Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы агрегировать и заключать ячейки в полутвердую матрицу. Встроенные клеточные агрегаты могут быть использованы в трехмерной культуре in vitro или в качестве средства для экспериментов по трансплантации in vivo. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует простую методологию и оборудование для достижения агрегации клеток.
Он также может быть применен к различным типам ячеек и чисел. Этот метод выявил специфический тип клеток, которые необходимы для регенерации селезенки. Это может открыть дополнительные регуляторы регенерации тканей селезенки или послужить платформой для более широких исследований в области тканевой инженерии.
Начните с предварительного охлаждения коробки с наконечником для дозатора объемом 200 микролитров в морозильной камере с температурой минус 20 градусов по Цельсию. Затем погрузите Parafilm в 80%-ный этанол на 10 минут, а затем промойте 10 минут в PBS. Чтобы приготовить клеточный раствор, аликвотируйте нужное количество клеток в коническую пробирку объемом 14 миллилитров.
Центрифугируйте клетки при температуре 200 г и температуре 4 градуса Цельсия в течение 5 минут. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 20 микролитров объема. Затем клеточная гранула может быть ресуспендирована в оставшемся объеме надосадочной жидкости.
С помощью предварительно охлажденного наконечника пипетки отсосите 2 микролитра ледяного Матригеля. Осторожно поверните и извлеките, чтобы извлечь наконечник пипетки. Натяните предварительно стерилизованную полоску Parafilm и поместите ее на конец наконечника пипетки, стараясь не проткнуть пленку.
Продолжайте оборачивать парапленку сбоку, чтобы убедиться, что наконечник запечатан. Затем аккуратно нанесите клеточный раствор на Matrigel. Оставьте наконечник пипетки на льду и подготовьте коническую пробирку объемом 14 миллилитров с помещенной внутрь кластерной пробиркой объемом 1,2 миллилитра.
Затем наконечник пипетки можно вставить внутрь вложенной пробирки и центрифугировать при температуре 400 г и температуре 4 градуса Цельсия в течение 5 минут. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Трубку можно поместить на лед до тех пор, пока она не понадобится.
Осторожно извлеките Parafilm из наконечника пипетки, затем вставьте тонкий проволочный поршень и вытолкните пробку Matrigel в питательную среду для тканей. Агрегированные клетки можно культивировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Сбрейте шерсть с помощью электрических машинок для стрижки и промокните кожу 80%-ным этанолом.
Сделайте двухсантиметровый разрез на коже перпендикулярно позвоночнику, и обнажите стенку брюшины. Затем делается второй, меньший разрез в стенке брюшины над почкой. Надавливайте и экстериоризируйте почку.
Следите за тем, чтобы почка оставалась влажной, регулярно нанося стерильный PBS. Сожмите капсулу почки с помощью пары ультратонких щипцов и с помощью второй пары осторожно разорвите в противоположных направлениях. Аккуратно отделите мембрану капсулы от паренхимы почки.
Приподнимите капсулу почки одной парой щипцов и медленно проденьте наконечник пипетки через отверстие. Осторожно вставьте проволочный поршень в наконечник пипетки и выньте пробку Matrigel. Смочите почку PBS и реинтернализируйте в брюшную полость.
Закройте стенку брюшины швами 5-O-Vicryl и закройте разрез кожи с помощью аппликатора AutoClip и двух 9-миллиметровых зажимов для раны. Ключевым этапом в этом протоколе является агрегация ячеек в полутвердой матрице. Позиционирование среднего слоя достигается за счет оптимальных скоростей центрифугирования.
Более высокие скорости продвигают клетки к самому кончику пипетки, в то время как недостаточные скорости препятствуют перемещению клеток через матрицу. После затвердевания конструкцию Matrigel можно извлечь из наконечника пипетки. Стромальные конструкции селезенки, культивируемые in vitro, образуют трехмерные сферические органоидные структуры.
Органоиды имеют неполую структуру с клетками, присутствующими по всему диаметру ткани. Они состоят из трех широких клеточных популяций, включая лейкоциты, эритроциты, а также негемопоэтические стромальные и эндотелиальные клетки. Конструкты также могут быть пересажены под капсулу почки для исследования регенерации тканей.
Через четыре недели можно наблюдать организованную структуру ткани селезенки, включая центральные артериолы, В-клеточные фолликулы, фибробластические ретикулярные клетки, миелоидные клетки красной пульпы, металлофильные макрофаги маргинальной зоны, синусоиды красной пульпы и фолликулярные сети дендритных клеток, Т-клеточную зону, макрофаги красной пульпы и ретикулярные клетки маргинальной зоны. При попытке агрегации и инкапсуляции клеток важно помнить о том, что все материалы должны работать быстро и оставаться на льду. Наиболее важным этапом трансплантации является изгнание пробки Матригеля при извлечении кончика пипетки из почки.
Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проколоть мембрану капсулы или не разорвать паренхиму почки. Этот протокол был использован для изучения требований к двум популяциям стромальных клеток в регенерации ткани селезенки. В этом репрезентативном эксперименте только агрегаты, обедненные тромбоцитарными рецептор-бета-положительными MAdCAM-отрицательными клетками, не смогли инициировать рост тканей, что позволяет предположить, что эта конкретная популяция клеток необходима для регенерации селезенки.
