L’analyse du transcriptome sur une seule cellule ou des types de cellules peut détecter la différence subtile d’expression génique masquée par l’hétérogénéité, ce qui est un outil puissant pour découvrir les mécanismes de régulation intracellulaires élaborés. Le tri cellulaire activé par fluorescence suivi d’une analyse RN-seq peut être effectué en mode cellule unique ou en vrac avec une sensibilité de détection de transcrit élevée et une compatibilité avec d’autres approches multi-omiques. Les nouveaux utilisateurs de ce protocole doivent prêter attention à certaines étapes du tri des protoplastes et de la préparation de la bibliothèque RNA-seq.
Avec Jun Zhang, le Dr Rongrong Xie, post-doctorant dans notre laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour commencer, mettez les graines de type sauvage et de lignée de marqueurs fluorescents d’Arabidopsis thaliana dans de l’eau de Javel à 20% et incuber à l’aide d’un incubateur rotatif à température ambiante pendant 15 minutes pour stériliser les graines. Tout en travaillant sur un banc stérile, rincer les graines trois à cinq fois dans de l’eau distillée double.
Écôler les graines de la lignée sauvage et reporter sur un milieu MS à demi-concentration avec une gélose de 0,8 % en poids par volume. Stratifier les plantes pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Ensuite, cultivez-les verticalement pendant cinq jours à 23 degrés Celsius sous des cycles de lumière de 16 heures et d’obscurité de 18 heures.
Décongeler doucement les solutions protoplastiques appelées solution A et solution B sur de la glace avant l’expérience. Coupez les racines des plantes à l’aide d’une lame propre ou de ciseaux et coupez les racines en morceaux d’environ 0,5 centimètre. Immerger les racines hachées dans 1,5 millilitre de solution B suivie d’une rotation douce à température ambiante pendant 1,5 à 2 heures.
Filtrer les protoplastes racinaires obtenus à travers un filet de crépine de 40 microns et rincer le filet avec un à deux millilitres de solution A.Centrifuger les filtrats combinés à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille de cellule dans 500 à 600 microlitres de solution A et la placer immédiatement sur de la glace. Pour le tri des cellules, transférer la solution cellulaire remise en suspension dans un nouveau tube à essai de cinq millilitres.
Remplissez le réservoir de liquide de gaine et vérifiez le réservoir de déchets. Allumez ensuite la machine de tri cellulaire activée par fluorescence ou FACS. Effectuez les étapes de configuration et d’auto-étalonnage de l’instrument sur le trieur.
Sélectionnez les canaux de fluorescence et utilisez une plante de type sauvage sans fluorescence comme témoin de base. Ajustez la porte de tri en fonction de l’intensité de fluorescence et des singlets de diffusion vers l’avant et à diffusion latérale. Après avoir ajouté 500 microlitres de solution A dans un tube de collecte de 1,5 millilitre, commencez à trier et collectez 2 000 à 3 000 cellules par tube.
Après le tri, placez immédiatement les échantillons sur de la glace. Centrifuger le tube collecteur contenant les cellules à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Prenez deux microlitres de cellules triées et vérifiez la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence.
Conservez les cellules triées à moins 80 degrés Celsius si elles ne sont pas utilisées immédiatement. Pour le tri de l’index unicellulaire, placez la plaque de 96 puits avec membrane dans l’adaptateur. Calibrer la position de la plaque de sorte que la gouttelette tombe dans le trou central de la plaque.
Retirez la membrane de la plaque de 96 puits et placez la plaque de 96 puits dans l’adaptateur. Sélectionnez le mode de tri d’une seule cellule lors du tri. Entrez le nombre cible de cellules triées en une seule et commencez le tri.
Avant de commencer l’expérience, nettoyez le banc avec un décontaminant de surface et de l’éthanol à 75%. Utilisez tout l’équipement uniquement pour la préparation de la bibliothèque de séquençage. Après avoir ajouté un microlitre de mélange A fraîchement préparé dans l’échantillon trié, broyez-le avec un pilon stérile.
En utilisant de l’eau libre d’ARNase, porter le volume à 14 microlitres. Transférez ensuite chaque échantillon dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 millilitre. Ajouter ensuite le mélange B.Ajouter 4,4 microlitres dans le mélange B à chaque tube de PCR contenant des échantillons et mélanger par pipetage doux.
Incuber les échantillons à 72 degrés Celsius pendant trois minutes. Après l’incubation, mettre immédiatement les échantillons sur de la glace pour hybrider l’oligo dT à la queue poly-A. Préparer le mélange réactionnel de transcription inverse ou le mélange C dans 21,6 microlitres de celui-ci dans chaque tube contenant les échantillons.
Soumettre les échantillons à une réaction de transcription inverse dans un instrument de PCR commun selon le programme de transcription inverse. Ajouter 40,8 microlitres du mélange réactionnel de préamplification fraîchement préparé ou du mélange D au produit de réaction de transcription inverse et exécuter le programme de préamplification. Le cycle d’amplification peut être déterminé par PCR quantitative lorsque la réaction entre dans la phase exponentielle.
Pour purifier les produits de réaction de préamplification, transférer les produits préamplifiés d’un tube PCR vers un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 48 microlitres de billes AMPure XP dans chaque échantillon et mélanger délicatement par pipetage avant incubation. Placez les tubes de 1,5 millilitre contenant les échantillons et les perles sur un support de séparation magnétique pendant cinq minutes.
Jetez soigneusement le surnageant des échantillons sans déranger les perles. Après les avoir remis en suspension dans 200 microlitres d’éthanol à 80%, placez-les sur le support de séparation magnétique pendant trois minutes supplémentaires. Après avoir éliminé le surnageant contenant de l’éthanol, sécher les échantillons à l’air libre dans un tube pendant 10 minutes.
Remettez les billes en suspension dans 20 microlitres d’eau sans nucléase et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, placez-les sur le support de séparation magnétique pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, transférer 18 microlitres du surnageant de chaque tube dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Enfin, suivez les étapes décrites dans le texte pour caractériser la pré-bibliothèque, suivies de la construction, de la purification et de la quantification de la bibliothèque. Les lignées de marqueurs fluorescents d’Arabidopsis thaliana ont été développées en fusionnant des protéines fluorescentes avec des gènes exprimés spécifiquement dans les types de cellules cibles ou en utilisant des lignes de piégeage d’amplificateur. Les protoplastes marqués spécifiques à la fluorescence ont été triés avec succès en fonction de l’intensité de fluorescence et des singlets à diffusion vers l’avant et à diffusion latérale.
Les cellules triées ont été visualisées à l’aide de l’imagerie en fond clair et en fluorescence. Les résultats représentatifs de la bibliothèque de séquençage de l’ARN d’environ 2 000 cellules péricycliques xylèmes, cellules primordiales racines latérales, cellules endodermiques ou cortex et cellules de la calotte radiculaire latérale sont présentés. Une bibliothèque de petite taille avec des pics de dimères d’amorce ou d’adaptateur peut toujours être séquencée après la sélection de la taille.
Une bibliothèque avec une distribution de taille anormale indiquait un échec de la préparation de la bibliothèque. Les profils d’expression génique ont été analysés. Les gènes enrichis dans l’un des quatre types de cellules racinaires ont été regroupés et représentés dans une carte thermique montrant la spécificité des expressions géniques parmi les différents types cellulaires.
La haute qualité et la pureté des cellules cibles grâce à un contrôle et à un tri corrects et à la prévention de la dégradation de l’ARN sont essentielles à la construction réussie de la bibliothèque. Pour le séquençage de l’ARN en mode cellule unique, plusieurs méthodes intégrées à l’identifiant moléculaire unique ont été rapportées récemment, ce qui a considérablement amélioré les performances.
