Protéolyse limitée et électrophorèse sur gel en présence de cations métalliques : domaine luminescent de liaison à l’Au(III) dans les albumines sériques

Nous présentons un protocole pour l’étude du domaine de liaison de l’Au(III) dans l’albumine sérique bovine (BSA).

L’objectif des protocoles présentés est de déterminer le domaine de liaison de l’Au(III) dans la BSA. Le composé BSA-Au(III) présente une luminescence rouge excitable par les ultraviolets (UV) (λ_em = 640 nm), avec des décalages de Stokes inhabituels par rapport à la fluorescence innée UV/bleu résultant des résidus aromatiques. Les complexes rouges-luminescents se forment dans des conditions très alcalines au-dessus de pH 10 et nécessitent un changement de conformation au sein de la protéine pour se produire. De plus, la préservation des liaisons disulfure Cys-Cys dans BSA est nécessaire pour obtenir cette luminescence rouge. Afin de comprendre le mécanisme de cette luminescence, l’élucidation du site de liaison de l’Au(III) formant le luminophore est essentielle. Une façon facile d’évaluer le site de formation du luminophore serait de (1) fragmenter de manière prévisible la protéine par digestion enzymatique, (2) faire réagir les fragments obtenus avec Au(III), puis (3) effectuer une électrophorèse sur gel pour observer les bandes de fragments bien séparées et analyser la luminescence rouge dans le gel. Cependant, en raison des conditions alcalines et de la réaction avec les cations métalliques, de nouvelles techniques de protéolyse limitées et des conditions d’électrophorèse sur gel doivent être appliquées. En particulier, la présence de cations métalliques dans l’électrophorèse sur gel peut rendre les séparations de bandes techniquement difficiles. Nous décrivons ce nouveau protocole en étapes pour identifier le domaine de liaison métallique formant du luminophore rouge dans BSA. Ce protocole peut ainsi être appliqué pour l’analyse de fragments de protéines qui doivent rester dans un état non dénaturé ou partiellement dénaturé, en présence de cations métalliques. Parce que la majorité des protéines ont besoin de cations métalliques pour fonctionner, des analyses de protéines liées aux métaux sont souvent souhaitées, qui se sont appuyées sur la cristallographie aux rayons X dans la littérature. Cette méthode, d’autre part, pourrait être utilisée en complément pour étudier les interactions des protéines avec les cations métalliques sans nécessiter la cristallisation des protéines et à une condition de pH souhaitée.

Les complexes d’albumine^{sérique bovine 1,2,3} (BSA)-or (Au), obtenus par des réactions dans des conditions hautement alcalines (pH > 10), sont connus pour présenter une luminescence rouge excitable par UV (λ em = 640 nm)^4,5,6,7. De nombreuses applications de ce composé ont été proposées et étudiées, notamment la détection,8,9,10 l’imagerie 11,12,13 et la nanomédecine 14,15,16. Cependant, le mécanisme de la luminescence n’est pas entièrement compris. L’identification de l’emplacement de la liaison de l’Au(III) et de la formation du luminophore dans la BSA est une étape importante.

Il a été récemment élucidé que le changement de conformation dynamique de la BSA contrôlé par le pH, suivi d’une liaison Au(III) à une liaison disulfure Cys-Cys, est nécessaire pour obtenir la luminescence rouge⁴. Afin d’obtenir des informations supplémentaires sur le mécanisme de cette luminescence, l’élucidation du site de liaison de l’Au(III) formant le luminophore est essentielle. Une façon facile d’évaluer le site de formation du luminophore est de fragmenter le composé BSA-Au par digestion enzymatique et d’analyser chaque fragment pour la luminescence. Cependant, en raison des conditions alcalines et de la présence de cations métalliques, de nouveaux protocoles de protéolyse et d’électrophorèse sur gel sont nécessaires.

Nous avons utilisé la protéolyse enzymatique limitée comme méthode de préparation de fragments de protéines, tout en préservant les liaisons disulfure Cys-Cys. Dans la protéolyse conventionnelle, le clivage de toutes les liaisons disulfure et la linéarisation d’une protéine (par des agents dénaturants tels que le dithiothréitol et l’urée, ainsi que la chaleur) sont nécessaires. Ici, nous démontrons une protéolyse préservant la liaison Cys-Cys et évaluons les fragments obtenus et leur luminescence après la réaction avec Au(III). Nous utilisons la trypsine pour l’enzyme digestive, à titre d’exemple concret.

Le protocole décrit généralement l’électrophorèse sur gel de protéines et de fragments en présence de cations métalliques. Parce que la majorité des protéines ont besoin de cations métalliques pour fonctionner^17,18, des analyses des protéines liées aux métaux sont souvent souhaitées, qui se sont appuyées sur la cristallographie aux rayons X dans la littérature. Les structures de la BSA, et leurs fragments, ne sont pas connues pour leurs conformations de pH non neutres, y compris à un pH > 10. Par conséquent, les détails structurels de la coordination Au(III) ne peuvent pas être analysés par électrophorèse sur gel seule. Cette méthode, d’autre part, pourrait être utilisée en complément pour étudier les interactions des protéines avec les cations métalliques sans nécessiter la cristallisation des protéines, ce qui peut ne pas être possible dans une condition de pH fonctionnel souhaitée. La présence de cations métalliques peut provoquer un « maculage » important des bandes de gel. L’objectif de cet article est de surmonter cette difficulté technique et de présenter un protocole pour minimiser le maculage de bande induit par le métal.

1. Synthèse de fragments du complexe BSA-Au

1. Dissoudre 5 mg de BSA dans 1 mL d’eau de qualité HPLC contenant 50 mM de Tris-HCl et 50 mM de NaCl avec un pH de 8,0 dans un flacon de 5 mL.
2. Dissoudre 2 mg de trypsine dans 1 mL d’une solution fraîchement préparée d’eau HPLC contenant 50 mM de Tris-HCl et 50 mM de NaCl avec un pH de 8,0.
3. Placez le flacon de réaction de BSA dans un bain-marie à 37 °C et remuez vigoureusement à 750 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique.
4. Immédiatement après le début de l’agitation, ajoutez 50 μL de trypsine fraîchement préparée à la solution.
   REMARQUE : Aucun dodécylsulfate de sodium (SDS), dithiothréitol (DDT) ou urée ne doit être ajouté à la solution, contrairement aux réactions conventionnelles de digestion enzymatique. De plus, aucun recuit à la température ne doit être effectué. En raison de cette protéolyse limitée, les liaisons disulfure Cys-Cys seront maintenues intactes et seuls les segments aléatoires de bobine accessibles en surface seront clivés par l’enzyme.
5. Dissoudre le chlorure d’Au(III) (acide chloroaurique) dans 1 mL d’eau de qualité HPLC jusqu’à une concentration de 750 μM.
6. Dans le flacon de réaction, ajoutez la solution d’acide chloroaurique pour obtenir un rapport molaire BSA :Au de 1:10.
7. Mélangez pendant 2 minutes à 37 °C et à 750 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique.
8. Ajouter 100 μL de NaOH 1 M dans le flacon de réaction pour obtenir un pH de 12,5.
   REMARQUE : Les conditions alcalines élevées de la réaction doivent induire la formation du complexe luminescent rouge et éteindre l’activité enzymatique de la trypsine.
9. Remuez vigoureusement le mélange à 750 tr/min pendant 2 heures à 37 °C.
   REMARQUE : Le produit final a été utilisé immédiatement sans autre purification.

2. Électrophorèse sur gel de fragments du complexe BSA-Au par protéolyse limitée

1. Rincez un gel Bis-Tris préfabriqué à gradient de 4 à 12 % à l’aide d’eau désionisée et placez-le dans un réservoir d’électrophorèse sur gel.
2. Préparer 500 mL de solution tampon courante MES à partir d’une solution mère concentrée, en diluant avec de l’eau désionisée.
3. Préparez-vous pour chaque voie de puits en diluant les échantillons à 1 μg de protéines/μL dans une solution de glycérol à 20 %. Cette dilution porte le pH de 12,5 à ~8.
   REMARQUE : Aucune FDS, DTT ou urée n’est utilisée dans le tampon d’échantillon. De plus, le recuit à la température des échantillons ne doit pas être effectué.
4. Ajouter 10 μL de chaque solution d’échantillon à chaque voie du gel.
5. Faites fonctionner le gel pendant 1 heure à une tension constante de 150 V.
6. Après avoir fait couler le gel, retirez-le du plâtre et rincez-le 3 fois pendant 1 minute chacune avec de l’eau déminéralisée pour retirer le tampon qui coule.
7. Conservez le gel dans 200 ml d’eau déminéralisée et mesurez immédiatement la fluorescence dans le gel, à l’aide d’un système d’imagerie sur gel.
8. Préparez une solution de coloration fraîche contenant 200 mg de Coomassie Brilliant Blue dans 200 mL de la solution suivante : méthanol, acide acétique et eau à un rapport de volume de 50:10:40.
9. Lavez le gel dans 200 ml de solution de coloration pendant 30 minutes en le balançant doucement.
10. Préparez une solution de décoloration fraîche en mélangeant du méthanol, de l’acide acétique et de l’eau dans un rapport volumique de méthanol :acide acétique :eau = 50:10:40.
11. Lavez le gel dans 100 ml de solution détachante pendant 1 heure en remuant doucement.
12. Répétez la procédure ci-dessus 4 fois et enfin conservez l’eau déminéralisée en gel fixe à température ambiante.

3. Analyse de fragments du complexe BSA-Au par protéolyse limitée

1. Examiner la séquence d’acides aminés de la BSA et préparer un tableau des fragments attendus qui peuvent être obtenus par digestion enzymatique, en supposant la préservation de la liaison Cys-Cys (protéolyse limitée). Dans le cas de la digestion de la trypsine (tableau 1), les emplacements de coupe sont C-terminus de Lys et Arg, sauf qu’ils sont suivis de Pro. Tenez compte des petites erreurs dans les poids moléculaires des fragments, résultant de l’ambiguïté des emplacements de coupe tryptiques.
   REMARQUE : En analysant la séquence d’acides aminés de la BSA, les fragments tryptiques limités attendus obtenus à partir de cette étape sont : [A] (7,3 kDa, résidus 1 - 64) ; [B] (5,9 kDa, résidus 65 - 114) ; [C] (20,1 ~ 22,4 kDa, résidus 115/117 - 294/312) ; [D] (21,3 ~ 23,4 kDa, résidus 295/313 - 499) ; et [E] (9,5 kDa, résidus 500 - 583). L’ambiguïté des emplacements des coupes tryptiques résulte de segments situés en dehors des unités connectées à Cys. Pour BSA, les résidus 107 - 114 (0,9 kDa) et les résidus 295 - 312 (2,1 kDa) peuvent apparaître comme la partie N-terminale ou C-terminale d’un fragment lié à la liaison Cys-Cys.
2. Identifier l’emplacement des Cys exposés en surface dans ces fragments attendus. Pour le BSA digéré à la trypsine, le seul Cys34 exposé en surface se trouve dans le fragment [A].
3. Préparez la liste des poids moléculaires observés sous forme de bandes d’électrophorèse sur gel, inférieures à ~66 kDa (poids moléculaire de BSA).
   REMARQUE : Pour la digestion de la trypsine, les bandes d’électrophorèse sur gel observées sont les suivantes : Bande(1) = BSA non digérée ; Bande(2) ~50 kDa ; Bande(3) ~44 kDa ; Bande(4) ~42 kDa ; Bande(5) ~36 kDa ; Bande(6) ~32 kDa ; Bande(7) ~26 kDa ; Bande(8) ~21 kDa ; Bande(9) ~15 kDa ; Bande(10) ~12 kDa ; Bande(11) ~10 kDa ; et Bande (12) ~8 kDa.
4. Reconstruire la liste des poids moléculaires observés dans le gel, par les ajouts séquentiels des fragments de BSA attendus. Pour la trypsine, le fragment [A] peut former un dimère [A]-[A] à travers le résidu Cys exposé à la surface.

Les douze bandes de gel observées ont été reconstruites de manière unique à partir des cinq fragments de BSA attendus [A] - [E] (Figure 1). Les résultats étaient cohérents avec la littérature, dans laquelle les structures secondaires, y compris les hélices α et les brins β, sont préservées 19,20,21,22,23.

Le but du présent protocole était d’identifier le domaine formant du luminophore rouge dans les complexes BSA-Au. Nous avons utilisé une protéolyse tryptique limitée pour obtenir les fragments de BSA, tout en préservant les liaisons Cys-Cys nécessaires à la production de la luminescence rouge. Nous avons optimisé les conditions de protéolyse et d’électrophorèse en présence d’Au(III). Les mêmes principes peuvent être largement appliqués aux analyses sur gel de proté...

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

S.E. remercie la Fondation PhRMA, la Fondation de recherche sur la leucémie et les National Institutes of Health (NIH R15GM129678).