Metal Katyonlarının Varlığında Sınırlı Proteoliz ve Jel Elektroforezi: Serum Albüminlerinde Au(III) Bağlayıcı Lüminesan Alan

Sığır serum albümininde (BSA) Au (III) bağlanma alanını incelemek için bir protokol sunuyoruz.

Sunulan protokollerin amacı, BSA'da Au(III) bağlamasının etki alanını belirlemektir. BSA-Au(III) bileşiği, aromatik kalıntılardan kaynaklanan doğuştan gelen UV/mavi floresan ile karşılaştırıldığında olağandışı Stokes kaymaları ile ultraviyole (UV) uyarılabilir kırmızı lüminesans (λ_em = 640 nm) sergiler. Kırmızı ışıldayan kompleksler, pH 10'un üzerindeki yüksek alkali koşullarda oluşur ve protein içinde bir konformasyon değişikliğinin meydana gelmesi gerekir. Ek olarak, bu kırmızı lüminesansı elde etmek için BSA'da Cys-Cys disülfür bağlarının korunması gereklidir. Bu lüminesansın mekanizmasını anlamak için, luminofor oluşturan Au(III) bağlanma bölgesinin aydınlatılması esastır. Luminofor oluşturma bölgesini değerlendirmenin kolay bir yolu, (1) proteini enzimatik sindirim yoluyla tahmin edilebilir bir şekilde parçalamak, (2) elde edilen parçaları Au (III) ile reaksiyona sokmak, daha sonra (3) iyi ayrılmış parça bantlarını gözlemlemek ve jel içi kırmızı lüminesansı analiz etmek için jel elektroforezi yapmak olacaktır. Bununla birlikte, alkali koşullar ve metal katyonları ile reaksiyon nedeniyle, yeni sınırlı proteoliz teknikleri ve jel elektroforezi koşulları uygulanmalıdır. Özellikle, jel elektroforezinde metal katyonlarının varlığı, bant ayrımlarını teknik olarak zorlaştırabilir. Bu yeni protokolü, BSA'daki kırmızı luminofor oluşturan metal bağlama alanını tanımlamak için adım adım açıklıyoruz. Bu nedenle bu protokol, metal katyonlarının varlığında denatüre olmayan veya kısmen denatüre durumda kalması gereken protein fragmanlarını analiz etmek için uygulanabilir. Proteinlerin çoğunluğu işlev görmek için metal katyonlarına ihtiyaç duyduğundan, literatürde x-ışını kristalografisine dayanan metale bağlı proteinlerin analizleri sıklıkla arzu edilir. Bu yöntem ise, protein kristalizasyonuna ihtiyaç duymadan ve istenen pH koşulunda proteinlerin metal katyonları ile etkileşimlerini incelemek için ek olarak kullanılabilir.

Yüksek alkali koşullarda (pH > 10) reaksiyonlarla elde edilen sığır serum albümini ^1,2,3 (BSA)-altın (Au) komplekslerinin, UV ile uyarılabilir kırmızı lüminesans (λ_em = 640 nm) sergilediği bilinmektedir4,5,6,7. Algılama,8,9,10 görüntüleme 11,12,13 ve nanotıp 14,15,16 dahil olmak üzere bu bileşiğin çok sayıda uygulaması önerilmiş ve araştırılmıştır. Bununla birlikte, lüminesans mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. BSA'da Au(III) bağlanmasının ve luminofor oluşumunun yerinin belirlenmesi önemli bir adımdır.

Son zamanlarda, BSA'nın pH kontrollü dinamik konformasyon değişikliğinin ve ardından bir Cys-Cys disülfid bağına bir Au (III) bağlanmasının, kırmızı lüminesans^4'ü elde etmek için gerekli olduğu açıklanmıştır. Bu lüminesansın mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için, luminofor oluşturan Au(III) bağlanma bölgesinin aydınlatılması esastır. Luminofor oluşum bölgesini değerlendirmenin kolay bir yolu, BSA-Au bileşiğini enzimatik sindirim yoluyla parçalamak ve her bir parçayı lüminesans için analiz etmektir. Bununla birlikte, alkali koşullar ve metal katyonlarının varlığı nedeniyle, yeni proteoliz ve jel elektroforez protokollerine ihtiyaç vardır.

Cys-Cys disülfid bağlarını korurken, protein fragmanı preparatlarının yöntemi olarak sınırlı enzimatik proteoliz kullandık. Konvansiyonel proteolizde, tüm disülfür bağlarının parçalanması ve bir proteinin doğrusallaştırılması (ditiyotreitol ve üre gibi ajanların yanı sıra ısının denatüre edilmesiyle) gereklidir. Burada, bir Cys-Cys bağı koruyucu proteolizi gösteriyoruz ve Au(III) ile reaksiyondan sonra elde edilen fragmanları ve lüminesanslarını değerlendiriyoruz. Somut bir örnek olarak sindirim enzimi için tripsin kullanıyoruz.

Protokol genellikle metal katyonların varlığında proteinlerin ve fragmanların jel elektroforezini tanımlar. Proteinlerin çoğunluğu işlev görmek için metal katyonlara ihtiyaç duyduğundan,^literatürde x-ışını kristalografisine dayanan metale bağlı proteinlerin analizleri sıklıkla arzu edilir. BSA'nın yapıları ve fragmanları, pH > 10 dahil olmak üzere nötr olmayan pH konformasyonları için bilinmemektedir. Bu nedenle, Au (III) koordinasyonunun yapısal detayları tek başına jel elektroforezi ile analiz edilemez. Öte yandan bu yöntem, protein kristalizasyonuna ihtiyaç duymadan proteinlerin metal katyonları ile etkileşimlerini incelemek için ek olarak kullanılabilir, bu da istenen fonksiyonel bir pH koşulunda mümkün olmayabilir. Metal katyonlarının varlığı, jel bantlarının önemli ölçüde "bulaşmasına" neden olabilir. Bu makalenin odak noktası, bu teknik zorluğun üstesinden gelmek ve metal kaynaklı bant lekelenmesini en aza indirmek için bir protokol sunmaktır.

1. BSA-Au kompleks parçalarının sentezi

1. 5 mL'lik bir şişede pH'ı 8.0 olan 50 mM Tris-HCl ve 50 mM NaCl içeren 1 mL HPLC dereceli suda 5 mg BSA'yı çözün.
2. 2 mg tripsin'i, pH'ı 8.0 olan 50 mM Tris-HCl ve 50 mM NaCl içeren taze hazırlanmış bir HPLC su çözeltisinin 1 mL'sinde çözün.
3. BSA'nın reaksiyon şişesini 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve manyetik bir karıştırıcı kullanarak 750 rpm'de kuvvetlice karıştırın.
4. Karıştırma başladıktan hemen sonra, çözeltiye 50 μL taze hazırlanmış tripsin ekleyin.
   NOT: Geleneksel enzim sindirim reaksiyonlarının aksine, çözeltiye sodyum dodesil sülfat (SDS), ditiotreitol (DDT) veya üre eklenmemelidir. Ayrıca, herhangi bir sıcaklık tavlaması yapılmamalıdır. Bu sınırlı proteoliz nedeniyle, Cys-Cys disülfür bağları bozulmadan tutulacak ve enzim tarafından yalnızca yüzeyde erişilebilir rastgele bobin segmentleri parçalanacaktır.
5. Au (III) klorürü (kloroaurik asit) 1 mL HPLC dereceli suda 750 μM'lik bir konsantrasyona çözün.
6. Reaksiyon şişesine, elde edilen BSA: Au molar oranı 1:10 için kloroaurik asit çözeltisini ekleyin.
7. Karışımı manyetik bir karıştırıcı kullanarak 37 °C'de ve 750 rpm'de 2 dakika karıştırın.
8. 12.5'lik bir pH elde etmek için reaksiyon şişesine 100 μL 1 M NaOH ekleyin.
   NOT: Reaksiyonun yüksek alkali koşulları, kırmızı ışıldayan kompleksin oluşumunu indüklemeli ve tripsinin enzimatik aktivitesini söndürmelidir.
9. Karışımı 37 °C'de 2 saat boyunca 750 rpm'de kuvvetlice karıştırın.
   NOT: Nihai ürün, daha fazla saflaştırma yapılmadan hemen kullanılmıştır.

2. Sınırlı proteoliz ile BSA-Au kompleks fragmanlarının jel elektroforezi

1. Deiyonize su kullanarak önceden dökülmüş %4-12 gradyanlı Bis-Tris jeli durulayın ve bir jel elektroforez tankına yerleştirin.
2. Deiyonize su ile seyrelterek konsantre bir stok çözeltisinden 500 mL MES çalışan tampon çözeltisi hazırlayın.
3. Numuneleri %20'lik bir gliserol çözeltisi içinde 1 μg protein/μL'ye seyrelterek her kuyu şeridi için hazırlanın. Bu seyreltme, pH'ı 12.5'ten ~8'e getirir.
   NOT: Numune tamponunda SDS, DTT veya üre kullanılmaz. Ek olarak, numunelerin sıcaklıkta tavlanması yapılmamalıdır.
4. Jelenin her bir şeridine her bir numune çözeltisinden 10 μL ekleyin.
5. Jeli 150 V'luk sabit bir voltajda 1 saat boyunca çalıştırın.
6. Jeli çalıştırdıktan sonra, jeli alçıdan çıkarın ve akan tamponu çıkarmak için deiyonize su kullanarak her biri 1 dakika boyunca 3 kez durulayın.
7. Jeli 200 mL deiyonize suda saklayın ve bir jel görüntüleme sistemi kullanarak jel içi floresansı hemen ölçün.
8. Aşağıdaki çözeltinin 200 mL'sinde 200 mg Coomassie Brilliant Blue içeren taze bir boyama çözeltisi hazırlayın: metanol, asetik asit ve 50:10:40 hacim oranında su.
9. Jeli 200 mL boyama solüsyonunda 30 dakika boyunca hafif sallama kullanarak yıkayın.
10. Metanol, asetik asit ve suyu metanol:asetik asit:su = 50:10:40 hacim oranında karıştırarak taze bir leke giderme solüsyonu hazırlayın.
11. Jeli 100 mL leke giderici solüsyonda 1 saat boyunca hafifçe karıştırarak yıkayın.
12. Yukarıdaki işlemi 4 kez tekrarlayın ve son olarak sabit jel deiyonize suyu oda sıcaklığında saklayın.

3. BSA-Au kompleks fragmanlarının sınırlı proteoliz ile analizi

1. BSA'nın amino asit dizisini inceleyin ve Cys-Cys bağının korunmasını (sınırlı proteoliz) varsayarak, enzimatik sindirim ile elde edilebilecek beklenen fragmanların bir tablosunu hazırlayın. Tripsin sindirimi durumunda (Tablo 1), kesme konumları Lys ve Arg'nin C-terminalidir, ancak bunu Pro takip eder. Triptik kesim konumlarındaki belirsizlikten kaynaklanan parça moleküler ağırlıklarındaki küçük hataları hesaba katın.
   NOT: BSA'nın amino asit dizisi analiz edildiğinde, bu adımdan elde edilen beklenen sınırlı triptik fragmanlar şunlardır: [A] (7.3 kDa, kalıntılar 1 - 64); [B] (5.9 kDa, kalıntı 65 - 114); [C] (20.1 ~ 22.4 kDa, kalıntılar 115/117 - 294/312); [D] (21.3 ~ 23.4 kDa, kalıntılar 295/313 - 499); ve [E] (9.5 kDa, kalıntılar 500 - 583). Triptik kesim konumlarındaki belirsizlik, Cys'e bağlı birimlerin dışındaki segmentlerden kaynaklanır. BSA için, 107 - 114 (0.9 kDa) kalıntıları ve 295 - 312 (2.1 kDa) kalıntıları, Cys-Cys bağına bağlı bir parçanın N veya C - terminal kısmı olarak görünebilir.
2. Bu beklenen parçalarda yüzeye maruz kalan Cy'lerin konumlarını belirleyin. Tripsin ile sindirilmiş BSA için, yüzeye maruz kalan tek Cys34 fragmandadır [A].
3. ~66 kDa'nın (BSA'nın moleküler ağırlığı) altında jel elektroforez bantları olarak gözlemlenen moleküler ağırlıkların listesini hazırlayın.
   NOT: Tripsin sindirimi için gözlemlenen jel elektroforez bantları şunlardır: Bant (1) = sindirilmemiş BSA; Bant(2) ~50 kDa; Bant(3) ~44 kDa; Bant(4) ~42 kDa; Bant(5) ~36 kDa; Bant(6) ~32 kDa; Bant(7) ~26 kDa; Bant(8) ~21 kDa; Bant(9) ~15 kDa; Bant(10) ~12 kDa; Bant(11) ~10 kDa; ve Bant(12) ~8 kDa.
4. Jelde gözlenen moleküler ağırlıkların listesini, beklenen BSA fragmanlarının sıralı ilaveleriyle yeniden oluşturun. Tripsin için, [A] fragmanı, yüzeye maruz kalan Cys kalıntısı boyunca [A]-[A] dimer oluşturabilir.

Gözlenen on iki jel bandı, beklenen beş BSA fragmanından [A] - [E] benzersiz bir şekilde yeniden yapılandırıldı (Şekil 1). Sonuçlar, α sarmallar ve β sarmallar dahil olmak üzere ikincil yapıların korunduğu literatürle tutarlıydı 19,20,21,22,23.

Bu protokolün amacı, BSA-Au komplekslerindeki kırmızı luminofor oluşturan alanı tanımlamaktı. Kırmızı lüminesansı üretmek için gerekli olan Cys-Cys bağlarını korurken, BSA fragmanlarını elde etmek için sınırlı triptik proteoliz kullandık. Au(III) varlığında proteoliz ve elektroforez koşullarını optimize ettik. Aynı prensipler, metal katyonlarının varlığında parçalanmış proteinlerin jel analizlerine de geniş ölçüde uygulanabilir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

SE, PhRMA Vakfı, Lösemi Araştırma Vakfı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NIH R15GM129678) destek almaktadır.