המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לצבור ולעטוף תאים בתוך מטריצה מוצקה למחצה. לאחר מכן ניתן להשתמש בצברי תאים משובצים במורד הזרם בתרבית תלת-ממדית במבחנה, או ככלי לניסויי השתלות in vivo. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת במתודולוגיה פשוטה וציוד כדי להשיג צבירת תאים.
ניתן להחיל אותו גם על מגוון סוגי תאים ומספרים. טכניקה זו חשפה סוג תא ספציפי הנדרש לטחול להתחדש. זה יכול לחשוף רגולטורים נוספים של התחדשות רקמת הטחול, או לשמש פלטפורמה למחקרים רחבים יותר בהנדסת רקמות.
התחילו בקירור מראש של קופסת פיפטה 200 מיקרוליטר בתוך מקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש לטבול את Parafilm באתנול 80% למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף 10 דקות ב-PBS. כדי להכין את תמיסת התא, aliquot את מספר התא הרצוי לתוך צינור חרוטי 14 מיליליטר.
צנטריפוגה את התאים ב 200 גרם ו 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. ואז בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כ 20 מיקרוליטר של נפח מאחור. לאחר מכן ניתן להשהות מחדש את כדורית התא בנפח הסופרנאטנטי שנותר.
בעזרת קצה פיפטה מצונן מראש, שואפים 2 מיקרוליטר של מטריג'ל קר כקרח. סובבו והוציאו בעדינות כדי להסיר את קצה הפיפטה. מותחים רצועה מעוקרת מראש של פרפילם ומניחים אותה על קצה קצה הפיפטה, תוך הקפדה שלא לנקב את הסרט.
המשיכו לעטוף את הפרפילם סביב הצד כדי לוודא שהקצה אטום. לאחר מכן שכבה את תמיסת התא בעדינות על Matrigel. השאירו את קצה הפיפט על קרח והכינו צינור חרוטי 14 מיליליטר עם צינור אשכול 1.2 מיליליטר ממוקם בפנים.
לאחר מכן ניתן להכניס את קצה הפיפט לתוך תצורת הצינור המקונן, ולצנטריפוגה במשקל 400 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לדגור על הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ניתן להניח את הצינור על קרח עד לצורך נוסף.
בזהירות להסיר את Parafilm מן קצה פיפטה, ולאחר מכן להכניס בוכנה חוט דק, ולגרש את תקע Matrigel למדיום תרבית רקמות. התאים המצטברים יכולים להיות בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. יש לגלח את הפרווה באמצעות קוצץ חשמלי ולספוג את העור עם 80% אתנול.
בצע חתך של שני סנטימטרים בעור בניצב לעמוד השדרה, וחשף את דופן הצפק. חתך שני קטן יותר נעשה אז בקיר הצפק מעל הכליה. להפעיל לחץ ו outize הכליה.
ודא שהכליה נשמרת לחה על ידי יישום PBS סטרילי באופן קבוע. צבטו את כמוסת הכליה עם זוג מלקחיים עדינים במיוחד, ובעזרת זוג שני, קרעו בעדינות בכיוונים מנוגדים. בזהירות להפריד את קרום הקפסולה מן parenchyma הכליות.
הרימו את כמוסת הכליה עם זוג מלקחיים אחד והחליקו באיטיות את קצה הפיפט דרך הפתח. הכנס בעדינות בוכנה חוט לקצה פיפטה וגרש את תקע המטריגל. להרטיב את הכליה עם PBS ולהפנים מחדש לתוך חלל הצפק.
סגור את דופן הצפק עם תפרים 5-O-Vicryl, וסגור את החתך בעור באמצעות יישום AutoClip ושני קליפסים לפצע 9 מ"מ. שלב מפתח בפרוטוקול זה הוא צבירת תאים בתוך מטריצה מוצקה למחצה. מיקום שכבה אמצעית מושג באמצעות מהירויות צנטריפוגה אופטימליות.
מהירויות גבוהות יותר מניעות תאים עד קצה הפיפטה, בעוד שמהירויות לא מספיקות אוסרות על תנועת תאים דרך המטריצה. לאחר ההתמצקות, ניתן להוציא את מבנה המטריגל מקצה הפיפטה. מבני סטרומה של טחול אשר מתורבתים במבחנה יוצרים מבנים אורגנואידים כדוריים תלת ממדיים.
אורגנואידים מציגים מבנה לא חלול עם תאים נוכחים לאורך כל קוטר הרקמה. הם מורכבים משלוש אוכלוסיות תאים רחבות, כולל תאי דם לבנים, תאי דם אדומים ותאי סטרומה ואנדותל שאינם המופויאטיים. מבנים יכולים גם להיות מושתלים מתחת לכמוסת הכליה למחקרי התחדשות רקמות.
לאחר ארבעה שבועות ניתן להבחין במבנה מסודר של רקמת הטחול, כולל עורקים מרכזיים, זקיקי תאי B, תאים רשתית פיברובלסטיים, תאים מיאלואידים של מוך השן האדום, מקרופאגים מטלופיליים באזור השוליים, סינוסיואידים של מוך השן האדום ורשתות תאים דנדריטיים פוליקולריים, אזור תאי T, מקרופאגים של מוך השן האדום ותאים רשתית באזור השוליים. בעת ניסיון צבירת תאים ואנקפסולציה, חשוב לזכור לעבוד במהירות ולשמור את כל החומרים על קרח. השלב החשוב ביותר להשתלות הוא הוצאת תקע המטריגל תוך משיכת קצה הפיפטה מהכליה.
יש להקפיד לא לנקב את קרום הקפסולה או לקרוע את פרנכימה בכליות. פרוטוקול זה שימש לחקר הדרישות לשתי אוכלוסיות תאי סטרומה בהתחדשות רקמת הטחול. בניסוי מייצג זה, רק צברים שהתרוקנו מתאים שליליים MAdCAM חיוביים לגורם גדילה שמקורם בטסיות דם לא הצליחו ליזום צמיחת רקמות, דבר המצביע על כך שאוכלוסיית תאים מסוימת זו חיונית להתחדשות הטחול.
