Glioma Kök Hücre Hatlarında Sferoid İlaç Duyarlılık Taraması

İn vitro ilaç duyarlılık ekranları, anti-kanser ilaç kombinasyonlarını keşfetmek için önemli araçlardır. Küreler halinde yetiştirilen hücreler, farklı sinyal yollarını aktive eder ve tek katmanlı hücre dizilerinden daha fazla in vivo modelleri temsil ettiği düşünülür. Bu protokol, sferoid çizgiler için in vitro ilaç taraması için bir yöntemi tanımlar.

İn vitro ilaç duyarlılık ekranları, anti-kanser ilaç kombinasyon tedavilerinin keşfinde önemli araçlardır. Tipik olarak, bu in vitro ilaç taramaları, tek tabakalı olarak büyütülen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu iki boyutlu (2B) modeller, üç boyutlu (3B) küresel hücre modellerine kıyasla daha az doğru olarak kabul edilir; Bu özellikle glioma kök hücre hatları için geçerlidir. Küreler halinde yetiştirilen hücreler, farklı sinyal yollarını aktive eder ve tek katmanlı hücre dizilerinden daha fazla in vivo modelleri temsil ettiği düşünülür. Bu protokol, sferoid hatların in vitro ilaç taraması için bir yöntemi tanımlar; Örnek olarak fare ve insan glioma kök hücre hatları kullanılmıştır. Bu protokol, bir ilacın veya ilaç kombinasyonunun hücre ölümüne neden olup olmadığını ve iki ilacın sinerji oluşturup oluşturmadığını belirlemek için kullanılabilecek bir 3D küresel ilaç duyarlılığı ve sinerji testini tanımlar. Glioma kök hücre hatları, RFP'yi ifade etmek için modifiye edilir. Hücreler alçak ataşmanlı yuvarlak kuyu dibi 96 plakaya kaplanır ve kürelerin gece boyunca oluşmasına izin verilir. İlaçlar eklenir ve doku kültürü inkübatörüne gömülü bir floresan mikroskobu olan Incucyte canlı görüntüleme sistemi kullanılarak zaman içinde RFP sinyali ölçülerek büyüme izlenir. Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50), medyan ölümcül doz (LD50) ve sinerji skoru daha sonra tek başına veya kombinasyon halinde ilaçlara duyarlılıkları değerlendirmek için hesaplanır. Bu testin üç boyutlu doğası, in vivo olarak tümör büyümesinin, davranışının ve ilaç duyarlılıklarının daha doğru bir şekilde yansıtılmasını sağlar ve böylece daha fazla klinik öncesi araştırma için temel oluşturur.

Glioblastom, beş yıllık genel sağkalım% 5 ile beynin yıkıcı, yüksek dereceli bir neoplazmıdır¹. Glioblastoma gibi yüksek dereceli gliomlar (HGG), pediatrik popülasyonda^kansere bağlı mortalitenin önde gelen nedenini temsil eder 2 ve yetişkinlerde olduğu kadar yetişkinlerde de tedavi edilmesi en inatçı tümörlerden biridir³. HGG'nin moleküler itici güçlerine ilişkin anlayışımızdaki önemli ilerlemelere rağmen, tedavi seçenekleri sınırlı kalmaktadır³ ve bu da klinikte terapötik duyarlılıkları daha doğru bir şekilde öngören ilaç tarama yöntemlerine olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

3D hücre kültürleri öncelikle fizyolojik olarak ilgili hücre davranışının modellenmesi için kullanılmıştır⁴. Ayrıca, tümör mikroçevresinin 3D mimarisi, 3D büyüme deneyleri^{oluşturularak} in vitro olarak özetlenebilir 5. Sferoid büyümesi ayrıca farklı sinyal yollarını aktive eder ve bu nedenle 2D kültüre kıyasla in vivo modellerin ^6,7'sini daha iyi temsil ettiği düşünülür. Pediatrik HGG kök hücresi ve fare NF1 glioma kök hücre dizileri doğal olarak nörosferler olarak büyür ve bu fare NF1 glioma hücre dizilerini orta verimli bir ilaç ekranında⁸ kullanır. Burada kullanılan pediatrik hatlar hemisferik, orta hat ve serebellar pediatrik HGG'den türetilmiştir ve Çocuk Beyin Tümörü Ağı'ndan (mutasyon ve gen ekspresyon profilleri) elde edilmiş ve tam olarak karakterize ^edilmiştir9. Bu çizgiler, Incucyte canlı görüntüleme sistemi kullanılarak proliferasyonun ve sağkalımın izlenmesine izin veren bir nükleer kırmızı floresan proteini (RFP) ifade edecek şekilde değiştirildi. RFP sinyalinin yoğunluğu, mevcut hücre sayısını temsil eder. Yeşil floresan proteini (GFP) gibi diğer floroforlar da kullanılabilir.

Çocukluk çağı akut lenfoblastik lösemi, lenfomalar, epitelyal maligniteler ve diğer birçok kanser için kombinasyon kemoterapisi, tümörleri eradike etmenin ve tek ajanlara karşı ilaç direncini önlemenin etkili bir yoludur^10,11. Bununla birlikte, HGG'de terapötik duyarlılıklar elde etmek için hangi ajanların birleştirileceği konusunda sınırlı bilgi vardır ve bu da in vitro ilaç testinde daha doğru sferoid modellerin kullanımını teşvik etmektedir.

Tüm protokol prosedürleri Philadelphia Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.

1. 3D küresel hücre kaplaması

1. Glioma kök hücre ortamını hazırlayın: Baz ortamı yapmak için, bazal ortama (500 mL) 50 mL proliferasyon takviyesi ve 5 mL 100x penisilin-streptomisin çözeltisi (10.000 U / mL) ekleyin. Glioma kök hücre ortamı yapmak için, üretici açıklamasına göre sırasıyla 20 ng/mL ve 10 ng/mL'lik bir nihai konsantrasyona epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ekleyin.
   NOT: Glioma kök hücre besiyeri 4 °C'de saklandığında 1 hafta süreyle kullanılabilir.
2. RFP eksprese eden hücreleri ayırın:
   NOT: Bu örnekte, fare NF1 HGG kök hücre hattı 5746 kullanılmıştır.
   1. Glioma kürelerini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve glioma kürelerini bir santrifüjde döndürün (5 dakika boyunca 150 x g ). Süpernatanı çıkarın ve küreleri ayırmak için 300 μL akutaz ekleyin (37 ° C'de 5 dakika inkübe edin).
   2. 1 mL glioma kök hücre ortamı ekleyin ve nazikçe pipetleme ile küreleri parçalayın. Ayrışmış hücreleri 150 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mL glioma kök hücre ortamında çözün.
3. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücrelerin konsantrasyonunu ölçün. Bir floresan hücre sayacı kullanırken, 2 μL Akridin Portakal / Propidyum İyodür Boyasına 18 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Süspansiyonda bulunan canlı / ölü hücrelerin sayısını saymak için bu süspansiyonun 12 μL'sini bir hemositometreye yükleyin.
4. Hücreleri, 100 μL glioma kök hücre ortamı başına 2.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   NOT: Hücre konsantrasyonundaki değişiklikler hücre hattına bağlı olabilir ve buna göre ayarlanabilir.
5. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ters pipetleme ile 96 oyuklu yuvarlak tabanlı alçak bağlantı plakasının her bir oyuğuna 100 μL hücre süspansiyonu (100 μL başına 2.000 hücre) dağıtın.
   NOT: Yuvarlak tabanlı alçak bağlantı plakaları kullanın; Bu plakalar, her kuyucukta tek bir glioma küresinin oluşumunu uyaracaktır. Ters pipetleme, canlı hücre analiz sisteminin görüntü yakalamayı engelleyecek kabarcık oluşumunu önler.
6. Plakaları 5 dakika boyunca 150 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Santrifüjleme, 3D nörosfer oluşumunu başlatmak için kritik bir adımdır.
7. Her kuyucukta tek bir küre oluşmasına izin vermek için gece boyunca inkübe edin.

2. Sinerji tahlili için ilaç ekleme (Şekil 1)

1. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğunun hem ilaç 1 hem de 2'nin spesifik bir konsantrasyonunu aldığından emin olun. Her bir ilaç 1 konsantrasyonunun, her bir ilaç 2 konsantrasyonu ile iki kopya halinde birleştirildiği bir ızgara oluşturun.
2. Sinerjinin belirleneceği iki ilacın (ilacın 5 dilüsyonu ve ilacın 7 dilüksiyonu) glioma kök hücre ortamını kullanarak seri bir seyreltme yapın (Şekil 1A).
   NOT: Bu çalışmada %50'lik seri seyreltme serisi kullanılmıştır; Bununla birlikte, herhangi bir seyreltme serisi kullanılabilir.
   1. Seyreltme serisi, her bir oyukta istenen nihai konsantrasyondan 7 kat daha konsantre olmalıdır. Örneğin, ilaç 1 için en yüksek nihai konsantrasyon 1 μM ise, ilaç 1, 7 μM için seyreltme serisinin ilk konsantrasyonunu yapın ( Şekil 1A'da 1 mL, Tüp B veya I).
   2. Seyreltme serisinin her ek tüpüne 500 μL glioma kök hücre ortamı ekleyin ( Şekil 1'de gösterildiği gibi Tüpler CH ve JM).
   3. Seyreltme serisini oluşturmak için, Tüp B veya Tüp I'den 500 μL ilaç karışımını aspire edin ve sırasıyla Tüp C veya Tüp J'deki (500 μL glioma kök hücre ortamı içeren) seyreltme serisindeki bir sonraki tüpe ekleyin. İyice karıştırın ve seyreltme serisindeki bir sonraki tüpe tekrarlayın. Bir DMSO kontrolü (Tüp A) yapın ve DMSO konsantrasyonunun koşullar arasında aynı olduğundan emin olun.
      NOT: İlaç konsantrasyonlarında ve seyreltme serilerinde değişiklikler yapılabilir. Seyreltme serisi değiştirilirse, Ek Dosya 1'de doğru ilaç konsantrasyonlarını listelediğinizden emin olun.
3. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, oyuk başına 140 μL'lik bir nihai hacim için Şekil 1B'de gösterildiği gibi ters pipetleme yoluyla 20 μL ilaç 1 ve 20 μL ilaç 2 ekleyin; İlaç kombinasyonları mükerrer olarak değerlendirilir. IC50 ve LD50 için sağlanan aşağı akış analizini kullanıyorsanız, Şekil 1B'de gösterildiği gibi ilaç düzenini kullanın.
   1. Bu tahlilde, her bir ilacın kendi başına (diğer ilaç mevcut olmadan) etkisi de ölçülür. Her bir oyuğun son hacmini 140 μL'ye getirmek için bu tek ilaç kuyucuklarına 20 μL DMSO kontrol ortamı ( Şekil 1B'deki Tüp A) eklediğinizden emin olun.
   2. Görüntülemeyi etkileyeceği için kuyuların kabarcık içermediğinden emin olun.
      NOT: Son ciltte değişiklikler yapılabilir; Bununla birlikte, madde 2.2'deki konsantrasyonları ayarladığınızdan emin olun.
4. Plakaları canlı görüntüleyiciye yerleştirin ve sferoid modülünü, tek küre ayarını kullanarak her bir kuyucuktaki her bir kürenin büyümesini izleyin, hem parlak alanı hem de RFP'yi 4x büyütmede görüntüleyin.
5. Plakaları 72 saat boyunca izleyin, plakanın her bir kuyusunu düzenli bir zaman aralığında, tipik olarak 2 saat görüntüleyin.
   NOT: Doğru bir plaka haritası yükleyin; bu, uygun aşağı akış analizini sağlayacaktır (Şekil 1C).

3. IC50, LD50 ve sinerji skorunun hesaplanması (Şekil 2 ve Şekil 3)

1. Canlı görüntüleyici yazılımını kullanarak her kuyu ve her zaman noktası için RFP yoğunluğunu analiz edin. Kullanılan analiz parametreleri ek dosyalarda listelenmiştir (Ek Dosya 2).
   NOT: Tercihe göre farklı analiz parametreleri kullanılabilir.
2. RFP verilerini, ham gruplandırılmamış verileri dışa aktardığınızdan emin olarak, her kuyu için Toplam Kırmızı Entegre RFP Yoğunluğu olarak dışa aktarın (Şekil 2A).
   NOT: IC50 ve LD50'yi hesaplamak için sağlanan şablonu (Ek Dosya 1) kullanıyorsanız, madde 3.2'ye uymak önemlidir
3. (1) yalnızca DMSO'ya kıyasla katlama değişikliği (bu hesaplama için 0 saat değerlerine gerek yoktur) ve (2) 0 saate kıyasla katlama değişikliğinin Log2'sinin her bir ilaç kombinasyonu için ortalama ve standart sapmayı, ham verileri sağlanan excel sayfasına yapıştırarak belirleyin (Şekil 2B ve Ek Dosya 1'deki örneğe bakın).
4. Elektronik tablodaki 1 ve 2 numaralı ilaçların maksimum konsantrasyonunu ayarlayın (Şekil 2B).
   NOT: İlaç 1 ve 2'nin konsantrasyonlarını ayarladığınızdan emin olun; aksi takdirde yanlış LD50 ve IC50 değerleri hesaplanacaktır.
5. Uygun bir veri analizi yazılım uygulaması kullanarak IC50 değerlerini hesaplayın (burada GraphPad kullanılır). IC50 değeri hesaplaması için, yalnızca adım 3.4'te belirlenen DMSO'ya kıyasla ortalama kat değişimini ve standart sapma kat değişimini kullanın ve ilaç 1 ve 2'nin IC50 tablolarını veri analiz yazılımına kopyalayın (Log (inhibitör) vs. normalleştirilmiş yanıt, değişken eğim) (Şekil 3A).
   1. IC50 hesaplamaları için yalnızca tek bir bileşenin eklendiği kuyulardan gelen verileri kullanın. Sağlanan elektronik tabloda otomatik olarak hesaplanan veri analizi yazılımındaki Log ilaç konsantrasyonu değerlerini kullanın.
6. Sinerji skorunu hesaplayın:
   1. Bir yazılım paketi veya web sitesi kullanarak sinerji puanını hesaplamak için yalnızca her kombinasyonun DMSO'ya kıyasla ortalama kat değişikliğini kullanın. Örneğin, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (parametreler: LL4 eğrisi uyumu, sinerji skoru hesaplaması için ZIP yöntemi). Ek Dosya 1, SynergyFinder'a yüklenebilecek sinerji giriş tablosunu oluşturmak için gereken değerleri otomatik olarak hesaplar (Şekil 3B). Sinerji giriş tablosunun bir örneği Ek Dosya 3'te verilmiştir.
      NOT: 10'un üzerindeki bir puan sinerjiyi, -10'un altındaki bir puan antagonizmayı ve -10 ile 10 arasındaki bir değer ilave etkileri gösterir.
7. LD50 puanını hesaplayın:
   1. Her ilaç 1 konsantrasyonu için, ilaç 2'nin LD50'sini hesaplayın. Ek dosya, her konsantrasyon için Log2 değerini ve standart sapmayı otomatik olarak hesaplar (Şekil 3C).
   2. 0 saate kıyasla Log2 kat değişiminin ortalama ve standart sapmasını ve ayrıca veri analiz yazılımındaki tekrarlama sayısını girin (bu çalışmada, 2,) ve -1'deki konsantrasyonu belirleyerek LD50 değerini ve LD50 standart sapmasını hesaplayın (Log2 = -1, 0 saate kıyasla sinyalin %50'sinin kaybolduğu log2 değerini temsil eder). Bu hesaplamalarda, Log(inhibitör) ve yanıt, değişken eğim 4 parametre modelini kullanın.
      NOT: Veri analiz yazılımı, bir log2 = -1 değerine karşılık gelen ilaç konsantrasyonunu otomatik olarak hesaplamaz; ancak bu değer, veri analiz yazılımının raporlanan hesaplamalarına kullanıcı tanımlı bir denklem olarak eklenebilir (Şekil 3C). Sağlanan elektronik tabloda otomatik olarak hesaplanan veri analizi yazılımındaki Günlük konsantrasyon değerlerini kullandığınızdan emin olun. Ek Dosya 4 , GraphPad yazılımındaki IC50 ve LD50 panellerini gösterir.

Örnek olarak, fare glioma kök hücre hattı 5746'da (RFP eksprese eden) iki RAS aşağı akış efektör yolunu inhibe eden Trametinib (MEK inhibitörü) ve GDC-0941'in (PI3K inhibitörü) sinerjisi değerlendirildi (Şekil 4). Şekil 4A, Trametinib ve GDC-0941'in bir kombinasyonu ile muamele edilen 0 saat ve 72 saat'te aynı küreyi göstermektedir. Bu görüntüler doğrudan canlı görüntüleyici yazılımından dışa akt...

Bu protokol, glioma^8'in sferoid modellerinde ilaç güvenlik açıklarını değerlendirmek için etkin bir şekilde kullanılan 3D ilaç tarama testlerini açıklar. Bu 3D sferoid tahlil sistemi, küreler halinde büyütülen glioma hücre hatları için kombinatoryal kemoterapilerin daha doğru bir klinik öncesi araştırmasına izin vermek için özel olarak tasarlanmıştır. HGG için bu yöntem, bu yıkıcı hastalık için olası ilaç güvenlik açıklar?...

Hiç kimse

Hiç kimse