impact sur le crâne ou la tête fermé entraîne généralement des lésions cérébrales plus légères et plus diffuses par rapport à ceux ciblant la surface cérébrale exposée^15,39. Néanmoins, il a été reconnu qu’une grande variabilité des résultats entre les animaux a été observée lors de l’utilisation de casques fixes, principalement en raison de l’incohérence de l’emplacement du site d’impact⁴⁰. Le modèle CHI de cette étude a été modifié à partir du modèle de perte de poids de Marmarou, dans lequel un disque métallique a été placé sur le crâne⁴¹. Nous avons affiné la méthodologie originale en utilisant un disque plus mince (1 mm) et en intégrant une pointe d’impacteur fixe pour atténuer le risque de fracture du crâne. Nos résultats précédents de micro-tomodensitométrie (TDM) ont corroboré l’absence de micro-fractures discernables après CHI¹¹. Un autre avantage de l’utilisation d’une pointe d’impact fixe dirigée vers le disque cimenté est qu’elle facilite un contrôle précis du site d’impact, ce qui nous permet de sonder systématiquement l’effet du site d’impact sur les résultats expérimentaux. Il convient de noter que l’incision du cuir chevelu et l’anesthésie dans le modèle actuel peuvent induire des réponses immunitaires et inflammatoires supplémentaires, en particulier dans la phase aiguë. L’utilisation d’animaux éveillés et dont le cuir chevelu est intact pourrait aider à atténuer ces effets et à améliorer la translatibilité aux cas cliniques de lésions cérébrales sous-commotionnelles¹⁰.

L’effet cumulatif du CHI sur le comportement et l’image a été démontré par des scores mNSS significativement plus élevés, une durée plus longue pour accomplir les tâches de marche en faisceau (Figure 3), un volume cortical plus petit (Figure 4B) et une altération des valeurs FA (Figure 5A) chez les animaux après le rCHI par rapport aux groupes simulés ou à blessure unique. De plus, des valeurs d’AF significativement plus faibles dans le cortex et la CC au jour 1 après la blessure (figure 5A) et un volume cortical réduit au jour 50 (figure 4B) ont été observés chez les animaux soumis à un CHI répétitif avec un intervalle de 10 minutes par rapport à ceux avec un intervalle de 1 heure, ce qui suggère des résultats pires avec des intervalles plus courts entre les blessures. Lorsque les lésions répétitives ont été infligées avec un intervalle de 1 heure, les animaux ayant subi des impacts au-dessus du SMCx ont présenté des scores mNSS plus élevés (figure 3C) et des durées de marche du faisceau plus longues (figure 3D) par rapport aux impacts au-dessus du cerveau central, ce qui indique que les résultats de l’ICM dépendent du site d’impact. En plus de l’altération de FA, une diminution de la DA dans WM 10,11,19 et une augmentation de DR dans GM 10,16,18 ont été proposées après le CHI. Des recherches futures intégrant une analyse complète de l’ensemble des paramètres DTI pourraient fournir des informations plus approfondies sur la façon dont différents paramètres d’impact influencent la progression et les résultats de l’CHI. Le modèle proposé pourrait également être appliqué à des rats et des souris adolescents. Cependant, d’autres ajustements, notamment la hauteur et le poids des chutes, ainsi que la dimension du casque, méritent d’être explorés et validés à l’avance.

Le réflexe de redressement, un comportement animal inné caractérisé par la capacité de se réorienter et de se tenir debout spontanément, sert d’indice de substitution pour évaluer la perte de conscience (LOC) chez l’homme⁴². Afin de documenter le temps nécessaire pour retrouver le réflexe de redressement après l’CHI, des anesthésiques inhalés doivent être utilisés à la place des anesthésiques injectables lors de l’induction de l’CHI. De plus, l’arrêt temporaire de l’isoflurane immédiatement avant l’CHI est nécessaire²⁵. Il est recommandé de surveiller les changements de poids corporel après un traumatisme crânien pour indiquer une déficience globale⁴³. Aucun changement significatif du poids corporel normalisé après l’ICS n’indique la légèreté de la lésion cérébrale dans le modèle décrit ici. La NSS modifiée et la durée de la marche en faisceau ont été largement utilisées pour évaluer le bien-être général et la fonction vestibulomotrice après une lésion cérébrale⁴⁴. Étant donné que l’évaluation comportementale et les expériences d’IRM ont été effectuées le même jour après l’CHI, les tests comportementaux ont été effectués avant les examens IRM pour toutes les évaluations de suivi afin d’éviter l’interférence de l’anesthésie avec les résultats comportementaux mesurés (Figure 1). De plus, les animaux présentant une mauvaise coordination motrice, ce qui pourrait également augmenter le score mNSS, devraient être exclus sur la base du test pré-CHI. Nos résultats, conformes à l’étude précédente, ont montré des scores mNSS significativement plus élevés et une durée de marche prolongée après un CHI¹¹ répétitif. De plus, nous avons démontré que les scores mNSS et la durée de la marche en faisceau dépendent du site d’impact de l’ICS, en particulier au jour 50 après la blessure.

L’IRM longitudinale, qui facilite l’évaluation des structures cérébrales à macro et à méso-échelle au fil du temps, représente un outil crucial pour valider la fidélité du modèle CHI présenté ici dans la réplication des caractéristiques des TCL non compliqués. Lors de l’acquisition de l’image, en particulier le jour 1 post-CHI, les paramètres physiologiques, notamment la température, la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque de l’animal, doivent être bien surveillés. Par conséquent, la concentration d’isoflurane doit être soigneusement ajustée à temps pour maintenir la stabilité physiologique. Alors que l’EPI à quatre coups a été utilisé dans l’étude actuelle pour l’acquisition d’images DTI, l’EPI à un seul coup peut également être utilisé pour réduire les artefacts de mouvement en raison du temps de balayage relativement court. Le traitement et l’analyse d’images de l’IRM préclinique sont cruciaux, car la plupart des études reposent encore sur des pipelines d’analyse sur mesure développés par des équipes de recherche individuelles⁴⁵. Si l’algorithme personnalisé, comme Matlab dans l’étude actuelle, est inaccessible, la mesure du volume et l’extraction de l’intensité du signal peuvent être effectuées à l’aide d’ImageJ, un logiciel open source, pour les images scientifiques basées sur des images pondérées en T2 et des cartes FA, respectivement. Pour une analyse précise des images IRM acquises à plusieurs points temporels, le co-enregistrement des sujets internes doit être effectué en premier. Étant donné les variations inter-sujets du volume cérébral, même aux mêmes âges postnatals, la normalisation du volume cérébral post-lésion à son volume de base pour chaque sujet est essentielle pour délimiter l’atrophie corticale induite par CHI⁴⁶. Pour l’analyse AF, le seuil de séparation de la matière grise (MG) et de la MW adjacentes doit être effectué afin d’éliminer les effets de volume partiels. Il est important de noter que les valeurs FA sont influencées par l’intensité du champ magnétique⁴⁷ et le nombre de gradients de diffusion utilisés dans DTI⁴⁸. Le réglage du seuil de FA dans la présente étude peut donc ne pas être généralement applicable aux images DTI acquises à l’aide de protocoles ou de scanners IRM différents.

Étant donné que les TCL, en particulier les TCL non compliqués, sont souvent invisibles par la neuroimagerie conventionnelle dans la phase aiguë, les efforts de recherche se sont concentrés sur l’identification de marqueurs d’image efficaces et avancés pour capturer et fournir des informations pronostiques sur les symptômes post-blessure^{ultérieurs 49,50}. L’hétérogénéité des cas cliniques de TCLm ajoute encore plus de complexité et d’incohérence dans les données. Dans ce modèle de TCL simple et simple, nous avons observé des changements micro et macrostructurels significatifs dans l’imagerie ainsi que des déficits comportementaux mesurables, fournissant une plate-forme pour suivre longitudinalement les biomarqueurs potentiels de neuroimagerie après une blessure. Notamment, les changements dépendants des paramètres d’impact dans l’imagerie et les résultats fonctionnels dans le modèle CHI suggèrent la possibilité d’identifier des biomarqueurs de neuroimagerie sensibles à la gravité des blessures et aux paramètres d’impact. Conformément aux résultats précédents montrant des corrélations entre des paramètres DTI spécifiques et l’astrogliose⁸, des études futures examinant la relation entre divers traits d’image, altérations microscopiques et résultats fonctionnels pourraient établir des biomarqueurs non invasifs prometteurs pour les changements cellulaires sous-jacents et le pronostic des symptômes après un TCLm.

Dans cette étude, plusieurs limites ont dû être prises en compte. Tout d’abord, la taille de l’échantillon pour chaque groupe de paramètres d’impact est relativement petite (n = 4 par groupe) et la gamme des paramètres d’impact testés est limitée. Malgré la petite taille de l’échantillon, nous avons observé des différences significatives dans la mesure comportementale, les valeurs d’AF et le volume cortical entre les groupes CHI. Combinés aux études précédentes utilisant différents paramètres d’impact ^8,11, nos résultats soutiennent une étude plus approfondie sur de grands échantillons avec une gamme plus large de paramètres à tester. Deuxièmement, comme pour la plupart des études sur les animaux TCC ^7,9, seuls des rats mâles ont été utilisés dans les expériences actuelles. Des recherches récentes ont rapporté des différences entre les sexes dans les changements des paramètres DTI dans la MW après un CHI répétitif chez la souris, mettant en évidence des réponses spécifiques au sexe après une lésion cérébrale¹⁰. Des études futures portant sur des animaux mâles et femelles exploreront la réponse divergente des sexes aux paramètres d’impact de l’ICH. Enfin, bien que des changements de FA aient été observés après l’étude CHI et entre différents groupes CHI, le prétraitement du signal de diffusion a pu être affiné. L’intégration de techniques plus sophistiquées, telles que la correction des courants de Foucault, la correction de la polarisation du champ magnétique, etc., ainsi que l’image de diffusion multicouche¹⁷ peut encore améliorer la sensibilité des signaux DTI pour détecter les dommages microstructurels induits par les TCL.

Avec le protocole actuel, nous avons démontré la structure cérébrale préservée ainsi qu’un déficit comportemental significatif dans la phase aiguë après CHI. L’analyse ultérieure a révélé une perte notable de volume cérébral cortical et des valeurs de FA modifiées dans la phase chronique. Plus important encore, les résultats comportementaux et neuro-imageurs dépendaient des paramètres d’impact utilisés pour induire l’ICH, y compris le nombre d’impact, l’intervalle entre les blessures et le site d’impact. Par rapport aux modèles de TCL publiés, qui se concentrent principalement sur les résultats comportementaux ou la neuroinflammation dans le cerveau, cette étude a utilisé une approche complète englobant l’évaluation systémique et globale du cerveau après le CHI. En examinant à l’aide de l’IRM longitudinale, le modèle CHI a présenté une intégrité structurelle préservée dans la phase aiguë mais une atrophie corticale prononcée dans la phase chronique, suggérant la réplication réussie du TCL non compliqué. L’importance de l’étude est qu’il est possible d’explorer comment les différents paramètres d’impact modifient le cerveau après un TCL et de développer des biomarqueurs d’image provisoires pour cette lésion cliniquement silencieuse.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts potentiel à divulguer.

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche du Conseil national des sciences et de la technologie (NSTC) de Taïwan (NSTC 113-2314-B-A49-047).