Negli ospedali AIG, studiamo come la diminuzione delle secrezioni duttali pancreatiche e la diminuzione del pH influenzino l'espressione genica nelle cellule duttali pancreatiche, concentrandoci in particolare sugli oncogeni, esplorando la possibilità di adattamento cellulare ai microambienti acidi. La sfida qui è l'eterogeneità dei tumori del pancreas, che complica il trattamento e gli approcci sperimentali. Quindi abbiamo condotto l'analisi RNAC delle cellule duttali pancreatiche in condizioni di pH ridotto e abbiamo scoperto che c'è un aumento dell'espressione di tre oncogeni che evidenziano i potenziali legami tra l'ambiente acido e l'espressione dell'oncogene nelle cellule duttali pancreatiche.
Il nostro studio ha fatto luce sull'espressione dell'oncogene in condizioni di pH ridotto e questo sistema può far progredire la nostra ricerca nello studio dell'adenocarcinoma duttale pancreatico in condizioni di infiammazione. Quindi lo scopo futuro di questo studio è quello di valutare il ruolo dell'aumento dell'espressione oncogenica nell'inizio dei tumori in condizioni infiammatorie, come nella pancreatite cronica. Per iniziare, procurati la normale linea cellulare duttale pancreatica umana.
Scongelare le celle a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Filtrare ora il terreno completo appena preparato attraverso un filtro a siringa. Aggiungere sei millilitri di terreno completo a un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Quindi trasferire la sospensione cellulare scongelata nel tubo e mescolare accuratamente. Centrifugare la sospensione a 1,800 G per sei minuti. Scartare il surnatante e aggiungere un millilitro di terreno di coltura al pellet prima di mescolare delicatamente.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di terreno completo in una capsula di Petri da 60 millimetri. Quindi pipettare la sospensione cellulare goccia a goccia nel pallone. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con un'integrazione di anidride carbonica del 5%.
Per modificare il pH del terreno di coltura, preparare innanzitutto 100 millilitri di soluzioni madre di fosfato di sodio 0,5 molari con valori di pH di 6,0, 6,5 e 7,0. Controllare il pH con un pHmetro e regolarlo utilizzando un acido cloridrico molare o un idrossido di sodio molare. Quindi filtrare, sterilizzare i tamponi in una cappa a flusso d'aria laminare utilizzando un filtro a siringa da 0,45 micrometri.
Quindi, aggiungere 20 millilitri di tampone fosfato di sodio sterile 0,5 molare del rispettivo pH a 80 millilitri di terreno di coltura per preparare terreni di pH diverso. Aggiungere il terreno con il pH alterato all'85-90% di cellule duttali pancreatiche umane confluenti. Osservare i cambiamenti morfologici al microscopio a campo chiaro a intervalli di un'ora per sei ore.
Per isolare l'RNA dalla coltura, aspirare prima il terreno di coltura e sciacquare le cellule con un millilitro di PBS. Mettere il piatto da 60 millimetri sul ghiaccio, quindi un millilitro di PBS sul piatto da 60 millimetri e raschiare le cellule con un raschietto cellulare. Ora trasferisci la sospensione in un nuovo tubo.
Centrifugare a 8.000 g per 10 minuti ed eliminare il surnatante. Successivamente, aggiungere al pellet 600 microlitri di tampone di lisi contenente beta-mercaptoetanolo. Pipettare la sospensione su e giù per cinque-10 minuti con ghiaccio.
Aggiungere un volume uguale di etanolo al 70% al lisato e pipettare la sospensione per miscelare accuratamente. Trasferire la soluzione in una colonna di membrana di silice. Quindi centrifugare la colonna a più di 8.000 G per 30 secondi ed eliminare il flusso.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio al campione e centrifugare nuovamente. Centrifugare la provetta vuota per un minuto a più di 8.000 G.Infine, aggiungere alla colonna da 30 a 50 microlitri di acqua priva di nucleasi. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, centrifugare nuovamente la colonna a velocità superiori a 8.000 G per cinque minuti.
È stata osservata una significativa riduzione delle dimensioni delle cellule e il restringimento delle cellule duttili in un mezzo acido rispetto alle cellule mantenute in un mezzo normale. I cambiamenti più pronunciati nella morte cellulare si sono verificati dopo sei ore di incubazione con un'ulteriore diminuzione della conta cellulare e segni di stress cellulare a 22 ore. Il numero di geni sovraregolati era più alto a pH 6,5 con 148 geni, seguito da pH sette con 109 geni e pH 6 con 90 geni.
I geni sottoregolati erano meno con 20 a pH sei, 14 a pH 6,5 e 23 a pH sette. Tre oncogeni, LCK, FGR e ASAP 3, sono stati sovraregolati in tutti i livelli di pH testati, suggerendo un ruolo nella proliferazione cellulare in condizioni acide.
