Этот метод может помочь ответить на вопросы в белково-белковом взаимодействии, позволит нам непосредственно обнаружить два белка, расположенных в пределах 10 нанометров друг от друга внутри живой клетки. Основным преимуществом данной методики является то, что она проста и легка в воспроизведении. Это также требует простых материалов, которые доступны во многих современных лабораториях.
Эта мера может быть использована с любой живой тканью или культуральной клеткой, которые переходно распространяются на интересующий белок. Если вы используете эту технику впервые, рекомендуется сначала использовать положительный контроль и отрицательный контроль. Для начала посейте семена Nicotiana benthamiana в горшок, содержащий влажную почву высокой плотности.
Храните посаженные семена в камере роста, установленной при 23 градусах Цельсия. Когда диаметр эуфилла достигнет от 0,3 до 0,5 сантиметра, перенесите рассаду в более крупные горшки и дайте им расти в той же камере с теми же параметрами. Затем подготовьте бактериальные клетки к агроинфильтрации, инокулируя каждую колонию агробактерий, содержащую конструкции FRET в пяти миллилитрах среды LB, дополненной антибиотиками и 150 микромолярным ацетозиргиноном.
Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 28 градусов по Цельсию. После инкубации центрифугируют клетки при 3000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Повторное суспендирование клеток в буфере агроинфильтрации до OD 600, равного 0,5.
Для двойной конструкции агроинфильтрации объедините повторно суспендированные ячейки в соотношении один к одному объему с ячейками, содержащими соответствующие конструкции. Инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение 30 минут до одного часа. Для выполнения агроинфильтрации загрузите бактериальную культуру в один миллилитр безигольчатый шприц.
Осторожно, но твердо прижмите сопло шприца к абаксиальной стороне полностью расширенных листьев Nicotiana benthamiana, удерживая лист пальцем в перчатке на адаксиальной стороне. Инфильтрируйте до четырех пятен на листе, три листа на растение и два или три растения на каждую бактериальную культуру. Поддерживайте агроинфильтрованные растения в той же камере роста в тех же условиях, которые описаны ранее, в течение 24-36 часов.
После 24-36 часов инфильтрации используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать каждый агроинфильтрованный лист на небольшие кусочки по два на четыре миллиметра между жилками. Поместите кусочки листьев на стеклянную горку, а абаксиальная поверхность листа обращена вверх. Поместите каплю воды на кусочки листьев и накройте их покровным стеклом.
Слегка постучите по защитному стеклу, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем включите микроскоп и лазер. Поместите затвор в держатель сцены микроскопа.
Чтобы настроить параметры для SE-FRET, откройте инструмент многомерного сбора. Затем устанавливают донорский канал для возбуждения и излучения донорского фторхрома GFP при возбуждении лазера 405 нанометров и эмиссионный фильтр на 400-597 нанометров. Установите акцепторный канал для возбуждения и излучения акцептора фторхромового мРФП и лазера возбуждения 561 нанометр и эмиссионный фильтр на 400-597 нанометров.
Установите канал FRET для возбуждения донора и излучения акцепторных фторхромов с помощью 405-нанометрового лазера возбуждения и эмиссионного фильтра от 597 до 617 нанометров. Установите интенсивность возбуждения донора на минимальном уровне, чтобы наблюдать FRET, избегая фотоотбеливания. Возбуждайте донора и сканируйте клетки, содержащие ожидаемый флуоресцентный сигнал акцептора.
Выберите область, содержащую интересующий флуоресцентный сигнал. Получите последовательность изображений SE-FRET, нажав кнопку привязки. Чтобы настроить параметры для AB-FRET, используйте параметры донорского и акцепторного канала, заданные для SE-FRET, но отключите канал FRET.
Затем подготовьтесь к установке параметров фотоотбеливания акцептора mRFP. Убедитесь, что отбеливание начинается после пяти изображений. Позвольте 200 итераций для каждой области отбеливания.
Сохраняйте 100% интенсивность лазера на уровне 561 нанометра. Поддерживайте продолжительность отбеливания 45 секунд. Обеспечьте скорость сканирования 512 на 512 пикселей при 400 герцах.
Найдите и нарисуйте область ячейки, подлежащей отбеливанию, и активируйте отбеливание, нажав кнопку запуска эксперимента. В случае положительного контроля, после пяти снимков, начинается отбеливание, и интересующая область становится зеленой. Проверьте среднюю рентабельность инвестиций, чтобы убедиться, что интенсивность mRFP уменьшается, в то время как интенсивность GFP увеличивается.
В качестве альтернативы, проверьте макет, который показывает, что mRFP отбеливался, а GFP увеличивался. Для анализа данных SE-FRET используйте программное обеспечение ImageJ. Откройте изображения и создайте стопку только донора.
Сохраните изображения в восьми битах в виде TIF-файла. Аналогично создайте стек только для акцептора, а затем создайте комбинированный стек донора и акцептора. Затем используйте плагин PixFRET для создания изображений эффективности SE-FRET.
Откройте созданные стеки и сгенерируйте исправленные изображения FRET после вычитания спектрального выпуска. Представьте изображение как псевдоцветное изображение. Чтобы проанализировать данные AB-FRET, рассчитайте процент AB-FRET как процент увеличения излучения GFP после фотоотбеливания mRFP с использованием этой формулы.
Специфическое белково-белковое взаимодействие гистоновой деубиквитиназы OTLD1 с транскрипционным фактором LSH10 изучали компанией SE-FRET. Ядра клеток были одновременно записаны в трех каналах, и была сгенерирована псевдоцветная шкала для изображения эффективности SE-FRET. Переход от синего к красному соответствует повышению эффективности FRET и белково-белковой близости.
Интенсивность SE-FRET после коэкспрессии LSH10 и OTLD1 была сопоставима с интенсивностью, наблюдаемой для положительного контрольного mRFP-GFP. Se-FRET не наблюдался в отрицательных контрольных группах, таких как коэкспрессия OTLD1, mRFP и LSH4-GFP, или свободные mRFP и LSH10-GFP. Изображения AB-FRET показали, что коэкспрессия LSH10-GFP и OTLD1-mRFP привела к увеличению флуоресценции донора GFP после того, как акцептор RFP был фотоотбелен.
Аналогичное увеличение донорской флуоресценции наблюдалось в положительном контроле, но не в отрицательном контроле, когда акцепторная флуоресценция была инактивирована. Количественный анализ данных AB-FRET продемонстрировал статистически значимое увеличение донорской флуоресценции после коэкспрессии LSH10 и OTLD1. Положительный контроль произвел процент AB-FRET примерно 30%, тогда как отрицательный контроль не дал ни одного.
SE-FRET и AB-FRET показали сигнал в ядре клетки, согласующийся с субклеточной локализацией ферментных комплексов, модифицирующих гистоны транскрипционного фактора, а также с нуклеоцитоплазматической природой белков GFP-MRFP. Самое важное, что нужно помнить, прежде чем следовать протоколу, - это протестировать правильную экспресс-пару донора-акцептора в зависимости от модели конфокальной наноскопии. После запуска и выполнения итерации для получения результатов требуется всего 24-36 часов.
После просмотра этого видео нужно хорошо понять, как использовать технику FRET для изучения белково-белкового взаимодействия.
