Este protocolo es una herramienta muy útil para una evaluación preliminar de toxicidad general en diferentes tipos de muestras, tales como extractos, fracciones y compuestos de diferentes fuentes naturales o sintéticas. La principal ventaja de nuestro protocolo es que es muy fácil y barato y se puede utilizar en muchas muestras al mismo tiempo. Además, el equipo hecho a mano mejora la confiabilidad del sitio.
En esta etapa de la técnica, hacemos un cribado para seleccionar las muestras en función de su perfil preliminar de toxicidad general que se someterá a pruebas específicas adicionales, como líneas celulares expansivas o incluso pruebas in vivo. Este método se explota principalmente en los campos de la química de medicamentos y otros productos para analizar muestras bióticas. Nuestro protocolo también se puede utilizar para otros tipos de muestras, como los nanosistemas.
Mientras realiza por primera vez, tenga paciencia porque esto requiere habilidades de observación finas y mucha atención a todos los parámetros informados Marcia Filipe y Vera Isca, los estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio ayudarán a demostrar este procedimiento. Comience colocando el recipiente en forma de embudo en el soporte negro y gire el embudo en una dirección adecuada para ver la marca de nivel y el grifo. Para hacer el equipo de migración hecho a mano cortamos la parte superior de dos botellas de plástico de 0,5 litros para obtener una altura final de 12 centímetros.
Cree un agujero de 1,5 centímetros de diámetro en un lado y siete centímetros desde el fondo de cada botella e inserte un tubo de goma de 13 centímetros entre las dos aberturas. Selle las aberturas con pegamento caliente y déjelas secar durante 15 minutos. Coloque las botellas sobre una superficie plana y llénelas con agua para verificar que no haya fugas.
Agregue 28 gramos de sal a 800 mililitros de agua del grifo para preparar la solución de sal artificial, o sal de camarones en salmuera a una concentración de 35 gramos por litro. Mezclar con una varilla de agitación hasta que toda la sal se disuelva completamente. Para preparar las muestras disolver una cantidad adecuada de cada extracto y compuesto dimetilsulfóxido, o DMSO, a una concentración final de 10 miligramos por mililitro.
Luego diluya 10 microlitros de cada muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga utilizando 990 microlitros de la solución salina artificial para obtener una concentración final de 0.1 miligramos por mililitro. Bajo una campana extractora en un erlenmeyer, preparar una solución de dicromato de potasio en agua destilada a una concentración de un miligramo por mililitro. Llene el recipiente para incubar con el mediano hasta la marca de 500 mililitros y agregue una cuchara, o aproximadamente 0.5 gramos de quistes de camarones de salmuera a la solución salina.
Cierre el contenedor. Coloque una lámpara apuntando directamente hacia el equipo y enciéndalo. Conecte el sistema de suministro de aire al conector colocado en la parte superior del equipo y encienda la bomba.
Los quistes de camarones de salmuera eclosionan en la solución salina artificial bajo aireación vigorosa, iluminación continua y temperatura estable. Después de 24 a 48 horas, cuando los huevos hayan eclosionado, apague la bomba de aire y espere hasta que los nauplios se separen de las cajas de huevos vacías. Para separar los huevos no eclosionados de los nauplios vivos, abra el grifo de salida en la parte inferior y descargue el contenido del embudo en uno de los contenedores del contenedor de equipos de migración hechos a mano.
Asegúrese de que la solución que contiene los nauplios y los huevos residuales no eclosionados esté por debajo del nivel del tubo. Coloque el equipo en la incubadora durante cuatro horas, luego en el segundo recipiente agregue la solución salina residual por encima de la altura del tubo. Cubra el recipiente con nauplios y los huevos residuales no eclosionados con papel de aluminio y coloque la lámpara en el segundo recipiente con solo la solución salina.
Los camarones de salmuera serán atraídos por la luz y migrarán de un contenedor a otro, lo que llevará a una separación eficiente entre los huevos y la artemia viva. Del recipiente de cosecha, recoja 900 microlitros de solución salina que contenga de 10 a 15 nauplios y coloque la solución en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Todas las muestras se analizan en cuadruplicados.
Añadir 100 microlitros de cada control negativo. Control positivo, la solución salina artificial, y cada una de las muestras a los pozos e incubar la placa bajo iluminación durante 24 horas. Después de 24 horas, registrar el número de larvas muertas en cada pocillo bajo un microscopio binocular a 12 aumentos de x.
Agregue 100 microlitros de solución de dicromato de potasio para inducir la muerte de las larvas vivas restantes y espere seis horas. Cuente el total de larvas muertas en cada pocillo bajo un microscopio y determine la tasa de mortalidad de acuerdo con la ecuación que se muestra en la pantalla. Realizar todas las pruebas por triplicado y calcular las desviaciones estándar.
Finalmente, exprese los resultados como la media de tres experimentos independientes, cada uno con cuadruplicados internos más, menos las desviaciones estándar. La estructura de los compuestos seleccionados extraídos de especies de Plectranthus y obtenidos por semisíntesis se muestran en esta figura. Un nauplio recién nacido de Artemia Salina como se ve bajo el microscopio se muestra en esta imagen.
Esta imagen gráfica representa la tasa de mortalidad de Artemia Salina después de 24 horas de exposición a cuatro extractos de metanol de especies de Plectranthus a 0,1 miligramos por mililitro. Todos los extractos fueron aceptables en términos de toxicidad general utilizando este ensayo. Aquí la sal corresponde a la solución salina o en blanco.
El dicromato de potasio se utilizó como control positivo y el DMSO como control negativo. Todos los extractos analizados mostraron resultados muy alentadores con valores muy bajos de porcentajes de mortalidad comparables a los registrados para el blanco y el control negativo. La tasa de mortalidad de Artemia Salina después de 24 horas de exposición a los cinco compuestos puros a 0,1 miligramos por mililitro se presenta en esta figura.
A partir de estos datos, es evidente que solo cinco muestran una toxicidad mínima utilizando este ensayo. Debe recordar tres pasos en particular, eclosión, migración y recolección. En consecuencia, tenemos otros camarones separados y los números con los que trabajar. El sitio preliminar es un modelo simple y de bajo costo de toxicidad de canal en comparación con otros sitios como el cultivo celular o el pez cebra.
Además, los sitios de citotoxicidad más caros pueden ser explotados.
