Этот протокол является очень полезным инструментом для предварительной общей оценки токсичности различных типов образцов, таких как экстракты, фракции и соединения из различных природных или синтетических источников. Основным преимуществом нашего протокола является то, что он очень прост и дешев и может использоваться на многих образцах одновременно. Кроме того, оборудование ручной работы повышает надежность сайта.
На этом этапе техники мы проводим скрининг для отбора образцов на основе их предварительного общего профиля токсичности, которые будут проходить дальнейшие специфические тесты, такие как обширные клеточные линии или даже тесты in vivo. Этот метод в основном используется в области химии лекарственных средств и других продуктов для скрининга биотических образцов. Наш протокол также может быть использован для других видов образцов, таких как наносистемы.
Выполняя впервые, наберитесь терпения, потому что для этого нужны тонкие навыки наблюдения и большое внимание ко всем параметрам, о которых сообщают Марсия Филипе и Вера Иска, аспиранты из нашей лаборатории помогут продемонстрировать эту процедуру. Начните с размещения контейнера в форме воронки в черную опору и поворота воронки в подходящем направлении, чтобы увидеть отметку уровня и кран. Для изготовления миграционного оборудования ручной работы вырежьте верхнюю часть двух 0,5-литровых пластиковых бутылок, чтобы получить окончательную высоту 12 сантиметров.
Создайте отверстие диаметром 1,5 сантиметра с одной стороны и семь сантиметров от дна каждой бутылки и вставьте 13-сантиметровую резиновую трубку между двумя отверстиями. Закройте отверстия горячим клеем и оставьте их сохнуть в течение 15 минут. Положите бутылки на ровную поверхность и наполните их водой, чтобы убедиться, что нет утечки.
Добавьте 28 граммов соли в 800 миллилитров водопроводной воды, чтобы приготовить раствор искусственной соли, или соль креветок в концентрации 35 грамм на литр. Смешайте его с помешивающим стержнем до тех пор, пока вся соль не растворится. Для подготовки образцов растворяют подходящее количество каждого экстракта и соединения диметилсульфоксида, или ДМСО, в конечной концентрации 10 миллиграммов на миллилитр.
Затем разбавляют 10 микролитров каждого образца в новой микроцентрифужной трубке, используя 990 микролитров искусственного физиологического раствора для получения конечной концентрации 0,1 миллиграмма на миллилитр. Под вытяжной вытяжкой в колбе Эрленмейера приготовьте раствор дихромата калия в дистиллированной воде в концентрации одного миллиграмма на миллилитр. Наполните инкубационный сосуд средой до отметки 500 миллилитров и добавьте в солевой раствор одну ложку, или примерно 0,5 грамма цист рассола креветок.
Закройте контейнер. Поместите лампу, направленную прямо на оборудование, и включите ее. Прикрепите систему подачи воздуха к разъему, расположенному поверх оборудования, и включите насос.
Цисты креветок вылупляются в искусственном соляном растворе при энергичной аэрации, непрерывном освещении и стабильной температуре. Через 24-48 часов, когда яйца вылупятся, выключите воздушный насос и подождите, пока науплии не отделятся от пустых ящиков для яиц. Чтобы отделить невылупившиеся яйца от живых науплий, откройте выходной кран на дне и выгрузите содержимое воронки в один из контейнеров контейнера миграционного оборудования ручной работы.
Убедитесь, что раствор, содержащий науплии и остаточные невылупившиеся яйца, находится ниже уровня трубки. Поместите оборудование в инкубатор на четыре часа, затем во вторую емкость добавляют остаточный раствор соли над высотой трубки. Накройте контейнер науплиями и остатками невылупившихся яиц с помощью алюминиевой фольги и поместите лампу на второй контейнер только с солевым раствором.
Рассольные креветки будут притягиваться светом и мигрировать из одного контейнера в другой, что приводит к эффективному разделению между яйцами и живой артемией. Из контейнера для сбора урожая собирают 900 микролитров физиологического раствора, содержащего от 10 до 15 науплий, и помещают раствор в одну лунку из 24 луночных пластин. Все образцы тестируются в четырех экземплярах.
Добавьте 100 микролитров каждого отрицательного элемента управления. Положительный контроль, искусственный раствор соли и каждый из образцов попадают в скважины и инкубируют плиту при освещении в течение 24 часов. Через 24 часа зарегистрируйте количество мертвых личинок в каждой лунке под бинокулярным микроскопом при 12-кратном увеличении.
Добавьте 100 микролитров раствора дихромата калия, чтобы вызвать гибель оставшихся живых личинок, и подождите шесть часов. Подсчитайте общее количество мертвых личинок в каждой лунке под микроскопом и определите коэффициент смертности согласно уравнению, показанному на экране. Выполните все тесты в трех экземплярах и рассчитайте стандартные отклонения.
Наконец, выразите результаты как среднее значение трех независимых экспериментов с внутренними квадрупликатами плюс, минус стандартные отклонения. Структура выбранных соединений, извлеченных из видов Plectranthus и полученных полусинтезом, показана на этом рисунке. На этом изображении показан недавно вылупившийся науплий Артемии Салина, видимый под микроскопом.
Это графическое изображение представляет уровень смертности Artemia Salina после 24 часов воздействия четырех экстрактов метанола вида Plectranthus при 0,1 миллиграмма на миллилитр. Все экстракты были приемлемы с точки зрения общей токсичности с использованием этого анализа. Здесь соль соответствует соляному раствору или заготовке.
Дихромат калия использовался в качестве положительного контроля, а ДМСО использовался в качестве отрицательного контроля. Все протестированные выдержки показали очень обнадеживающие результаты с очень низкими значениями процентов смертности, сопоставимыми с теми, которые были зарегистрированы для пустого и отрицательного контроля. На этом рисунке представлена смертность от артемии Салина после 24 часов воздействия пяти чистых соединений при 0,1 миллиграмма на миллилитр.
Из этих данных видно, что только пять показывает минимальную токсичность, используя этот анализ Нужно помнить три этапа, в частности, вылупление, миграцию и сбор. Следовательно, у нас есть другие креветки, отделенные от и количество для работы. Предварительный участок представляет собой простую и недорогую модель токсичности канала по сравнению с другими участками, такими как клеточная культура или рыба данио.
Кроме того, более дорогие участки цитотоксичности могут быть использованы.
