В больницах AIG мы исследуем, как снижение секреции протоков поджелудочной железы и снижение pH влияют на экспрессию генов в клетках протоков поджелудочной железы, уделяя особое внимание онкогенам, исследуя возможность клеточной адаптации к кислым микросредам. Проблема здесь заключается в гетерогенности опухолей поджелудочной железы, что усложняет как лечение, так и экспериментальные подходы. Поэтому мы провели анализ РНК протоковых клеток поджелудочной железы в условиях пониженного pH и обнаружили, что существует повышенная экспрессия трех онкогенов, подчеркивающих потенциальные связи между кислой средой и экспрессией онкогенов в протоковых клетках поджелудочной железы.
Наше исследование пролило свет на экспрессию онкогена в условиях пониженного pH, и эта система может продвинуть наши исследования в изучении протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в условиях воспаления. Таким образом, будущая цель этого исследования заключается в оценке роли повышенной экспрессии онкогенов в инициации опухолей при воспалительных состояниях, таких как хронический панкреатит. Для начала приобретите нормальную линию протоковых клеток поджелудочной железы человека.
Разморозьте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане. Теперь процедите свежеприготовленную готовую среду через шприц-фильтр. Добавьте шесть миллилитров готовой среды в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Затем переложите размороженную клеточную суспензию в пробирку и тщательно перемешайте. Центрифугируйте суспензию при 1 800 G в течение шести минут. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу один миллилитр питательной среды перед аккуратным перемешиванием.
Далее добавьте в чашку Петри четыре миллиметра 60 миллилитров полной среды. Затем пипеткой каплю клеточной суспензии в колбу. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия при добавлении 5% углекислого газа.
Чтобы изменить рН питательной среды, сначала приготовьте 100 мл 0,5 молярных буферных растворов фосфата натрия со значениями рН 6,0, 6,5 и 7,0. Проверьте pH с помощью рН-метра и отрегулируйте его с помощью одной молярной соляной кислоты или одного молярного гидроксида натрия. Затем процедить, простерилизовать буферы в ламинарном вытяжном шкафу с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
Далее в 80 мл питательной среды добавляют 20 мл стерильного 0,5 молярного натрия фосфатного буфера соответствующего рН для приготовления сред с различным рН. Добавьте среду с измененным pH до 85-90% сливающихся протоковых клеток поджелудочной железы человека. Наблюдайте за морфологическими изменениями под светлопольным микроскопом с интервалом в один час в течение шести часов.
Чтобы выделить РНК из культуры, сначала отсадите питательную среду и промойте клетки одним миллилитром PBS. Поставьте 60-миллиметровую тарелку на лед, затем один миллилитр PBS на 60-миллиметровую тарелку и соскребите ячейки скребком для клеток. Теперь переложите суспензию в свежую трубку.
Центрифугируйте его при 8 000 G в течение 10 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Далее добавьте в гранулу 600 микролитров буфера для лизиса, содержащего бета-меркаптоэтанол. Пипетка суспензии вверх и вниз в течение пяти-10 минут на льду.
Добавьте в лизат равный объем 70% этанола и пипеткой в суспензию тщательно перемешайте. Перенесите раствор в колонку с кварцевой мембраной. Затем центрифугируйте колонку при давлении более 8 000 G в течение 30 секунд и отбросьте поток.
Далее добавьте в образец 500 микролитров промывочного буфера и снова центрифугируйте. Центрифугируйте пустую пробирку в течение одной минуты при давлении более 8 000 G. Наконец, добавьте в колонку от 30 до 50 микролитров воды, свободной от нуклеазы. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре снова центрифугируйте колонку со скоростью выше 8000 G в течение пяти минут.
Наблюдалось значительное уменьшение размера клеток и усадка пластичных клеток в кислой среде по сравнению с клетками, содержащимися в нормальной среде. Наиболее выраженные изменения в гибели клеток происходили после шести часов инкубации с дальнейшим снижением количества клеток и признаками клеточного стресса через 22 часа. Количество активированных генов было самым высоким при pH 6,5 со 148 генами, за ним следовали pH 7 с 109 генами и pH 6 с 90 генами.
Пониженных генов было меньше: 20 при pH 6, 14 при pH 6,5 и 23 при pH 7. Три онкогена, LCK, FGR и ASAP 3, были повышены по всем исследуемым уровням pH, что указывает на их роль в пролиферации клеток в кислых условиях.
