يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في تفاعل البروتين والبروتين ، وستسمح لنا بالكشف مباشرة عن بروتينين يقعان على بعد 10 نانومتر من بعضهما البعض داخل الخلية الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسهلة التكاثر. كما يتطلب مواد بسيطة متوفرة في العديد من المختبرات الحديثة.
يمكن استخدام هذا المقياس مع أي نسيج حي أو خلية ثقافة تنتشر بشكل انتقالي عند البروتين محل الاهتمام. إذا كنت تستخدم هذه التقنية لأول مرة ، فمن المستحسن أن تستخدم التحكم الإيجابي والتحكم السلبي لاختبار النظام أولا. للبدء ، زرع بذور Nicotiana benthamiana في وعاء يحتوي على تربة رطبة بكثافة عالية.
احتفظ بالبذور المزروعة في غرفة نمو عند 23 درجة مئوية. عندما يصل قطر euphyll إلى 0.3 إلى 0.5 سم ، انقل الشتلات إلى أواني أكبر واتركها تنمو في نفس الغرفة بنفس المعلمات. بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا البكتيرية للتسلل الزراعي عن طريق تلقيح كل مستعمرة من البكتيريا الزراعية التي تحتوي على تركيبات FRET في خمسة ملليلتر من وسط LB المكمل بالمضادات الحيوية و 150 ميكرومولار أسيتوسيرينجون.
احتضان الثقافة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 3،000 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي إلى OD 600 من 0.5.
بالنسبة للتسلل الزراعي المزدوج البناء ، ادمج الخلايا المعاد تعليقها بنسبة حجم واحد إلى واحد مع الخلايا التي تحتوي على التركيبات المناسبة. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. لأداء التسلل الزراعي ، قم بتحميل الثقافة البكتيرية في حقنة عديمة الإبر ملليلتر.
برفق ولكن بحزم ، اضغط على فوهة المحقنة على الجانب المحوري من أوراق نيكوتيانا بينثاميانا الموسعة بالكامل أثناء إمساك الورقة بإصبع قفاز على الجانب المحوري. تسلل ما يصل إلى أربع بقع على ورقة ، وثلاث أوراق لكل نبات ، واثنين أو ثلاثة نباتات لكل مزرعة بكتيرية. الحفاظ على النباتات الزراعية المتسللة في نفس غرفة النمو في ظل نفس الظروف كما هو موضح سابقا لمدة 24 إلى 36 ساعة.
بعد 24 إلى 36 ساعة من التسلل ، استخدم شفرة حلاقة لقطع كل ورقة زراعية إلى قطع صغيرة من اثنين في أربعة ملليمترات بين الأوردة. ضع قطع الأوراق على شريحة زجاجية بحيث يكون سطح الورقة المحوري متجها لأعلى. ضع قطرة ماء على قطع الأوراق وقم بتغطيتها بزجاج الغطاء.
اضغط قليلا على زجاج الغطاء لإزالة فقاعات الهواء. ثم قم بتشغيل المجهر والليزر. ضع الشريحة في حامل مرحلة المجهر.
لإعداد معلمات SE-FRET ، افتح أداة الاستحواذ متعددة الأبعاد. ثم اضبط قناة المتبرع لإثارة وانبعاث الفلوروكروم GFP المانح بليزر إثارة يبلغ 405 نانومتر ، ومرشح انبعاث عند 400 إلى 597 نانومتر. اضبط قناة المستقبل لإثارة وانبعاث متقبل الفلوروكروم mRFP وليزر إثارة يبلغ 561 نانومتر ومرشح انبعاث من 400 إلى 597 نانومتر.
اضبط قناة FRET لإثارة المتبرع وانبعاث الفلوروكرومات المتقبلة باستخدام ليزر إثارة 405 نانومتر ومرشح انبعاث 597 إلى 617 نانومتر. اضبط شدة إثارة المتبرع عند الحد الأدنى لمراقبة FRET مع تجنب التبييض الضوئي. إثارة المتبرع والمسح بحثا عن الخلايا التي تحتوي على إشارة التألق المتوقعة من المتقبل.
حدد المنطقة التي تحتوي على إشارة التألق محل الاهتمام. احصل على تسلسل صور SE-FRET بالضغط على زر المفاجئة. لإعداد معلمات AB-FRET ، استخدم معلمات قناة المتبرع والمتقبل المحددة ل SE-FRET ، ولكن قم بإيقاف تشغيل قناة FRET.
ثم استعد لتعيين معلمات التبييض الضوئي ل mRFP المتقبل. تأكد من أن التبييض يبدأ بعد خمس صور. السماح ب 200 تكرار لكل منطقة مبيض.
حافظ على كثافة الليزر بنسبة 100٪ عند 561 نانومتر. حافظ على مدة التبييض 45 ثانية. تأكد من سرعة مسح ضوئي تبلغ 512 × 512 بكسل عند 400 هرتز.
ابحث وارسم منطقة الخلية المراد تبييضها ، وقم بتنشيط التبييض بالضغط على زر بدء التجربة. في حالة التحكم الإيجابي ، بعد خمس صور ، يبدأ التبييض ، وتتحول منطقة الاهتمام إلى اللون الأخضر. تحقق من متوسط عائد الاستثمار للتأكد من أن كثافة mRFP تتناقص بينما تزداد كثافة GFP.
بدلا من ذلك ، تحقق من التخطيط ، مما يدل على أن mRFP كان يبيض وأن GFP كان يتزايد. لتحليل بيانات SE-FRET ، استخدم برنامج ImageJ. افتح الصور وأنشئ كومة من المتبرعين فقط.
احفظ الصور في ثمانية بت كملف TIF. وبالمثل ، قم بإنشاء المكدس للمتقبل فقط ، ثم قم بإنشاء مكدس مدمج من المتبرع والمتقبل. بعد ذلك ، استخدم المكون الإضافي PixFRET لإنشاء صور لكفاءة SE-FRET.
افتح الحزم التي تم إنشاؤها ، وقم بإنشاء صور FRET المصححة بعد طرح النزيف الطيفي. قدم الصورة كصورة زائفة. لتحليل بيانات AB-FRET ، احسب النسبة المئوية AB-FRET كنسبة مئوية للزيادة في انبعاثات GFP بعد التبييض الضوئي mRFP باستخدام هذه الصيغة.
تمت دراسة تفاعل البروتين والبروتين المحدد لهيستون deubiquitinase OTLD1 مع عامل النسخ LSH10 بواسطة SE-FRET. تم تسجيل نوى الخلية في وقت واحد في ثلاث قنوات ، وتم إنشاء مقياس لون زائف لتصوير كفاءة SE-FRET. يتوافق الانتقال من الأزرق إلى الأحمر مع زيادة في كفاءة FRET وقرب البروتين والبروتين.
كانت كثافة SE-FRET بعد التعبير المشترك ل LSH10 و OTLD1 مماثلة لتلك التي لوحظت للتحكم الإيجابي mRFP-GFP. لم يلاحظ أي SE-FRET في الضوابط السلبية مثل التعبير المشترك عن OTLD1 و mRFP و LSH4-GFP أو mRFP الحر و LSH10-GFP. أظهرت صور AB-FRET أن التعبير المشترك ل LSH10-GFP و OTLD1-mRFP أدى إلى زيادة مضان مانحي GFP بعد أن تم تبييض متقبل طلب تقديم العروض ضوئيا.
لوحظت زيادة مماثلة في مضان المانحين في السيطرة الإيجابية ، ولكن ليس في الضوابط السلبية عندما تم تعطيل مضان المستقبل. أظهر التحليل الكمي لبيانات AB-FRET زيادة ذات دلالة إحصائية في مضان المانحين بعد التعبير المشترك LSH10 و OTLD1. أنتجت السيطرة الإيجابية نسبة AB-FRET بنسبة 30٪ تقريبا بينما لم تنتج الضوابط السلبية أي شيء.
أظهر SE-FRET و AB-FRET إشارة في نواة الخلية تتفق مع التوطين تحت الخلوي لمركب الإنزيم المعدل لعامل النسخ بالإضافة إلى الطبيعة النووية لبروتينات GFP-MRFP. أهم شيء يجب تذكره قبل اتباع البروتوكول هو الاختبار في الزوج السريع لمستقبل المتبرع الصحيح اعتمادا على نموذج الفحص النانوي متحد البؤر. بعد التشغيل والقيام بالتكرار ، يستغرق الأمر من 24 إلى 36 ساعة فقط لتلقي النتائج.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدى المرء فهم جيد لكيفية استخدام تقنية FRET لدراسة تفاعل البروتين والبروتين.
