Транскриптомный анализ отдельных клеток или типов клеток может обнаружить тонкое различие в экспрессии генов, замаскированное гетерогенностью, что является мощным инструментом для раскрытия сложных внутриклеточных регуляторных механизмов. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток с последующим анализом RN-seq может быть выполнена как в режиме одиночной ячейки, так и в режиме объемного типа клетки с высокой чувствительностью обнаружения транскрипта и совместимостью с другими мультиомными подходами. Начинающим пользователям этого протокола необходимо обратить внимание на некоторые этапы сортировки протопластов и подготовки библиотеки RNA-seq.
Вместе с Цзюнь Чжаном доктор Ронгронг Се, постдок в нашей лаборатории, поможет в демонстрации процедуры. Для начала поместите семена дикого типа Arabidopsis thaliana и флуоресцентного маркера в 20% отбеливатель и инкубируйте с помощью вращающегося инкубатора при комнатной температуре в течение 15 минут для стерилизации семян. Во время работы на стерильной скамье промойте семена три-пять раз в двойной дистиллированной воде.
Положите семена дикорастущего типа и репортерной линии на среду MS половинной прочности с массой 0,8% на объем. Стратифицируйте растения в течение двух дней при четырех градусах тепла. Затем выращивайте их вертикально в течение пяти дней при температуре 23 градуса Цельсия при 16-часовом световом и 18-часовом темном циклах.
Осторожно разморозьте протопластические растворы, называемые раствором А и раствором В, на льду перед экспериментом. Срежьте корни с растений с помощью чистого лезвия или ножниц и измельчите корни примерно на 0,5-сантиметровые кусочки. Погрузите измельченные корни в 1,5 миллилитра раствора B с последующим аккуратным вращением при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов.
Отфильтруйте полученные корневые протопласты через сетку ситечка 40 микрон и промойте сетку одним-двумя миллилитрами раствора А.Центрифугируйте комбинированные фильтраты при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, ресуспендируйте гранулу клетки в 500-600 микролитрах раствора А и немедленно поместите ее на лед. Для сортировки клеток перенесите ресуспендированный клеточный раствор в новую пятимиллилитровую пробирку.
Заполните резервуар для жидкости оболочки и проверьте резервуар для отходов. Затем включите камеру сортировки клеток, активируемую флуоресценцией, или машину FACS. Выполните этапы настройки прибора и автоматической калибровки на сортировщике.
Выберите каналы флуоресценции и используйте растение дикорастущего типа без флуоресценции в качестве базового контроля. Отрегулируйте сортировочный затвор в зависимости от интенсивности флуоресценции и синглетов прямого и бокового рассеяния. После добавления 500 микролитров раствора А в 1,5-миллилитровую пробирку для сбора приступают к сортировке и собирают от 2 000 до 3 000 клеток в пробирке.
После сортировки сразу же поместите образцы на лед. Центрифугируйте сборную пробирку, содержащую клетки, при температуре 300 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Возьмите два микролитра отсортированных клеток и проверьте наличие флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа.
Храните отсортированные ячейки при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если не использовать их немедленно. Для сортировки индекса одной ячейки поместите 96-луночную пластину с мембраной в адаптер. Откалибруйте положение пластины так, чтобы капля попадала в центральное отверстие пластины.
Снимите мембрану с 96-луночной пластины и поместите 96-луночную пластину в адаптер. Выберите режим сортировки по одной ячейке при сортировке. Введите целевое количество отсортированных ячеек как одну и начните сортировку.
Перед началом эксперимента очистите стенд обеззараживающим средством для поверхностей и 75% этанолом. Используйте все оборудование только для подготовки библиотеки секвенирования. Добавив в отсортированный образец один микролитр свежеприготовленной смеси А, измельчите ее стерильным пестиком.
Используя воду, свободную от РНК, доведите объем до 14 микролитров. Затем переложите каждый образец в тонкостенную пробирку для ПЦР объемом 0,2 миллилитра. Затем приготовьте смесь B. Добавьте 4,4 микролитра смеси B в каждую пробирку для ПЦР, содержащую образцы, и перемешайте путем щадящего пипетирования.
Инкубируйте образцы при температуре 72 градуса Цельсия в течение трех минут. После инкубации немедленно поместите образцы на лед, чтобы гибридизировать олиго dT с поли-А-хвостом. Готовят реакционную смесь обратной транскрипции или смесь С в 21,6 мкл ее в каждую пробирку, содержащую образцы.
Подвергните образцы реакции обратной транскрипции в обычном приборе ПЦР в соответствии с программой обратной транскрипции. Добавьте 40,8 микролитра свежеприготовленной реакционной смеси предварительного усиления или смеси D к продукту реакции обратной транскрипции и запустите программу предварительной амплификации. Цикл амплификации можно определить с помощью количественной ПЦР, когда реакция только входит в экспоненциальную фазу.
Чтобы очистить продукты реакции предварительной амплификации, перенесите предварительно амплифицированные продукты из пробирки для ПЦР в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 48 микролитров шариков AMPure XP в каждый образец и аккуратно перемешайте пипеткой перед инкубацией. Поместите 1,5-миллилитровые пробирки с образцами и шариками на подставку для магнитной сепарации на пять минут.
Аккуратно сбрасывайте надосадочную жидкость с образцов, не повреждая бусины. После ресуспендирования их в 200 микролитрах 80% этанола поместите их на подставку для магнитной сепарации еще на три минуты. После удаления надосадочной жидкости, содержащей этанол, высушите образцы на воздухе в пробирке в течение 10 минут.
Ресуспендируйте шарики в 20 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите их на подставку для магнитной сепарации на пять минут. С помощью пипетки перелейте 18 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Наконец, следуйте шагам, описанным в тексте, чтобы охарактеризовать предварительную библиотеку, а затем построение, очистку и количественную оценку библиотеки. Флуоресцентные линии маркеров Arabidopsis thaliana были разработаны путем слияния флуоресцентных белков с генами, экспрессируемыми специфически в типах клеток-мишеней, или с использованием линий-ловушек энхансеров. Флуоресцентно-специфические маркированные протопласты были успешно отсортированы по интенсивности флуоресценции и синглетам прямого рассеяния и бокового рассеяния.
Отсортированные клетки визуализировали с помощью светлого поля и флуоресцентной визуализации. Показаны репрезентативные результаты библиотеки секвенирования РНК, содержащей около 2 000 клеток перицикла полюсов ксилемы, первичных клеток боковых корней, клеток энтодермы или коры головного мозга и клеток бокового корня. Библиотека небольшого размера с пиками праймера или адаптера димера все еще может быть секвенирована после выбора размера.
Библиотека с ненормальным распределением по размерам указывает на неудачную подготовку библиотеки. Были проанализированы паттерны экспрессии генов. Гены, обогащенные любым из четырех типов корневых клеток, были сгруппированы и изображены на тепловой карте, показывающей специфичность экспрессии генов среди различных типов клеток.
Высокое качество и чистота клеток-мишеней за счет правильного стробирования и сортировки, а также предотвращения деградации РНК являются ключом к успешному построению библиотеки. Для RNA-seq в режиме одной клетки недавно сообщалось о нескольких методах, интегрированных с уникальным молекулярным идентификатором, что значительно улучшило производительность.
