Detección de sensibilidad a fármacos esferoides en líneas de células madre de glioma

Los exámenes de detección de sensibilidad a los medicamentos in vitro son herramientas importantes para descubrir combinaciones de medicamentos contra el cáncer. Las células cultivadas en esferas activan diferentes vías de señalización y se consideran más representativas de los modelos in vivo que las líneas celulares monocapa. Este protocolo describe un método para el cribado in vitro de líneas de esferoides.

Los exámenes de detección de sensibilidad a los fármacos in vitro son herramientas importantes en el descubrimiento de terapias combinadas de fármacos contra el cáncer. Por lo general, estos exámenes de detección de fármacos in vitro se realizan en células cultivadas en una monocapa. Sin embargo, estos modelos bidimensionales (2D) se consideran menos precisos en comparación con los modelos de células esferoides tridimensionales (3D); Esto es especialmente cierto para las líneas de células madre de glioma. Las células cultivadas en esferas activan diferentes vías de señalización y se consideran más representativas de los modelos in vivo que las líneas celulares monocapa. Este protocolo describe un método para el cribado in vitro de líneas de esferoides; Se utilizan como ejemplo las líneas de células madre de glioma humano y de ratón. Este protocolo describe un ensayo 3D de sensibilidad y sinergia de fármacos esferoides, que puede utilizarse para determinar si un fármaco o una combinación de fármacos induce la muerte celular y si dos fármacos sinergizan. Las líneas de células madre de glioma se modifican para expresar RFP. Las células se colocan en placas de fondo de pozo redondo de fijación baja 96, y se permite que se formen esferas durante la noche. Se añaden fármacos y se monitoriza el crecimiento midiendo la señal RFP a lo largo del tiempo utilizando el sistema de imágenes en vivo Incucyte, un microscopio de fluorescencia integrado en la incubadora de cultivo de tejidos. Posteriormente, se calculan la concentración inhibitoria máxima media (IC50), la dosis letal mediana (DL50) y la puntuación de sinergia para evaluar la sensibilidad a los fármacos solos o en combinación. La naturaleza tridimensional de este ensayo proporciona un reflejo más preciso del crecimiento tumoral, el comportamiento y las sensibilidades a los fármacos in vivo, lo que constituye la base para futuras investigaciones preclínicas.

El glioblastoma es una neoplasia cerebral devastadora de alto grado con una supervivencia general a cinco años del 5 %¹. Los gliomas de alto grado (HGG), como el glioblastoma, representan la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en la población pediátrica² y también son uno de los tumores más recalcitrantes para tratar en adultos³. A pesar de los avances significativos en nuestra comprensión de los impulsores moleculares de la HGG, las opciones de tratamiento siguen siendo limitadas³, lo que enfatiza la necesidad de métodos de detección de fármacos que predigan con mayor precisión las sensibilidades terapéuticas en la clínica.

Los cultivos celulares en 3D se han utilizado principalmente para el modelado del comportamiento celular fisiológicamente relevante⁴. Además, la arquitectura 3D del microambiente tumoral puede recapitularse in vitro mediante el establecimiento de ensayos de crecimiento 3D⁵. El crecimiento de esferoides también activa diferentes vías de señalización y, por lo tanto, se considera más representativo de los modelos in vivo ^6,7 en comparación con el cultivo 2D. Las células madre HGG pediátricas y nuestras líneas de células madre de glioma NF1 de ratón crecen naturalmente como neuroesferas, y utilizaron estas líneas de células de glioma NF1 de ratón en un cribado de fármaco de rendimiento medio⁸. Las líneas pediátricas utilizadas aquí se derivaron de HGG pediátrico hemisférico, de línea media y cerebelosa y fueron adquiridas y caracterizadas completamente por la Children's Brain Tumor Network (perfiles de mutación y expresión génica)⁹. Estas líneas fueron modificadas para expresar una proteína fluorescente roja nuclear (RFP), que permite el monitoreo de la proliferación y la supervivencia utilizando el sistema de imágenes en vivo Incucyte. La intensidad de la señal RFP es representativa del número de células presentes. También se podrían utilizar otros fluoróforos, como la proteína fluorescente verde (GFP).

La quimioterapia combinada para la leucemia linfoblástica aguda infantil, los linfomas, las neoplasias epiteliales malignas y muchos otros cánceres es una forma eficaz de erradicar los tumores y prevenir la resistencia a los fármacos individuales^10,11. Sin embargo, hay información limitada sobre qué agentes combinar para lograr sensibilidades terapéuticas en el HGG, lo que fomenta el uso de modelos de esferoides más precisos en las pruebas de fármacos in vitro.

Todos los procedimientos de protocolo fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Children's Hospital of Philadelphia.

1. 3D recubrimiento de células esferoides.

1. Prepare el medio de células madre para el glioma: Para hacer el medio base, agregue 50 mL del suplemento de proliferación y 5 mL de una solución de penicilina-estreptomicina 100x (10,000 U/mL) al medio basal (500 mL). Para producir medios de células madre para glioma, agregue factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) a una concentración final de 20 ng/mL y 10 ng/mL, respectivamente, según la descripción del fabricante.
   NOTA: Los medios de células madre para glioma se pueden usar durante 1 semana cuando se almacenan a 4 °C.
2. Disociar las células que expresan RFP:
   NOTA: En este ejemplo, se utiliza la línea de células madre NF1 HGG de ratón 5746.
   1. Transfiera las esferas de glioma a un tubo cónico de 15 ml y centrifuga las esferas de glioma en una centrífuga (150 x g durante 5 minutos). Retirar el sobrenadante y añadir 300 μL de accutasa para disociar las esferas (incubar durante 5 min a 37 °C).
   2. Agregue 1 mL de medio de células madre para glioma y rompa las esferas mediante un pipeteo suave. Centrifugar las células disociadas durante 5 minutos a 150 x g, aspirar el sobrenadante y disolver el gránulo en 1 mL de medio de células madre de glioma.
3. Mida la concentración de células con un contador de células o un hemocitómetro. Cuando utilice un contador de células de fluorescencia, añada 18 μL de la suspensión celular a 2 μL de tinción de naranja de acridina/yoduro de propidio. Cargue 12 μL de esta suspensión en un hemocitómetro para contar el número de células vivas/muertas presentes en la suspensión.
4. Diluir las células hasta una concentración final de 2.000 células por cada 100 μL de medios de células madre de glioma.
   NOTA: Las modificaciones en la concentración celular pueden depender de la línea celular y se pueden ajustar en consecuencia.
5. Con una pipeta multicanal, dispense 100 μL de la suspensión celular (2.000 celdas por 100 μL) en cada pocillo de una placa de fijación baja de fondo redondo de 96 pocillos mediante pipeteo inverso.
   NOTA: Utilice placas de fijación bajas de fondo redondo; Estas placas estimularán la formación de una sola esfera de glioma en cada pocillo. El pipeteo inverso evita la formación de burbujas, que interferirán con la captura de imágenes del sistema de análisis de células vivas.
6. Centrifugar las placas a 150 x g durante 5 min.
   NOTA: La centrifugación es un paso crítico para iniciar la formación de la neurosfera en 3D.
7. Incubar durante la noche para permitir que se forme una sola esfera en cada pocillo.

2. Adición de fármacos para el ensayo de sinergia (Figura 1)

1. Asegúrese de que cada pocillo de la placa de 96 pocillos reciba una concentración específica de los fármacos 1 y 2. Cree una cuadrícula en la que cada concentración de fármaco 1 se combine con cada concentración de fármaco 2 por duplicado.
2. Realizar una dilución seriada de los dos fármacos para los que se determinará la sinergia (5 diluciones del fármaco 1 y 7 diluciones del fármaco 2) utilizando los medios de células madre del glioma (Figura 1A).
   NOTA: En este estudio, se utiliza una serie de dilución en serie al 50%; sin embargo, se puede utilizar cualquier serie de dilución.
   1. La serie de dilución debe ser 7 veces más concentrada que la concentración final deseada en cada pocillo. Por ejemplo, si la concentración final más alta para el fármaco 1 es de 1 μM, haga que la primera concentración de la serie de dilución para el fármaco 1 sea de 7 μM (1 mL, tubo B o I en la figura 1A).
   2. Agregue 500 μL de medios de células madre de glioma a cada tubo adicional de la serie de dilución (tubos C-H y J-M, como se muestra en la Figura 1).
   3. Para crear la serie de dilución, aspire 500 μL de la mezcla de fármaco del tubo B o del tubo I y añádalo al siguiente tubo de la serie de dilución del tubo C o del tubo J, respectivamente (que contiene 500 μL de medios de células madre de glioma). Mezclar bien y repetir hasta el siguiente tubo de la serie de dilución. Realice un control de DMSO (tubo A) y asegúrese de que la concentración de DMSO sea la misma en todas las condiciones.
      NOTA: Se pueden realizar modificaciones en las concentraciones del fármaco y en las series de dilución. Asegúrese de enumerar las concentraciones correctas del medicamento en el Archivo Suplementario 1 si se cambia la serie de dilución.
3. A cada pocillo de las placas de 96 pocillos, agregue 20 μL del fármaco 1 y 20 μL del fármaco 2 mediante pipeteo inverso, como se muestra en la Figura 1B, para un volumen final de 140 μL por pocillo; Las combinaciones de medicamentos se evalúan por duplicado. Si utiliza el análisis posterior proporcionado para IC50 y LD50, utilice el diseño del fármaco como se muestra en la Figura 1B.
   1. En este ensayo, también se mide el efecto de cada fármaco por sí solo (sin que el otro fármaco esté presente). Asegúrese de agregar 20 μL de medio de control DMSO (Tubo A en la Figura 1B) a esos pocillos de un solo medicamento para llevar el volumen final de cada pocillo a 140 μL.
   2. Asegúrese de que los pocillos no contengan burbujas, ya que esto afectará las imágenes.
      NOTA: Se pueden realizar modificaciones en el volumen final; No obstante, asegúrese de ajustar las concentraciones del punto 2.2.
4. Coloque las placas en el generador de imágenes en vivo y monitoree el crecimiento de cada esfera en cada pozo utilizando el módulo esferoide, configuración de esfera única, imágenes de campo claro y RFP con un aumento de 4x.
5. Monitoree las placas durante 72 h, tomando imágenes de cada pocillo de la placa en un intervalo de tiempo regular, generalmente 2 h.
   NOTA: Cargue un mapa de placas correcto; esto asegurará un análisis posterior adecuado (Figura 1C).

3. Cálculo de IC50, DL50 y puntuación de sinergia (Figura 2 y Figura 3)

1. Analice la intensidad de la RFP para cada pozo y cada punto de tiempo utilizando el software de imágenes en vivo. Los parámetros de análisis utilizados se enumeran en los archivos complementarios (Archivo complementario 2).
   NOTA: Se pueden utilizar diferentes parámetros de análisis según se prefiera.
2. Exporte los datos de RFP como Intensidad de RFP integrada de rojo total para cada pozo, asegurándose de exportar los datos brutos no agrupados (Figura 2A).
   NOTA: Si se utiliza la plantilla proporcionada (Archivo Complementario 1) para calcular IC50 y DL50, es esencial cumplir con el punto 3.2
3. Determine el promedio y la desviación estándar para cada combinación de medicamentos de (1) el cambio de pliegue en comparación con DMSO solo (para este cálculo, no se necesitan los valores de 0 h) y (2) el Log2 de cambio de pliegue en comparación con 0 h pegando los datos sin procesar en la hoja de Excel proporcionada (Figura 2B y vea el ejemplo en el Archivo complementario 1).
4. Ajuste la concentración máxima de los medicamentos 1 y 2 en la hoja de cálculo (Figura 2B).
   NOTA: Asegúrese de ajustar las concentraciones de los medicamentos 1 y 2; de lo contrario, se calcularán valores incorrectos de LD50 e IC50.
5. Calcule los valores de IC50 utilizando una aplicación de software de análisis de datos adecuada (en este caso, se utiliza GraphPad). Para el cálculo del valor de IC50, utilice el cambio de pliegue promedio y el cambio de pliegue de la desviación estándar en comparación con DMSO solo determinado en el paso 3.4, y copie las tablas de IC50 de medicamentos 1 y 2 en el software de análisis de datos (Log(inhibidor) vs. respuesta normalizada, pendiente variable) (Figura 3A).
   1. Utilice únicamente los datos de los pozos a los que se ha añadido un único compuesto para los cálculos de IC50. Utilice el registro de los valores de concentración de fármaco en el software de análisis de datos, que se calculan automáticamente en la hoja de cálculo proporcionada.
6. Calcular la puntuación de sinergia:
   1. Utilice el cambio de plegado promedio en comparación con DMSO solo de cada combinación para calcular la puntuación de sinergia utilizando un paquete de software o un sitio web. Por ejemplo, https://synergyfinder.fimm.fi/ ¹² (parámetros: ajuste de la curva LL4, método ZIP para el cálculo de la puntuación de sinergia). El archivo complementario 1 calcula automáticamente los valores necesarios para crear la tabla de entrada de sinergia que se puede cargar en SynergyFinder (Figura 3B). Un ejemplo de la tabla de entrada de sinergia se proporciona en el Archivo Complementario 3.
      NOTA: Una puntuación superior a 10 denota sinergia, una inferior a -10 denota antagonismo y un valor entre -10 y 10 muestra efectos aditivos.
7. Calcule la puntuación LD50:
   1. Para cada concentración del fármaco 1, calcule la DL50 del fármaco 2. El archivo complementario calcula automáticamente el valor Log2 y la desviación estándar para cada concentración (Figura 3C).
   2. Introduzca el promedio y la desviación estándar del cambio de pliegue Log2 en comparación con 0 h, así como el número de réplicas en el software de análisis de datos (en este estudio, 2,) y calcule el valor de DL50 y la desviación estándar de DL50 determinando la concentración en -1 (Log2 = -1 representa el valor de log2 para el cual se pierde el 50% de la señal en comparación con 0 h). En estos cálculos, utilice el modelo de parámetros Log(inhibidor) vs. respuesta, pendiente variable 4.
      NOTA: El software de análisis de datos no calcula automáticamente la concentración del fármaco correspondiente a un valor log2 = -1; sin embargo, este valor se puede agregar a los cálculos reportados del software de análisis de datos como una ecuación definida por el usuario (Figura 3C). Asegúrese de utilizar los valores de concentración logarítmica en el software de análisis de datos, que se calculan automáticamente en la hoja de cálculo proporcionada. El archivo complementario 4 muestra los paneles IC50 y LD50 en el software GraphPad.

A modo de ejemplo, se evaluó la sinergia de Trametinib (inhibidor de MEK) y GDC-0941 (inhibidor de PI3K), que inhiben dos vías efectoras posteriores de RAS en la línea de células madre de glioma de ratón 5746 (que expresa RFP) (Figura 4). La figura 4A muestra la misma esfera a las 0 h y a las 72 h tratada con una combinación de Trametinib y GDC-0941. Estas imágenes se exportaron directamente desde el software de creación...

Este protocolo describe los ensayos de cribado de fármacos en 3D que se han utilizado eficazmente para evaluar las vulnerabilidades de los fármacos en modelos esferoides de glioma⁸. Este sistema de ensayo de esferoides 3D se diseñó específicamente para permitir una investigación preclínica más precisa de las quimioterapias combinatorias para líneas celulares de glioma cultivadas en esferas. Para HGG, este método proporciona un marco para identificar posi...

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